本發(fā)明涉及基因工程技術領域，可應用于小麥產量育種領域，具體提供了一種小麥莖稈斷裂強度分子標記及其應用。

背景技術：
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小麥是我國第二大糧食作物，全世界1/3以上的人口以小麥為主食。倒伏是小麥生產中普遍存在的問題，倒伏后的小麥，不僅產量降低、收割不便，而且嚴重影響產品質量，造成子粒癟瘦、容重降低、磨粉品質變差、小麥商品性和可制作性能下降，直接影響到優(yōu)質麥的生產與加工。小麥倒伏一般發(fā)生在莖稈基部10％-30％，即莖稈基部第二節(jié)和第三節(jié)，小麥莖稈斷裂強度是小麥自身抗倒性的綜合指標，與莖粗和稈壁厚、節(jié)間密度、莖稈結構特征、莖稈化學成分關系密切。前人對小麥莖稈的形態(tài)學、解剖學和生理學的研究較多，但缺乏遺傳基礎研究。在基因水平解析小麥莖稈斷裂強度的遺傳機理，對利用分子標記輔助選擇和分子設計育種具有重要的意義。

新興的分子標記輔助選擇不受環(huán)境影響，可以進行程序化早代選擇和預測，可顯著提高目標性狀選擇的準確性，對加快小麥產量改良及保障我國糧食安全具有重要的現實意義和理論價值。目前，與小麥莖稈斷裂強度有關的基因鑒定很少，缺乏分子標記輔助選擇的有效標記，主要原因是受到以下兩個方面的限制，一方面：目前多數發(fā)表的莖稈斷裂強度QTLs位點沒有經過育種過程或品種有效性驗證；另一方面，由于單一遺傳群體定位的基因位點，準確度差，而且由于置信區(qū)間大，QTLs過多或存在假陽性QTLs，降低了莖稈斷裂強度分子輔助選擇的實際效率，甚至無法有效應用到小麥育種中。

因此亟需提供一種針對于小麥莖稈斷裂強度的實用性分子標記以利于小麥品質育種。

技術實現要素：

針對現有技術存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種小麥莖稈斷裂強度分子標記，該標記位于小麥4B染色體TDURUM_CONTIG63670_287和IACX557之間，命名為QWQD4B.4-13；通過該分子標記的應用，可以檢測小麥品種或品系中是否具有增大莖稈斷裂強度的QWQD4B.4-13基因位點，以加快抗倒伏小麥品種的選育進程，由于采用了專用的莖稈斷裂強度分子標記，不僅篩選快速精準，不受環(huán)境影響，選擇目標明確，而且節(jié)約了生產成本，大大提高了優(yōu)質小麥品種或品系的選擇效率和質量，提高了QTL檢測的效應和定位精度，開發(fā)了實效性分子標記，研制莖稈斷裂強度分子輔助育種體系，可以程序化應用于育種實踐。

本發(fā)明采用以下技術方案：

一種小麥莖稈斷裂強度分子標記QWQD4B.4-13，該標記位于小麥4B染色體TDURUM_CONTIG63670_287和IACX557之間；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述。

發(fā)明人發(fā)現當小麥中含有該分子標記時，小麥的莖稈斷裂強度增大。

在上述技術的基礎上，通過該分子標記的應用，可以檢測小麥品種或品系中是否含有增大莖稈斷裂強度基因位點QWQD4B.4-13，具體步驟為：

利用特異性引物擴增目標植株的的葉片DNA，獲得721bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，之后利用AluI專一酶酶切后檢測相應片段，如果利用AluI專一酶酶切后依然為721bp的片段，則證明該片段未被切斷，該品種(系)含有莖稈斷裂強度增效基因位點QWQD4B.4-13，如果檢測后為含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2和3所述的兩個片段，則證明該片段已被切斷，該品種(系)不含有莖稈斷裂強度增效基因位點QWQD4B.4-13。

為了配合該分子標記，發(fā)明人設計了其特異性引物，其

正向引物序列：5′-GGT GGT TCC TTT CGA TTT TGC GC-3′(如SEQ ID NO:4所示)；

反向引物序列：5′-ACT AGT GAG TTT GTG TAC CGT AAC A-3′(如SEQ ID NO:5所示)；

通過特異性引物的擴增，以及對產物的酶切結果進行判定，通過這種方法可以判定該位點是否含有莖稈斷裂強度增效基因位點，雖然小麥莖稈斷裂強度受多個基因位點控制，但是由于本發(fā)明所判定的位點為主效基因位點，其對于小麥的莖稈斷裂強度有著十分重要的增效效果，故而即可獲知待測小麥植株中是否具有莖稈斷裂強度增效效果的相關基因；為莖稈斷裂強度基因聚合、進而改良小麥品質提供分子基礎，從而可以更好的應用于品種選育和遺傳改良中去。

綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種小麥莖稈斷裂強度分子標記，該標記位于小麥4B染色體TDURUM_CONTIG63670_287和IACX557之間；通過該分子標記的應用，可以檢測小麥品種或品系中是否具有增大莖稈斷裂強度基因位點的QWQD4B.4-13，以加快高產小麥品種的選育進程。由于采用了專用的莖稈斷裂強度分子標記不僅篩選快速精準，選擇目標明確，大大提高了抗倒伏小麥品種或品系的選擇效率和質量。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明所述的分子標記和判定方法對高莖稈斷裂強度和低莖稈斷裂強度株系PCR擴增產物酶切驗證結果電泳圖；

圖2為利用本發(fā)明所述的分子標記和判定方法對現有品種的莖稈斷裂強度進行檢測的結果示意圖，圖中品種1為山農01-35；2為山農20；3為62008；4為淄麥12；5:濰麥8；6為PH82-2；7為山農11；8:糯麥1號；9為濟南17；10為濟麥19。

具體實施方式

下述實施例中除特殊說明之外，所采用的均為本領域現有技術；

實施例1小麥的葉片DNA提取

(1)取0.3-0.5g葉片入5mL離心管，液氮速凍后研成粉末；

(2)加入1600μL已預熱至65℃的緩沖液S，多次倒置混勻，水浴0.5-1h，其間輕搖幾次以充分混勻；

(3)降溫到室溫，等待10分鐘，加10-15μL RNA酶(10mg/mL)37℃水浴30鐘，其間輕搖幾次以充分混勻，約1次/10min；

(4)取出離心管，加入等體積1600μL,4℃苯酚(Tris-平衡酚)：氯仿：異戊醇(體積比25：24：1)抽提，輕輕混勻10min，4℃冰箱靜置5min，然后8000rpm離心10min；

(5)取上清液于另一管，約1300μL，加入等體積冷氯仿(4℃冰箱放置)，輕搖10min混勻，8000rpm離心10min；

(6)取上清液于另一管，加100μL 3M NaAC(醋酸鈉)，加入1000μL的冷異丙醇(或2倍體積的冷乙醇)，充分混勻后于-20℃冰箱靜置20min；

(7)用槍頭挑出絮狀的DNA，用70％乙醇清洗2-3次，離心5分鐘，去掉乙醇，氣干后(無乙醇氣味即可)，溶于200μL 1×TE，輕輕混勻，-20℃儲存；

(8)用微量可見/紫外分光光度計NanoDrop2000，測定DNA濃度，稀釋DNA濃度為200ng/μL做為工作液。

其中所采用的溶液配制：

(1)3M NaAc(pH 5.2)

600mL H₂O中加408.24g NaAc-3H₂O，(或者246.24g無水醋酸鈉)溶解后用冰醋酸(冰乙酸)調pH值至5.2，定容至1L，滅菌，備用。

(2)1×TE(pH 8.0)

800mL H₂O中加1.211g Tris、0.3723g Na₂EDTA-2H₂O，用HCL調pH值至8.0，定容至1L，滅菌，備用。

(3)RNA酶：(若商業(yè)化配置好的1mL處理好的分裝RNA酶，可以直接使用。)

將固體RNA酶溶于0.01M NaAc，使酶濃度為10mg/mL，加熱至100℃處理15 20min，慢慢冷卻至室溫，然后加入0.1倍體積1M Tris-HCL(pH7.4)，分裝后于-20℃冰箱保存。

(4)緩沖液S

按照如下配方配制后，定容至1L：

其中10％SDS配制：

900ml水中100g溶解電泳級SDS，加熱至68度助溶，加幾滴濃HCL調節(jié)溶液PH到7.2，加水定容到1L，分裝備用。

實施例2目標產物擴增

正向引物序列：5′-AAC TCG CTC AAC GCC CTC TAC-3′(如SEQ ID NO:4所示)

反向引物序列：5′-GAT GAT TAG TTA CCA CGG CGT-3′(如SEQ ID NO:5所示)

PCR擴增：其PCR擴增體系為20μL

備注：Mix可用：或(Taq酶0.25μL，DNK 2.0μL,Buffer1.5μL,MgCl0.4μL配置)

擴增條件：

通過上述擴增即可獲得721bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

實施例3 PCR產物專一性酶切：

酶切體系10μL：

專一酶AluI：0.3μL

PCR產物：2μL

10×NE buffer:1.0μL

ddH₂O:6μL

酶切反應條件：PCR擴增產物中添加0.3μL AluI專一酶(市場購得)，37℃水浴4h.然后將酶切體系65℃滅活5min。

將上述擴增產物在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，擴增產物分子量大小為721bp，之后利用AluI專一酶酶切后檢測相應片段，如果利用AluI專一酶酶切后依然為721bp的片段，則證明該片段未被切斷，該品種(系)含有莖稈斷裂強度增效基因位點QWQD4B.4-13，如果檢測后為含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2和3所述的兩個片段，則證明該片段已被切斷，該品種(系)不含有莖稈斷裂強度增效基因位點QWQD4B.4-13。

實驗例

對已知小麥品種山農01-35，山農20，62008，淄麥12，濰麥8，PH82-2，山農11，糯麥1號，濟南17和濟麥19利用上述方法進行檢測，結果如圖2所示；

同時經過實際測量，含增效基因位點的品種(系)莖桿斷裂強度平均值為15.14N，不含增效基因位點的品種(系)莖桿斷裂強度平均值為6.74N。并且，兩者之間的莖稈斷裂強度值差異達到極顯著水平(P<0.01)：

兩種單倍型QWQD4B.4-13-T/C莖桿強度平均值及顯著性差異

可見實測值與圖2中的檢測結果對應，本發(fā)明所提供的莖稈斷裂強度分子標記不僅篩選快速精準，選擇目標明確，大大提高了抗倒伏小麥品種或品系的選擇效率和質量。