本申請(qǐng)是2011年5月4日提交的同名發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)201180022904.9的分案申請(qǐng)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明提供了工程化以表達(dá)抑制精子運(yùn)動(dòng)性，受精或其組合的抗體片段的共生生物，及含有所述共生生物的組合物。本發(fā)明提供了此類(lèi)工程化共生生物或含有所述共生生物的組合物作為避孕藥的用途。

發(fā)明背景

需要開(kāi)發(fā)新的避孕藥，以對(duì)所有個(gè)體提供方便的生育控制，而不受社會(huì)，財(cái)政或教育的限制。

盡管目前有許多不同的避孕藥可用，但沒(méi)有一種避孕藥是沒(méi)有問(wèn)題的。到目前為止，最常用的避孕藥是口服的雌激素，孕酮，或其組合的制劑，盡管所述制劑是有效的，但已提示所述制劑在某些群體中在長(zhǎng)期使用的情況下可能引起腫瘤。

屏障方法，如隔膜或子宮內(nèi)裝置，顯示出降低的效果，以及不依從性(對(duì)于前者)，和更大的盆腔炎性疾病的風(fēng)險(xiǎn)(在使用后者的情況下)。殺精子劑也被用于這方面，但其效果較差，并且，更高的性傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)與其使用相關(guān)。

因此，需要與上面的限制無(wú)關(guān)的、易于使用的微創(chuàng)(minimallyinvasive)避孕藥。

發(fā)明概述

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基因工程化的細(xì)胞，其產(chǎn)生抗精子抗原的抗體片段，并由此可以用作避孕藥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了工程化的雌性生殖道共生細(xì)菌，其中所述細(xì)菌被工程化以表達(dá)抗精子的抗體或其片段，其能有效阻止精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子的精子穿透，或其組合。在某些實(shí)施方案中，抗體片段是單鏈fv分子(scfv)。

在某些實(shí)施方案中，對(duì)精子抗原特異的抗體片段是來(lái)自人的或人源化的。在某些實(shí)施方案中，抗體片段與精子上頂體或質(zhì)膜位置的抗原或其片段特異性相互作用。在某些實(shí)施方案中，抗體片段與精子頸部區(qū)域位置的抗原或其片段特異性相互作用。在某些實(shí)施方案中，抗體片段從工程化細(xì)菌中分泌，而在某些實(shí)施方案中，抗體片段與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合或相連接。

在某些實(shí)施方案中，工程化細(xì)菌是乳桿菌(lactobacillus)，或在某些實(shí)施方案中，是乳球菌(lactococcus)。在某些實(shí)施方案中，工程化細(xì)菌是大腸桿菌(escherichiacoli)nissle1917株。在某些實(shí)施方案中，工程化細(xì)菌是戈登氏鏈球菌(s.gordonii)。在某些實(shí)施方案中，工程化細(xì)菌是詹氏乳桿菌(l.jensenii)或卷曲乳桿菌(l.crispatus)。

在某些實(shí)施方案中，scfv跟與seqidno：1或2有至少90％同一性的肽特異性相互作用。在某些實(shí)施方案中，scfv具有與seqidno：8有至少90％的同一性的序列。在某些實(shí)施方案中，scfv由多核苷酸編碼，該多核苷酸具有與seqidno：7有至少90％同一性的序列。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文所述的工程化細(xì)菌的組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物是陰道栓劑，乳膏或泡沫的形式。在某些實(shí)施方案中，避孕藥與陰道環(huán)結(jié)合或包含于陰道環(huán)上。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了避孕的方法，所述方法包括將雌性對(duì)象生殖道細(xì)胞與在雌性對(duì)象中足以抑制或阻止精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的本發(fā)明所述的工程化細(xì)菌相接觸的步驟。在某些實(shí)施方案中，依據(jù)該方面，該方法包括將足以抑制或阻止的量的包含工程化細(xì)菌的組合物施用到有此需要的雌性對(duì)象的生殖道中。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低雌性群體妊娠的發(fā)生率的方法，所述方法包括將雌性對(duì)象的生殖道細(xì)胞與在雌性對(duì)象中足以削弱，抑制或阻止精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的本發(fā)明所述的工程化細(xì)菌相接觸的步驟，由此降低雌性的妊娠的發(fā)生率并由此降低雌性群體中的妊娠的發(fā)生率。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低雌性群體受精的發(fā)生率的方法，所述方法包括將雌性對(duì)象生殖道細(xì)胞與在雌性對(duì)象中足以削弱，抑制或阻止精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的本發(fā)明所述的工程化細(xì)菌相接觸的步驟，由此降低雌性中的受精發(fā)生率并由此降低雌性群體中的受精的發(fā)生率。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明描述的工程化細(xì)菌或組合物在制備用于降低雌性群體妊娠的發(fā)生率的藥物中的用途。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明描述的工程化細(xì)菌或組合物在制備用于降低雌性群體受精的發(fā)生率的藥物中的用途。

附圖簡(jiǎn)述

圖1以圖形方式描述了通過(guò)elisa測(cè)定法確定的，分離并克隆的噬菌體展示的scfv對(duì)精子肽的相對(duì)親和力。1-3列顯示了三種scfv與源于精子fa-1的肽的結(jié)合，而4-6列顯示了三種scfv與源于精子ylp(12)的肽的結(jié)合。bsa用作陰性結(jié)合對(duì)照。

圖2描述了分離并克隆的一些噬菌體展示的scfv對(duì)用作探針的(probed)精子肽的相對(duì)親和力。當(dāng)與肽相關(guān)的od值更高(與bsa對(duì)照或未與肽溫育的樣品相比)時(shí)，克隆被認(rèn)為具有高親和力。特別地，克隆102，103，105和106顯示出對(duì)于肽相對(duì)高的親和力，并且進(jìn)一步描述了克隆102的體外和體內(nèi)特征。

圖3以圖形方式描述了鑒定一系列非結(jié)合scfv的elisa結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，這些非結(jié)合scfv隨后被用作對(duì)照與克隆102進(jìn)行比較，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)克隆102對(duì)用作探針的肽具有良好的親和力。在該情況下，通常使用一個(gè)這樣的scfv克隆，j112。也測(cè)試了對(duì)照a和b，其分別為不含有scfv噬菌體或不含有肽和scfv的樣品。通過(guò)測(cè)量樣品中的od(用抗噬菌體hrp標(biāo)記的抗體(抗pviii的抗體)進(jìn)行探測(cè))來(lái)檢測(cè)結(jié)合。

圖4a是pslp111.1載體的質(zhì)粒圖譜。圖4b是描繪質(zhì)粒的ncoi和noti消化產(chǎn)物的照片。使用ncoi-和noti在37℃剪切質(zhì)粒三小時(shí)。在幾個(gè)代表性克隆中清楚地顯示了質(zhì)粒插入物。

圖5a分別描述了j102的核酸和氨基酸序列(seqidno：7-8)。圖5b描述了j102scfv中的各個(gè)結(jié)構(gòu)域。

圖6描述了表達(dá)j102的乳桿菌與鼠精子在體外的特異性結(jié)合。圖6a是顯示表達(dá)scfv的乳桿菌與小鼠精子的顯著結(jié)合的光顯微照片，幾乎每個(gè)進(jìn)行評(píng)價(jià)的精子細(xì)胞都顯示顯著的染色。圖6b是表達(dá)j112的乳桿菌(用作對(duì)照)的光顯微照片，其中沒(méi)有明顯可見(jiàn)的與鼠精子的結(jié)合。

圖7以圖形方式描述了表達(dá)j102的乳桿菌的功效的體內(nèi)證實(shí)。圖7a繪制了，在兩個(gè)試驗(yàn)中被施以表達(dá)抗精子scfvj102的詹氏乳桿菌或表達(dá)不結(jié)合精子的scfv(j112)的對(duì)照乳桿菌的雌性小鼠的妊娠率；在每個(gè)試驗(yàn)中，相對(duì)于j112處理的小鼠，j102處理的小鼠中顯示出了有效的避孕。圖7b繪制了，如圖7a所述進(jìn)行的兩個(gè)試驗(yàn)的每一個(gè)試驗(yàn)中的幼崽總數(shù)和每籠幼崽數(shù)目；與對(duì)照相比，在表達(dá)j102的詹氏乳桿菌的情況下，幼崽總數(shù)和每籠幼崽數(shù)目都被減少。

發(fā)明詳述

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組的細(xì)胞(在一個(gè)實(shí)施方案中，其包括微生物在內(nèi))，以及使用其以產(chǎn)生殺精子化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法和細(xì)胞提供了有效的避孕方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，重組的細(xì)胞是雌性生殖道共生生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，共生生物是細(xì)菌。

在一個(gè)實(shí)施方案中，重組的細(xì)胞是非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其存留在雌性生殖道粘膜中足以表達(dá)干擾精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子的精子穿透的化合物的一段時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)在被處理對(duì)象的雌性生殖道中由定殖于此的共生生物表達(dá)時(shí)，化合物在所述對(duì)象中導(dǎo)致降低的繁殖力。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)在被處理對(duì)象的雌性生殖道中表達(dá)時(shí)，化合物在施以這樣的共生生物的群體中導(dǎo)致降低的妊娠率。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表達(dá)殺精子化合物的工程化共生生物，此類(lèi)生物能夠定殖于雌性生殖道或其區(qū)域之中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞被工程化以表達(dá)核酸片段，所述核酸片段包括編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列，且能夠被表達(dá)為特定蛋白。

可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何方法，將基因工程化的細(xì)菌工程化為在特定基因中具有缺陷，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，將工程化生物工程化以過(guò)表達(dá)特定基因。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將構(gòu)建體引入本發(fā)明的細(xì)菌，以便能夠?yàn)榛蚯贸^(guò)程選擇細(xì)菌中的同源重組事件。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地設(shè)計(jì)敲除構(gòu)建體，包括陽(yáng)性和陰性選擇基因，以有效選擇經(jīng)歷該構(gòu)建體的同源重組事件的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)、活性和功能的變化，尤其是基因表達(dá)的增強(qiáng)，減弱，和消除，可以使用整合入細(xì)胞基因組的基因構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)，活性和功能的變化可以使用染色體外的基因構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建體保持在染色體外。

在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)構(gòu)建體或載體是指，含有已亞克隆入載體中的目的序列的核酸運(yùn)載工具。

為了產(chǎn)生本發(fā)明的載體，可以將編碼目的序列的多核苷酸連接入適于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞并在轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)重組產(chǎn)物表達(dá)的合適的表達(dá)載體系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)理解，可以通過(guò)常用的重組技術(shù)容易地修飾此類(lèi)合適的載體系統(tǒng)，以替換，復(fù)制或突變已有的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列和/或?qū)肴魏瘟硗獾亩嗪塑账嵝蛄?，例如編碼另外的選擇標(biāo)記的序列或者編碼報(bào)告基因的序列。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，載體進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)元件，如調(diào)節(jié)分離的核酸的表達(dá)的啟動(dòng)子。已知此類(lèi)啟動(dòng)子為轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列元件，因?yàn)槠溆糜诮Y(jié)合dna依賴(lài)性rna聚合酶，而該酶轉(zhuǎn)錄位于其下游的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，或組成性表達(dá)目的序列的啟動(dòng)子。

本發(fā)明的載體可以進(jìn)一步包括復(fù)制起點(diǎn)，并可以在多于一個(gè)種類(lèi)的原核細(xì)胞中增殖，并且在某些實(shí)施方案中，可以構(gòu)建載體以便于其在所選擇的生物的基因組中整合。在其他實(shí)施方案中，如技術(shù)人員所理解的，載體可以是例如質(zhì)粒，桿狀病毒穿梭載體(bacmid)，噬菌?；蚴删w，或任何適合的載體。

此類(lèi)載體的實(shí)例在下文實(shí)施例部分描述并使用。然而，技術(shù)人員將理解，本發(fā)明不限于任何此類(lèi)載體的使用，并且本領(lǐng)域中為了優(yōu)化插入或納入的序列(載體用作所述序列的基因遞送/工程化運(yùn)載工具)的異源表達(dá)的目的，創(chuàng)建新的載體和/或修飾已有的載體是常規(guī)的。

適合使用的載體的一些例子包括：m.posno等，applenvironmicrobiol.1991june；57(6):1822-1828；mshimizu-kadota等，applenvironmicrobiol.1991november；57(11):3292-3300；t.duong等，microbialbiotechnologyvolume4，issue3，pages357-367，may2011；vvaleshin等，mikrobiologiiavolume:69，issue:1，pages:75-80；x.liu等，antimicrobialagentsandchemotherapy2006，vol.50，no.10，pp.3250-3259；wo/2005/112567；lucavangelista等，antimicrobialagentsandchemotherapy，july2010，pp.2994-3001，vol.54，no.7；美國(guó)專(zhuān)利7,179,458；美國(guó)專(zhuān)利7,754,467；carenj.chancey等.thejournalofimmunology，2006，176:5627-5636；美國(guó)專(zhuān)利5,733,540等。

可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中納入所需核酸序列?？梢允褂煤怂針?gòu)建體來(lái)穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。

本領(lǐng)域中有許多已知的技術(shù)可以用于將載體導(dǎo)入本發(fā)明的細(xì)胞，例如但不限于，直接dna攝取技術(shù)，和噬菌體，質(zhì)粒，線(xiàn)性dna或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，受體介導(dǎo)的攝取，以及使用磷酸鈣介導(dǎo)的和deae-葡聚糖介導(dǎo)的導(dǎo)入方法的磁電穿孔(magnetoporation)方法，電穿孔或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)例如，"methodsinenzymology"vol.1-317，academicpress，currentprotocolsinmolecularbiology，ausubelf.m.等(編)greenepublishingassociates，(1989)和molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，sambrook等.coldspringharborlaboratorypress，(1989)，或其他標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè))。還涉及使用核酸包覆的顆粒的轟擊。應(yīng)當(dāng)理解，可以使用任何此類(lèi)方法來(lái)將需要的序列導(dǎo)入細(xì)胞，以產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞，和實(shí)施本發(fā)明的方法。

電穿孔已被成功用于轉(zhuǎn)化多種細(xì)胞。

也可以使用依賴(lài)于供體和受體細(xì)胞的直接接觸的細(xì)菌接合來(lái)將基因轉(zhuǎn)移入細(xì)菌。細(xì)菌接合過(guò)程可以包括，將“供體”和“受體”細(xì)胞互相緊密接觸地混合在一起。結(jié)合通過(guò)在供體和受體細(xì)菌間形成細(xì)胞質(zhì)連接而發(fā)生，并且新合成的供體dna被直接轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞。接合中的受體通過(guò)水平轉(zhuǎn)移從供體細(xì)菌接收dna。接合轉(zhuǎn)移中的供體可以具有接合質(zhì)粒，接合轉(zhuǎn)座子，或可移動(dòng)的質(zhì)粒。

在某些情況下，接合僅需要供體和受體。這發(fā)生在待轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒是接合的和可移動(dòng)的自傳播質(zhì)粒(即，攜帶tra基因和編碼mob蛋白的基因)時(shí)。通常，該過(guò)程包括下列步驟：1)雙鏈質(zhì)粒dna在orit的特定位置上產(chǎn)生切口；2)單鏈dna通過(guò)孔或菌毛結(jié)構(gòu)被釋放給受體；3)dna釋放酶(relaxase)在orit切割雙鏈dna并結(jié)合至釋放的5’末端(形成作為中間結(jié)構(gòu)的松弛小體)；和4)隨后，輔助蛋白復(fù)合體在orit裝配以促進(jìn)dna轉(zhuǎn)移過(guò)程。

將供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體也可能需要“三親本”接合。在這種類(lèi)型的接合中，涉及供體細(xì)胞，受體細(xì)胞，和“助手”質(zhì)粒。供體細(xì)胞攜帶可移動(dòng)的質(zhì)粒或接合轉(zhuǎn)座子。可移動(dòng)的載體含有orit(編碼切口酶的基因)，并具有編碼mob蛋白的基因；然而，單獨(dú)的mob蛋白不足以實(shí)現(xiàn)基因組的轉(zhuǎn)移。因此，除非助手質(zhì)粒提供適合的接合系統(tǒng)(位于供體中或“助手”細(xì)胞中)，否則可移動(dòng)的質(zhì)粒不能夠促進(jìn)自身的轉(zhuǎn)移。需要接合質(zhì)粒來(lái)形成配合對(duì)并轉(zhuǎn)移dna，因?yàn)樵撡|(zhì)粒編碼參與孔或菌毛形成的轉(zhuǎn)移用蛋白(tra)。

當(dāng)用于例如細(xì)胞，或核酸，蛋白，或載體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組的”或“重組改變的”表示，已通過(guò)導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者改變天然核酸或蛋白而修飾細(xì)胞，核酸，蛋白，或載體，或者表示，細(xì)胞源自如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組的細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)在非重組細(xì)胞中異常表達(dá)，低表達(dá)或完全不表達(dá)的天然基因。

當(dāng)用于核酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“異源”表示，核酸包含兩個(gè)或更多個(gè)的子序列，這些子序列在天然狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)與異源核酸中的關(guān)系相同的相互關(guān)系。例如，通常重組產(chǎn)生核酸，其具有兩個(gè)或更多個(gè)來(lái)自不相關(guān)的基因且被安排以產(chǎn)生新的功能性核酸的序列，例如來(lái)自一個(gè)來(lái)源的啟動(dòng)子和來(lái)自另一個(gè)來(lái)源的編碼區(qū)。類(lèi)似地，異源蛋白表示，蛋白包含兩個(gè)或更多個(gè)的子序列，這些子序列在天然狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)與異源蛋白中的關(guān)系相同的相互關(guān)系(如，融合蛋白)。

術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”是重組或合成產(chǎn)生的核酸，其具有一系列允許特定核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特定的核酸元件。表達(dá)盒可以是質(zhì)粒，病毒，或核酸片段的一部分。通常，表達(dá)載體包含可操作地連接至啟動(dòng)子的待轉(zhuǎn)錄的核酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的核酸包括，制自核苷酸類(lèi)似物的rna或dna類(lèi)似物。該術(shù)語(yǔ)包括由天然發(fā)生的核酸堿基，糖和共價(jià)核苷間(骨架)連接組成的寡核苷酸，以及具有類(lèi)似作用的具有非天然發(fā)生部分的寡核苷酸。相比于天然形式，此類(lèi)經(jīng)修飾的或取代的寡核苷酸經(jīng)常是優(yōu)選的，因?yàn)槠渚哂衅谕男再|(zhì)，例如，增強(qiáng)的細(xì)胞攝取，增強(qiáng)的對(duì)核酸靶的親和力，在核酸酶存在時(shí)增加的穩(wěn)定性和/或有效的基因沉默。

可以通過(guò)任何合成或重組過(guò)程，如本領(lǐng)域公知的過(guò)程來(lái)產(chǎn)生用于本發(fā)明的核酸?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)手段進(jìn)一步修飾核酸，以改變生物物理學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)。例如，可以修飾核酸以增加其對(duì)抗核酸酶的穩(wěn)定性(例如“封端”)，或改變其親脂性，溶解性，或與互補(bǔ)序列的結(jié)合親和力。

也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成本發(fā)明的dna。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從四種核苷酸整體或部分化學(xué)合成dna。這樣的方法包括caruthers(1985)中描述的那些。也可以通過(guò)制備重疊的雙鏈寡核苷酸，填充間隙，并將末端連接在一起來(lái)合成dna(一般參見(jiàn)sambrook等.(1989)和glover等.(1995))?？梢酝ㄟ^(guò)定點(diǎn)誘變從野生型dna制備表達(dá)蛋白的功能性同源物的dna(參見(jiàn)例如，zoller等(1982)；zoller(1983)；和zoller(1984)；mcpherson(1991))?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法擴(kuò)增獲得的dna。一種適合的方法是saiki等(1988)，mullis等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,195，和sambrook等(1989)中描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在克隆入載體，例如粘粒，噬菌體，質(zhì)粒，或bac(細(xì)菌人工染色體)中的基因組dna上進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座?？梢允褂每寺∪氲任换蛑脫Q載體的基因組dna，在非天然具有能力的生物中進(jìn)行類(lèi)似的高密度誘變(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,207,384，所述方法可用于工程化本文描述的生物)。

就例如它們的轉(zhuǎn)化能力，表達(dá)異源蛋白的能力，和/或粘膜表面，來(lái)選擇適合的細(xì)菌宿主菌株?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如氯化銣法或電穿孔，來(lái)使細(xì)菌宿主具有轉(zhuǎn)化能力(參見(jiàn)例如，wei等,j.microbiol.methods21：97-109(1995))。

可以通過(guò)修改例如luchansky等(j.dairysci.74：3293-3302(1991))中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行共生生物例如詹氏乳桿菌的電穿孔轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)言之，在mrs培養(yǎng)基中培養(yǎng)新鮮接種的詹氏乳桿菌(如，在37℃和5％co2下培養(yǎng)到0.6-0.7的od600)。細(xì)菌細(xì)胞被收獲，清洗，并再懸浮于冷的蔗糖和mgcl2溶液中。隨后將感受態(tài)細(xì)胞與dna混合并進(jìn)行電穿孔。然后，允許細(xì)胞恢復(fù)，然后將細(xì)胞涂板于含有抗生素等選擇劑的選擇性瓊脂平板上。隨后將工程化的細(xì)胞施用給對(duì)象，例如，以栓劑，乳膏或泡沫劑型。

任選地，在將本發(fā)明的細(xì)菌導(dǎo)入陰道之前，可以使用抗生素預(yù)處理來(lái)預(yù)清理原住細(xì)菌的粘膜表面(參見(jiàn)例如，freter等,infect.immun.,39：686-703(1983))?？股乜梢钥诜峁┗蛑苯邮┯弥陵幍?。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇按照本發(fā)明方法工程化的細(xì)菌菌株的非限制性方法，這些菌株能有效地定殖到施加細(xì)菌的粘膜表面上，該方法可包括，在動(dòng)物或人粘膜層上重復(fù)選擇快速定殖的細(xì)菌。例如，將野生型細(xì)菌菌株施加到粘膜表面，并重復(fù)分離和體外培養(yǎng)所述細(xì)菌，在每一步都返回到粘膜表面。在某些實(shí)施方案中，依照這個(gè)方面，最終獲得具有增強(qiáng)的定殖能力的細(xì)菌。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了按照本發(fā)明方法工程化細(xì)菌菌株的非限制性方法，這些菌株能有效地定殖到施加細(xì)菌的粘膜表面上，該方法可包括在重組細(xì)菌表面上表達(dá)融合蛋白。融合蛋白由與目的多肽連接的宿主結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。宿主結(jié)合結(jié)構(gòu)域允許細(xì)菌以高親和力與所選宿主粘膜表面上的某些決定簇(蛋白或碳水化合物)結(jié)合，由此賦予細(xì)菌超過(guò)原住菌群(microflora)的生存優(yōu)勢(shì)。

另一個(gè)工程化本發(fā)明細(xì)菌菌株的示例性方法包括通過(guò)以噬菌體導(dǎo)入基因來(lái)誘導(dǎo)原住菌群表達(dá)異源蛋白。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種噬菌體載體以用于不同細(xì)菌中。例如，可以使用基于溫和噬菌體adh的噬菌體載體(參見(jiàn)例如，raya等,j.bacteriol.174：5584-5592(1992)和fremaux等,gene125：61-66(1993))。該載體在確定的噬菌體(attp)和細(xì)菌(attb)附著位點(diǎn)上位點(diǎn)特異性整合入宿主染色體。類(lèi)似地，可以使用乳桿菌特異性噬菌體來(lái)將載體或其他多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)入乳桿菌染色體。乳桿菌特異性噬菌體包括mv4(auvray等,j.bacteriol.,179：1837-1845(1997))，adh(fremaux等,gene126：61-66(1993))，gle(kakikawa等,gene175：157-165(1996))，以及屬于陰道乳桿菌分離株中的bradley組a或b的那些(kilic等,clin.diagn.lab.immunol.8：31-39(2001))。

也可以將不刺激粘膜上皮細(xì)胞的某些制劑加入到單位劑量的細(xì)菌中以輔助定殖。粘膜表面上的許多細(xì)菌分泌包膜材料，所述包膜材料聯(lián)合形成覆蓋整個(gè)粘膜表面的生物膜。添加消化該生物膜材料的酶以促進(jìn)工程化細(xì)菌穿透生物膜(從而更成功地定殖)可能是有益的。這樣的酶包括dna酶，肽酶，膠原酶，透明質(zhì)酸酶，和其他碳水化合物降解酶。也可以添加工程化細(xì)菌本身對(duì)其不易感的抗生素來(lái)降低粘膜表面原住細(xì)菌的數(shù)量，以便于工程化細(xì)菌的有效定殖。

使用p59(vandervossen等,appl.environ.microbiol.58：3142-3149(1992))或p23(elliot等cell36：211-219(1984))啟動(dòng)子的異源多核苷酸或多肽的表達(dá)可以是組成型的?？蛇x地，表達(dá)可以在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。例如，芽孢桿菌淀粉酶(weickert等,j.bacteriol.171：3656-66(1989))或木糖(kim等gene181：71-76(1996))啟動(dòng)子以及乳球菌乳鏈球菌素啟動(dòng)子(eichenbaum等,appl.environ.microbiol.64：2763-2769(1998))可以用于驅(qū)動(dòng)誘導(dǎo)型表達(dá)。此外，可以使用酸或堿誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。例如，可以使用在陰道的相對(duì)酸性的條件下具有活性的啟動(dòng)子(例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,242,194描述的那些)?？蛇x地，可以使用由陰道中響應(yīng)精液的變化來(lái)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。例如，使用堿誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)響應(yīng)由精液導(dǎo)入而引起的陰道的增加的堿性條件而誘導(dǎo)表達(dá)。

已知多種信號(hào)和錨定序列指導(dǎo)多肽至膜，胞外間隙或細(xì)胞壁表達(dá)(如，通過(guò)與肽葡聚糖共價(jià)連接)。示例性的信號(hào)序列包括，來(lái)自噬淀粉乳桿菌(lactobacillusamylovorus)的α-淀粉酶的信號(hào)序列(giraud&cuny,gene198：149-157(1997))或者來(lái)自卷曲乳桿菌的s-層基因(cbsa)的信號(hào)序列(例如，mkknlrivsaaaaallavapvaa(seqidno：3)或mkknlrivsaaaaallavatvsa(seqidno：4))。信號(hào)序列通常位于多肽的氨基末端。

錨定序列通常位于被編碼的蛋白序列的羧基末端。錨定序列包括例如，細(xì)胞壁結(jié)合序列；序列l(wèi)pq(s/a/t)(g/a)，其中括號(hào)中的殘基表示該位置的不同選項(xiàng)；和疏水序列，以及任選地，帶電荷的序列。在某些實(shí)施方案中，錨定序列包含：

vtrtinvvdpitgkistsvqtakftredknsnagytdpvtgkttmnpwtpakqglravnveqikgyvakvdgnvdavvvtpdsanmvvtityqankpegqnitnkkdtvpdpadgiknkddlpdgtkytwkevpdvnsvgektgivtvtfpdgtsvdvkvtvyvdpvvesnrdtlskeantgntnvakaatvtsskveskktlpqtgskteqvgilglaiatvgsllglgvnrkkrqk(seqidno：5)；或，

kkaeevknnsnatqkevddatnnlkqaqndldgqttdkskldeaiksaddtkstdkynnasddtkskfdealkkaeevknnsnatqkevddatknlkqaqndldgqttnkdaindaikdannakgtdkynnasddtkskfddalkkaedvkndsnanqkevddatknlkntlnnlkgqpakkanliaskdnakihkqtllpqtgtetnpltaigiglmalgagifakkkrkddea(seqidno：6)，或，

與seqidno：5或seqidno：6基本相同的序列。

可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法確定多肽的正確定位和折疊。例如可以通過(guò)下述來(lái)獲得乳桿菌的細(xì)胞壁富集的級(jí)分：將細(xì)菌懸浮于緩沖溶液(如，25％蔗糖，1mmedta，10mmtris-hcl，ph8.0)，隨后用細(xì)胞壁降解酶(如，溶菌酶和變?nèi)芫?進(jìn)行處理，并接著以差速離心分離出得到的原生質(zhì)體(piard等.，j.bacteriol.179：3068-3072(1997))?？梢酝ㄟ^(guò)western印跡法來(lái)篩選級(jí)分，以確認(rèn)在細(xì)胞壁中的表達(dá)。

也可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定表達(dá)的多肽的折疊和生物學(xué)活性。例如，使用對(duì)天然折疊的多肽特異的抗體的elisa測(cè)定可以用于確認(rèn)多肽的折疊和三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，生物學(xué)活性測(cè)定將依多肽的活性而變化。例如，對(duì)于與精子結(jié)合的多肽，可以使用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定來(lái)檢測(cè)表達(dá)的多肽。

當(dāng)合成在宿主細(xì)胞中具有改善的表達(dá)的基因時(shí)，期望的是設(shè)計(jì)該基因，以便其密碼子使用頻率接近于宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率。合成的基因的優(yōu)選密碼子使用頻率與宿主細(xì)胞使用的頻率的百分比偏差可以通過(guò)下述來(lái)計(jì)算：首先確定單個(gè)密碼子的使用頻率與宿主細(xì)胞的頻率的百分比偏差，隨后獲得所有密碼子的平均偏差。

可以改變編碼特定多肽的多核苷酸序列，以與特定宿主的密碼子使用一致。例如，乳桿菌的密碼子使用可以用于衍生編碼本發(fā)明多肽并包含優(yōu)選的乳桿菌密碼子的多核苷酸。宿主細(xì)胞所顯示的優(yōu)選密碼子使用頻率，可以通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞表達(dá)的大量基因中的優(yōu)選密碼子使用頻率求平均來(lái)計(jì)算。該分析優(yōu)選限于宿主細(xì)胞高表達(dá)的基因。例如，pouwels&leunissen(nucleicacidsres.22：929-936(1994))提供了各種乳桿菌物種所顯示的高表達(dá)基因的密碼子使用頻率。密碼子使用表也可以通過(guò)因特網(wǎng)獲得。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的載體進(jìn)一步包括編碼標(biāo)記多肽的異源核酸序列的插入。標(biāo)記多肽可以包括，例如，綠色熒光蛋白(gfp)，ds-紅(紅色熒光蛋白)，分泌型堿性磷酸酶(seap)，β-半乳糖苷酶，螢光素酶，或任何數(shù)量的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他報(bào)告蛋白。

通過(guò)修飾來(lái)自維多利亞多管水母(aequoreavictoria)的天然發(fā)生的gfp的氨基酸序列，已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種具有有用的激發(fā)和發(fā)射光譜的多管水母相關(guān)的gfp(prasher等,1992,gene,111：229-233；heim等,1994，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,91：12501-12504；pct/us95/14692)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，將具有編碼殺精子化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)移入異源生物，導(dǎo)致表達(dá)。

檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，可以包括，rna印跡，pcr，hplc，質(zhì)譜，elisa，ria，或蛋白印跡分析[參見(jiàn)“cellbiology：alaboratoryhandbook”，volumesi-iiicellis,j.e.,編(1994)；“currentprotocolsinimmunology”volumesi-iiicoliganj.e.,ed.(1994)；stites等(編)]。

在某些實(shí)施方案中，可以將抗生素抗性盒導(dǎo)入本發(fā)明描述的生物中，作為確認(rèn)導(dǎo)入的構(gòu)建體的表達(dá)的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，將抗生素易感盒導(dǎo)入生物，作為導(dǎo)入對(duì)象的構(gòu)建體的安全方案，并且在某些實(shí)施方案中，用于消除避孕效果，促進(jìn)安全方式懷孕，例如，通過(guò)給對(duì)象注射短療程抗生素治療(其清除生物學(xué)避孕藥)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表達(dá)殺精子化合物的工程化細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，殺精子化合物可以包括抗精子的抗體或其片段，其能有效阻止精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子的精子穿透，或其組合。

抗體例如作為完整的免疫球蛋白或多種良好表征的片段存在。在某些實(shí)施方案中，scfv片段被考慮作為工程化生物，組合物，試劑盒的一部分，且用于本發(fā)明的方法中。在某些實(shí)施方案中，其他考慮的片段包括f(ab')2，一種fab'單體。fab'單體本質(zhì)上是具有鉸鏈區(qū)的一部分的fab(見(jiàn)paul(編)fundamentalimmunology,第三版,ravenpress,ny(1993))。盡管各種抗體片段以完整抗體的消化進(jìn)行定義，但技術(shù)人員理解，這樣的片段可以通過(guò)化學(xué)方法或通過(guò)使用重組dna方法從頭合成。因此，本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)抗體也包括通過(guò)修飾完整抗體而產(chǎn)生的抗體片段，或者使用重組dna方法從頭合成的抗體片段(如，單鏈fv(scfv))。

本發(fā)明描述了制備此類(lèi)細(xì)胞的示例性方法，然而技術(shù)人員理解，任何殺精子化合物或化合物的組合可以在共生生物中重組產(chǎn)生。

在某些實(shí)施方案中，使用抗體片段，其在各種動(dòng)物物種中是殺精子的，或否則抑制精子運(yùn)動(dòng)性，或精子-卵子融合能力或卵子的精子穿透。例如，在某些實(shí)施方案中，抗體片段，如scfv，與在動(dòng)物物種和人中保守的高度保守的精子特異性表位特異性相互作用，從而可以在動(dòng)物模型中進(jìn)行體內(nèi)效果測(cè)試，而相同抗體片段例如人scfv或其人源化形式的驗(yàn)證可以在人體臨床試驗(yàn)中進(jìn)行。

在某些實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，此類(lèi)抗體/抗體片段可以如本發(fā)明中例舉的，或如xu,等archandrol.1994sep-oct；33(2)：141-4；clarke等,archandrol.1995jul-aug；35(1)：21-7；wo0107083a1；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,830,472，5,753,231，5,227,160中描述的，或通過(guò)任何適合的方法來(lái)產(chǎn)生。工程化共生生物以表達(dá)這樣的化合物也可以通過(guò)任何方法，如pnas102：11993-11998(2003)中描述的方法來(lái)完成。

完全人的抗體/抗體片段用于人類(lèi)女性的避孕是特別理想的?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)制備人抗體/抗體片段，包括本發(fā)明中描述的，使用源自人免疫球蛋白序列的抗體/抗體片段文庫(kù)的噬菌體展示方法。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,444,887和4,710,111；以及wo98/46645；wo99/50433；wo98/24893；wo98/16654；wo96/34096；wo96/33735；和wo91/10741，其各自以引用方式整體納入本文，并且包括下文提供的實(shí)施例。

應(yīng)當(dāng)理解，本文中引用的任何參考文獻(xiàn)被認(rèn)為以引用方式整體納入本文。

也可以使用不能表達(dá)功能性?xún)?nèi)源免疫球蛋白，但可以表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)生產(chǎn)人抗體或抗體片段，例如scfv。關(guān)于這種生產(chǎn)人抗體的技術(shù)的概述，可參見(jiàn)lonberg和huszar，1995。關(guān)于這種生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)以及生產(chǎn)此類(lèi)抗體及其片段的方案的詳細(xì)討論，可參見(jiàn)例如，wo98/24893；wo92/01047；wo96/34096；wo96/33735；ep0598877；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；其以引用方式整體納入本文。此外，公司如abgenix,inc.(freemont,calif.)，kirin,inc.(japan)，medarex(nj)和genpharm(sanjose,calif.)可使用與上面所描述的技術(shù)類(lèi)似的技術(shù)來(lái)提供抗所選抗原的人抗體。

也可以通過(guò)davis等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,179,337)所描述的方法和偶聯(lián)劑來(lái)修飾本發(fā)明的抗體，以產(chǎn)生基本上不誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的抗體片段。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所描述的工程化細(xì)菌的組合物。

在某些實(shí)施方案中，組合物可以包含本發(fā)明所描述的工程化細(xì)菌，其中組合物包含表達(dá)不同的異源抗精子劑的細(xì)菌，所述細(xì)胞包含于相同組合物中，作為施用的單位劑量的一部分。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)不同的異源抗精子劑的此類(lèi)細(xì)菌可以依對(duì)特定抗原或表位的特異性而變化，或者依片段所結(jié)合的抗原或表位而變化，或者依對(duì)表位的親和力而變化，或者依其所衍生自的同種型而變化，或依這些的組合而變化。

在某些實(shí)施方案中，此類(lèi)組合物也可以包括表達(dá)相同或不同異源抗精子劑的不同細(xì)菌菌株，所述菌株也包含在相同組合物中，作為施用的單位劑量的一部分。

在某些實(shí)施方案中，組合物是陰道栓劑，液體，噴霧劑，泡沫，乳膏，摩絲，或任何適合陰道遞送的運(yùn)載體的形式。

在某些實(shí)施方案中，工程化的細(xì)菌或含有其的組合物被施用至或包含于陰道環(huán)中，所述陰道環(huán)隨后被施用給雌性對(duì)象。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及避孕套，其含有施用于避孕套外表面并且被保持的工程化的細(xì)菌或包含所述細(xì)菌的組合物，以便在性交期間避孕套的佩戴者可以將工程化的細(xì)菌轉(zhuǎn)移給其雌性伴侶。

在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“包含”或其語(yǔ)法形式，是指含有所指示的活性劑，如本發(fā)明的工程化共生生物或者本發(fā)明描述的噬菌體，以及含有其他活性劑和制藥工業(yè)中已知的藥學(xué)可接受的載體，賦形劑，潤(rùn)滑劑，穩(wěn)定劑等。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本上由……組成”是指這樣的組合物，其僅有的活性成分是所指示的活性成分，即本發(fā)明描述的工程化共生生物，但還可以包括用于穩(wěn)定，保存制劑等，但不直接參與避孕效果的其他試劑/組分/化合物。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本上由……組成”可以指這樣的組分，其通過(guò)與工程化共生生物的機(jī)制不同的機(jī)制發(fā)揮避孕效果，其增強(qiáng)避孕效果或延長(zhǎng)避孕效果或具有這兩種效果。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“基本上由……組成”可以指這樣的組分，其促進(jìn)工程化共生生物的釋放(例如通過(guò)增強(qiáng)工程化共生生物從栓劑制劑或其他制劑中釋放)，促進(jìn)有效定殖，促進(jìn)均勻定殖，和其他想要的效果，其促進(jìn)工程化共生生物的活性，但并非工程化共生生物的組分。在某些實(shí)施方案中，此類(lèi)試劑可以包括，誘導(dǎo)編碼的抗精子劑表達(dá)的試劑，或在某些實(shí)施方案中，增強(qiáng)編碼的抗精子劑表達(dá)的試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“組成”是指這樣的組合物，其含有活性成分和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

工程化細(xì)菌至期望的粘膜表面的遞送，依賴(lài)于該區(qū)域的可到達(dá)性和局部條件。例如，工程化細(xì)菌可以被置于鹽溶液，乳膏，栓劑中或者泡沫中以遞送到陰道粘膜上。泡沫可以包括，如一種或多種疏水改性的多糖，如纖維素和殼聚糖。纖維素包括，例如，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥乙基甲基纖維素等。殼聚糖包括，例如，下面的殼聚糖鹽；殼聚糖乳酸鹽，殼聚糖水楊酸鹽，殼聚糖吡咯烷酮羧酸鹽，殼聚糖衣康酸鹽，殼聚糖煙酸鹽，殼聚糖甲酸鹽，殼聚糖乙酸鹽，殼聚糖沒(méi)食子酸鹽，殼聚糖谷氨酸鹽，殼聚糖馬來(lái)酸鹽，殼聚糖天冬氨酸鹽，殼聚糖乙醇酸鹽，和季胺取代的殼聚糖及其鹽等。泡沫也可以包括其他組分，例如水，乙醇，異丙醇，甘油，丙三醇，丙二醇，和山梨糖醇。任選地，殺精子劑可包括于細(xì)菌組合物中。泡沫和泡沫遞送運(yùn)載體的其他例子描述于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,595,980和4,922,928中。

在某些實(shí)施方案中，細(xì)菌可以作為栓劑或子宮托來(lái)遞送，參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,322,399。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)菌在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,468,526中描述的保存基質(zhì)中制備，并且在由可溶聚合物材料和/或就溶解特性選擇的復(fù)合碳水化合物材料制成的可溶元件中遞送，以便其在使用前基本保持固體形式，并且在使用時(shí)由于人的體溫和濕度而溶解，并以期望的定時(shí)釋放和劑量來(lái)釋放藥劑材料。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,529,782。細(xì)菌也可以在如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,693,705中描述的海綿遞送運(yùn)載體中遞送。

在某些實(shí)施方案中，需要定期重復(fù)將工程化細(xì)菌應(yīng)用于粘膜表面；優(yōu)化的給藥間隔可以常規(guī)地確定，但會(huì)隨不同的粘膜環(huán)境和細(xì)菌菌株而變化。在某些實(shí)施方案中，給藥間隔可以在每天一次到每2-4周或更長(zhǎng)時(shí)間一次之間變化。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)雌性月經(jīng)周期進(jìn)行施用，以便施用在月經(jīng)停止或近似停止之后進(jìn)行，從而在由此處理的雌性排卵之前優(yōu)化定殖。

在導(dǎo)入噬菌體以轉(zhuǎn)化天然乳桿菌的某些實(shí)施方案中，可以操縱所選噬菌體的核酸，以便異源基因替換編碼噬菌體衣殼蛋白的基因，從而使噬菌體是復(fù)制缺陷的。將這些重組dna分子加入含有功能性噬菌體蛋白的細(xì)胞裂解液，將導(dǎo)致攜帶異源基因的功能性噬菌體顆粒的組裝。隨后這些復(fù)制缺陷型噬菌體顆?？梢员粚?dǎo)入到所需的粘膜表面上以感染所選的細(xì)菌菌群。通常的劑量是施加到粘膜表面的10⁸-10¹²pfu/ml。溶液與處理的表面的比率應(yīng)接近0.1＝1.0ml每平方厘米粘膜表面。運(yùn)載體與上文描述的細(xì)菌運(yùn)載體類(lèi)似。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了避孕的方法，所述方法包括，將雌性生殖道細(xì)胞與本發(fā)明描述的工程化細(xì)菌接觸的步驟。在某些實(shí)施方案中，依據(jù)該方面，所述方法包括，將含有工程化細(xì)菌的組合物(在某些實(shí)施方案中，包括本發(fā)明描述的組合物)施用到有此需要的雌性對(duì)象的生殖道中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供了，將雌性生殖道與本發(fā)明描述的噬菌體接觸，其又導(dǎo)致共生菌群的原位工程化，以獲得本發(fā)明描述的工程化細(xì)菌。

在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“接觸”或“施用”是指直接和間接暴露于所指材料。

在某些實(shí)施方案中，施用到雌性生殖道的劑量可以為10⁵-10⁹個(gè)重組細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，針對(duì)特定宿主或群體優(yōu)化劑量。在某些實(shí)施方案中，此類(lèi)優(yōu)化的劑量可以為10⁷-10⁹個(gè)重組細(xì)菌，或10⁶-10⁸個(gè)重組細(xì)菌，或10⁸-10⁹個(gè)重組細(xì)菌。

證明有效避孕的各種方法是本領(lǐng)域已知的，所有這些方法被認(rèn)為可用于本發(fā)明，其中的某些方法在本文中進(jìn)行了例舉。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)評(píng)價(jià)施用了本發(fā)明避孕藥的雌性動(dòng)物每繁殖周期產(chǎn)生的后代數(shù)，來(lái)確定本發(fā)明生物學(xué)避孕藥的避孕效果。例如，在對(duì)例如小鼠施用生物學(xué)避孕藥1到3天后，將雌性小鼠個(gè)體與雄性小鼠置于籠中。隨后在交配后1-7天之間移走雄性小鼠。然后每天觀(guān)察雌性小鼠的幼崽出生。通過(guò)施用后妊娠的減少和/或每窩產(chǎn)仔數(shù)目的減少來(lái)確定施用的避孕藥的避孕效果。例如對(duì)于每窩平均產(chǎn)生3個(gè)或更多個(gè)后代的動(dòng)物物種(例如，如下文例舉的，當(dāng)使用遠(yuǎn)親雜交品系時(shí)，小鼠平均每窩產(chǎn)生11個(gè)或更多個(gè)后代)，如果妊娠率或每窩產(chǎn)仔數(shù)目降低10％-100％，30％-100％，或50％至100％，或60％-100％，70％-100％，或80％至100％，或90％-100％，或95％-100％，或更多，則避孕蛋白可以被認(rèn)為是有效的。如本發(fā)明中例舉的，當(dāng)評(píng)價(jià)表達(dá)j102的詹氏乳桿菌菌株的避孕效果時(shí)，觀(guān)察到至少50％的避孕效果，而且，由于本文進(jìn)行的定殖研究顯示乳桿菌在約50％的小鼠中良好定殖，因此預(yù)期，已知更易于接受乳桿菌定殖的其他動(dòng)物將具有更高的避孕效果。

如果每窩產(chǎn)仔數(shù)目降低至少50％，則避孕藥被認(rèn)為是有效的，因此，圖7表明產(chǎn)生了有效的生物學(xué)雌性避孕藥，其包括表達(dá)抗精子劑的工程化共生生物。

在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)測(cè)量粘膜分泌物中表達(dá)的抗體的水平來(lái)確定本發(fā)明避孕藥的有效性。也可以，例如在性交后收集的分泌物中，通過(guò)以免疫組化技術(shù)觀(guān)察與精子結(jié)合的抗體來(lái)評(píng)價(jià)避孕藥的有效性。

如本文中例舉的，當(dāng)將表達(dá)抗精子scfv的詹氏乳桿菌定殖到小鼠時(shí)，觀(guān)察到50-58％之間的妊娠率的降低，并且每籠和由此每小鼠產(chǎn)生的后代數(shù)目的同時(shí)降低也很顯著。

在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)抗精子劑的共生生物可以被進(jìn)一步工程化，以表達(dá)有效對(duì)抗被處理雌性中引起性傳播疾病的生物的感染的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，引起性傳播疾病的生物是衣原體，hiv，hpv等等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，有效對(duì)抗被處理雌性中引起性傳播疾病的生物的感染的此類(lèi)試劑，可以干擾所述生物的感染，或在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類(lèi)試劑可以降低感染幾率或感染負(fù)荷。在某些實(shí)施方案中，此類(lèi)試劑可以干擾生物感染的發(fā)病機(jī)制。應(yīng)理解，在該方面設(shè)想了有效對(duì)抗被處理雌性中引起性傳播疾病的生物的感染的任何試劑的進(jìn)一步摻入，并且其被視為本發(fā)明的一部分。

依據(jù)這方面，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的避孕藥可以被視為組合的避孕-抗-std療法。

盡管預(yù)期本發(fā)明的工程化共生生物可以被進(jìn)一步工程化，例如以表達(dá)抗衣原體scfv，或者抗hpv或抗hivscfv，或者其他抗hiv試劑，例如藍(lán)藻抗病毒蛋白(cyanovirin)，但應(yīng)理解，雌性生殖道中野生型乳桿菌定殖的存在提供抗std感染的保護(hù)。還預(yù)期，本發(fā)明的表達(dá)抗精子劑的工程化生物，與單獨(dú)的野生型乳桿菌相比，在降低使用本文描述的此類(lèi)生物的雌性群體中的性傳播疾病的發(fā)生率方面，一樣有效，或在某些實(shí)施方案中，更有效。

應(yīng)當(dāng)理解，適用于本發(fā)明的任何或所有方法的本文描述的任何實(shí)施方案，被視為本發(fā)明的一部分。本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)以引用的方式納入本文，如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被明確和單獨(dú)地指明以引用方式納入本文。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以在其中進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的各種變化，而不背離附屬的權(quán)利要求書(shū)中所示的本發(fā)明的精神和范圍。通過(guò)使用不超過(guò)常規(guī)的試驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠確認(rèn)本文描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同形式。此類(lèi)等同形式意欲包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍中。

應(yīng)理解，除非有相反指示或者根據(jù)上下文可以明顯得出，否則本文中涉及物品的詞如“a”“an”和“the”表示一個(gè)或多于一個(gè)。除非有相反指示或者根據(jù)上下文可以明顯得出，否則如果一個(gè)，多于一個(gè)，或所有組成員存在于，用于，或以其他方式與給定的產(chǎn)品或方法相關(guān)，那么在組的成員間包括“或”或者“和/或”的權(quán)利要求或描述被認(rèn)為是滿(mǎn)足的。本發(fā)明包括這樣的實(shí)施方案，其中確切的一個(gè)組成員存在于，用于，或以其他方式與給定的產(chǎn)品或方法相關(guān)。本發(fā)明也包括這樣的實(shí)施方案，其中多于一個(gè)或全部的組成員存在于，用于，或以其他方式與給定的產(chǎn)品或方法相關(guān)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，除非另外指出或除非其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯引起矛盾或不一致，否則本發(fā)明在各種實(shí)施方案中提供了所有的變化，組合，及排列，其中來(lái)自一個(gè)或多個(gè)所列的權(quán)利要求的一個(gè)或多個(gè)限定，要素，子句，描述性術(shù)語(yǔ)等被引入從屬于相同基礎(chǔ)權(quán)利要求的另一個(gè)權(quán)利要求。當(dāng)要素以列表(如馬庫(kù)什形式等)存在時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，要素的每個(gè)亞組也被公開(kāi)，并且可以從組中移除任何要素。應(yīng)當(dāng)理解，通常，當(dāng)發(fā)明或發(fā)明的方面被稱(chēng)為包含特定要素，特征等時(shí)，本發(fā)明的某些實(shí)施方案或本發(fā)明的某些方面由或基本上由這樣的要素，特征等組成。為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，在本發(fā)明的言語(yǔ)中未明確陳述這些實(shí)施方案的每一種情況。為方便起見(jiàn)，某些權(quán)利要求以從屬權(quán)利要求的形式存在，但申請(qǐng)人保留以獨(dú)立權(quán)利要求的形式重寫(xiě)任何從屬權(quán)利要求(以包括該權(quán)利要求所從屬的獨(dú)立權(quán)利要求和任何其他權(quán)利要求的要素或限定)的權(quán)利，并且這樣重寫(xiě)的權(quán)利要求被認(rèn)為在所有方面等同于從屬權(quán)利要求，無(wú)論其在以獨(dú)立權(quán)利要求的形式重寫(xiě)之前是何種形式(修改或未修改的)。

下文意欲以舉例說(shuō)明的目的提供材料，方法和實(shí)施例(作為實(shí)施/執(zhí)行本發(fā)明的方式)，而不意欲是限制性的。

實(shí)施例

一般來(lái)說(shuō)，本文使用的術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)方法包括分子，生化，微生物和重組dna技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)已在文獻(xiàn)中得到詳細(xì)解釋。參見(jiàn)例如，"molecularcloning:alaboratorymanual"sambrook等，(1989)；"currentprotocolsinmolecularbiology"volumesi-iiiausubel，r.m.，編.(1994)；ausubel等，"currentprotocolsinmolecularbiology"，johnwiley和sons，baltimore，maryland(1989)；perbal，"apracticalguidetomolecularcloning"，johnwiley&sons，newyork(1988)；watson等，"recombinantdna"，scientificamericanbooks，newyork；birren等(編)"genomeanalysis:alaboratorymanualseries"，vols.1-4，coldspringharborlaboratorypress，newyork(1998)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中描述的方法；"cellbiology:alaboratoryhandbook"，volumesi-iiicellis，j.e.，編(1994)；"currentprotocolsinimmunology"vplumesi-iiicoliganj.e.，編(1994)；stites等(編)，"basicandclinicalimmunology"(第八版)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishell和shiigi(編)，"selectedmethodsincellularimmunology"，w.h.freeman和co.，newyork(1980)；可使用的免疫測(cè)定法在專(zhuān)利和科技文獻(xiàn)中得到廣泛描述，參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"oligonucleotidesynthesis"gait，m.j.，編(1984)；"nucleicacidhybridization"hames，b.d.，和higginss.j.，編(1985)；"transcriptionandtranslation"hames，b.d.和higginss.j.編(1984)；"animalcellculture"freshney，r.i.，編(1986)；"immobilizedcellsandenzymes"irlpress，(1986)；"apracticalguidetomolecularcloning"perbal，b.，(1984)；以及"methodsinenzymology"vol.1317，academicpress；"pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications"，academicpress，sandiego，ca(1990)；marshak等，"strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)，所有這些文獻(xiàn)以引用方式納入本文，如同在本文中進(jìn)行了完整的描述。其他的一般參考在本文件中提供。其中的方法被認(rèn)為是本領(lǐng)域公知的并被提供以方便讀者。其中包含的所有信息以引用方式納入本文。

實(shí)施例1

抗人精子抗體的制備

通過(guò)將p3-x63-ag8-653小鼠骨髓瘤細(xì)胞與來(lái)自balb/c小鼠(其用tergitolnp-40去垢劑溶解的人附睪精子免疫)的淋巴細(xì)胞融合，來(lái)制備抗人精子抗原的單克隆抗體。在間接免疫熒光法中，就對(duì)甲醇固定的精子是頂體陽(yáng)性的和對(duì)未固定的精子是質(zhì)膜陽(yáng)性的，測(cè)試得自注射了這些雜交瘤的小鼠的腹水。驗(yàn)證抗體與鼠和兔精子的交叉反應(yīng)性。

如所述的(naz，r.k.等procnatlacadsciusa(1986)83(15)：5713-7)，通過(guò)使用單克隆抗體ma-24的免疫親和層析，從脫氧膽酸或者二碘水楊酸鋰溶解的小鼠睪丸中純化受精抗原，fa-1。如上制備另外的抗fa-1單克隆抗體，并且也驗(yàn)證其與人和兔精子的交叉反應(yīng)性。

實(shí)施例2

抗人精子抗體的克隆

rna制備：

選擇分泌殺精子或減少精子細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的抗體的雜交瘤細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，以便使用fasttrack2.0試劑盒(invitrogen)處理1千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以收集rna。使用去垢劑裂解和蛋白降解緩沖液從細(xì)胞中直接分離總rna。隨后使用其中mrna結(jié)合到oligodt樹(shù)脂上的修改的aviv和leder方案分離poly(a)+rna。隨后用低鹽緩沖液清洗樹(shù)脂以去除多余的總rna，且poly(a)+rna被從樹(shù)脂上洗脫。260nm和280nm處的光譜分析指示poly(a)+rna的終濃度。

poly(a)+rna的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增

鑒定抗體的表位識(shí)別區(qū)域和互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，并設(shè)計(jì)作為探針檢測(cè)ig重鏈和輕(κ)鏈亞單位的寡核苷酸。

重鏈寡核苷酸獲自ig-prime試劑盒(novagen)，并用dh2o稀釋到1.0μg/μl的終濃度。

使用promega的accessrt-pcr系統(tǒng)在單個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行各雜交瘤poly(a)+rna的反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。簡(jiǎn)言之，將5μg雜交瘤poly(a)+rna，1μg每條適合的引物(用于重鏈的引物1和2，用于輕鏈的引物3和4)，1μl10mmdntp混合物，10μl5×amv反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μl25mmmgso4，1μlamv反轉(zhuǎn)錄酶，1μltfl聚合酶和30μl無(wú)核酸酶的dh2o在0.5ml的微量離心管中混合。依照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行pcr反應(yīng)并優(yōu)化循環(huán)溫度和時(shí)間。在瓊脂糖凝膠上分析擴(kuò)增的產(chǎn)物，并進(jìn)行凝膠純化。

抗體克隆和測(cè)序

將經(jīng)凝膠純化的產(chǎn)物亞克隆到適合的載體上，所述載體產(chǎn)生高產(chǎn)量的產(chǎn)物。將載體，緩沖液，cdna和t4dna連接酶在室溫下孵育1小時(shí)，并隨后在65℃加熱10分鐘。使用超級(jí)感受態(tài)(supercometent)大腸桿菌細(xì)胞，將dna加入到細(xì)胞中并在冰上孵育，隨后在42℃加熱，并加入soc培養(yǎng)基。隨后細(xì)胞在37℃搖動(dòng)水浴中孵育1小時(shí)。然后將這些細(xì)胞涂布在含選擇化合物的lb皮氏培養(yǎng)皿上并在37℃孵育過(guò)夜。選擇陽(yáng)性克隆并培養(yǎng)以純化質(zhì)粒。

依照制造商說(shuō)明書(shū)，使用qiagen-tip20柱純化質(zhì)粒。

為了確認(rèn)cdna插入物在純化的質(zhì)粒中的存在，以適合的限制性?xún)?nèi)切酶消化每個(gè)克隆，并且將消化產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳。對(duì)含有插入物的克隆進(jìn)行測(cè)序。

重鏈和輕鏈克隆的序列分析

依照制造商說(shuō)明書(shū)，使用fidelity試劑盒(oncor)測(cè)序陽(yáng)性克隆。測(cè)序反應(yīng)物由質(zhì)粒dna，引物(如位于pcr-script載體5’克隆位點(diǎn)上游的t3引物)，和dh2o組成，其被加熱到95℃5分鐘，加入退火緩沖液，隨后反應(yīng)物在37℃孵育15分鐘。通過(guò)添加反應(yīng)緩沖液，³³pαatp，t4dna聚合酶和dh2o來(lái)標(biāo)記反應(yīng)物，并在400℃孵育15分鐘，隨后加入a，c，g或t終止混合物并在40℃孵育5分鐘。通過(guò)加入蛋白酶k溶液來(lái)終止反應(yīng)，并在加載于丙烯酰胺測(cè)序凝膠上之前將其加熱到95℃。凝膠隨后在2000伏下電泳2小時(shí)，在whatman3mm濾紙上在真空下干燥，并在室溫下暴露至x射線(xiàn)膠片過(guò)夜。在膠片顯影后，在燈箱上判讀凝膠。

也可以使用自動(dòng)化dna測(cè)序儀(如abiprism377)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于每個(gè)克隆，將cdna和引物與四種染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸以及amplitaq聚合酶fs混合。將整個(gè)反應(yīng)物加載到單個(gè)泳道中，在36cm便于讀取的5.0％丙烯酰胺凝膠上電泳。用激光掃描與ccd相機(jī)成像來(lái)實(shí)現(xiàn)單獨(dú)的電泳片段的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

表達(dá)載體的構(gòu)建

獲得如mccrackena.等(2000)arch.microbial.173：383-389；perez-casal，j.等(2003)mol.microbiol.8：809-819；krugerc.等(2002)naturebiotechnology20：702-706；rao，s.等(2005)pnas102：11993-11998；liux.等(2006)antimicrobialagentsandchemotherapy50：3250-3259；delriob.等(2008)clinicalandvaccineimmunology15：1429-1435；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,312,076，或歐洲專(zhuān)利號(hào)1011721b1中描述的表達(dá)載體，或者其變體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備。

可選地，如下構(gòu)建載體：

通過(guò)將大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)從pbluescript亞克隆到骨架載體(fons，m.，等(1997)plasmid37，199-203)中，并隨后去除全長(zhǎng)的m6編碼區(qū)(psti)來(lái)創(chuàng)建穿梭載體。將該質(zhì)粒用smai消化，用ndei部分消化，用dna聚合酶i(klenow片段)填充并自連接。得到的質(zhì)粒含有與乳桿菌兼容的復(fù)制起點(diǎn)(repa)和陽(yáng)性選擇標(biāo)記，如抗生素抗性基因，并已用于在多種乳桿菌物種中表達(dá)異源蛋白。

將擴(kuò)增的抗體片段克隆入載體

將對(duì)應(yīng)于重鏈和輕鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠純化并重懸浮于dh2o中。可以通過(guò)組裝pcr(stemmerw.p.等，(1995)gene164：49-53)重新編碼(recode)抗體，以更密切符合最佳乳桿菌密碼子使用。

通過(guò)pcr擴(kuò)增來(lái)構(gòu)建表達(dá)盒，并將其亞克隆入載體的適合位點(diǎn)。表達(dá)盒含有四種組件，包括乳桿菌兼容性啟動(dòng)子元件，抗體片段，用于分泌的信號(hào)序列或細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域。在每種組件之間從5'到3'端分別放置獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。通過(guò)使用pfudna聚合酶來(lái)進(jìn)行每個(gè)組件的pcr擴(kuò)增。通過(guò)用5'-gtggagctccccgaaaagccctgacaaccc-3'和5'-ggaaacacgctagcactaacttcatt-3'引物擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生來(lái)自乳酸乳球菌(lactococcuslactis)的p23啟動(dòng)子(vandervossen，j.m.，等(1987)appl.environ.microbiol.53，2452-2457)。為指導(dǎo)抗體的分泌，設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增在5'和3'末端分別具有獨(dú)特位點(diǎn)的，從推定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)到信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)的卷曲乳桿菌s-層基因(cbsa)序列。隨后，對(duì)應(yīng)于mkknlrivsaaaaallavapvaa的擴(kuò)增的s-層信號(hào)核苷酸序列(cbsass)被消化并用于克隆到表達(dá)盒中。

將產(chǎn)物連接到載體中，將taa終止密碼子插入到錨定基序的n-末端以確保分泌。在轉(zhuǎn)化到乳桿菌菌株中之前進(jìn)行序列驗(yàn)證。

乳桿菌轉(zhuǎn)化

細(xì)菌菌株和培養(yǎng)。卷曲乳桿菌，格氏乳桿菌(l.gasseri)和詹氏乳桿菌等的天然發(fā)生的人陰道分離株可以從健康志愿者的陰道拭樣獲得，或者可選地，可以使用商業(yè)上可獲得的菌株，將其在37℃(5％co2/95％空氣)下用deman，rogosaandsharpe(mrs)培養(yǎng)基或rogosasl培養(yǎng)基(difco)培養(yǎng)。對(duì)于蛋白表達(dá)分析，也使用medium199(invitrogen)。通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌dh12s(invitrogen)中。為了保持質(zhì)粒，在37℃將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌dh12s在補(bǔ)充了紅霉素(300μg/ml)的lb培養(yǎng)基(difco)中培養(yǎng)?；旧先鐚?duì)于格氏乳桿菌所描述的(luchansky，j.b.，tennant，m.c.&k1aenhammer，t.r.(1991)j.dairysci.74，3293-3302)，通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入詹氏乳桿菌中。轉(zhuǎn)化的詹氏乳桿菌在含有20μg/ml紅霉素的液體培養(yǎng)基中常規(guī)地增殖。

如下文所述探測(cè)工程化乳桿菌的抗精子活性。

實(shí)施例3

一系列抗精子scfv的產(chǎn)生

文庫(kù)構(gòu)建

使用人scfv絲狀噬菌體展示文庫(kù)，以分離抗精子蛋白的人vh-vl緊密聯(lián)系(tethered)的可變結(jié)構(gòu)域。使用根據(jù)在vbase(http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk)獲得的序列而設(shè)計(jì)的引物并按照barbas&lerner(barbas，bain等1992procnatlacadsciusa89(10)：4457-61；gram，marconi等1992procnatlacadsciusa89(8)：3576-80；zebedee，barbas等1992procnatlacadsciusa89(8)：3175-9；barbas，amberg等1993gene137(1)：57-62)，winter(hawkins，russell等1992jmolbiol226(3)：889-96；hawkins和winter1992eurjimmunol22(3)：867-70；hoogenboom，marks等1992immunolrev130：41-68；hoogenboom和winter1992immunolrev130：41-68；marks，griffiths等，1992biotechnology(ny)10(7)：779-83；marks，hoogenboom等，1992jbiolchem267(23)：16007-10；marks和winter1992behringinstmitt(91)：6-12；orlandi，gussow等，1992biotechnology24：527-31；tomlinson，walter等1992jmolbiol227(3)：776-98)和benhar實(shí)驗(yàn)室(azriel-rosenfeld，valensi等2004jmolbiol335(1)：177-92)之前描述的技術(shù)來(lái)制備人scfv文庫(kù)。使用人脾臟和外周血淋巴細(xì)胞cdna作為模板，進(jìn)行抗體基因的pcr擴(kuò)增。在該文庫(kù)中，人重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的庫(kù)被以組合的方式聯(lián)系在一起，以產(chǎn)生所有可能的vh-vl人工結(jié)合分子的組合，所述人工結(jié)合分子與m13絲狀噬菌體p3基因融合，隨后融合的蛋白在噬菌體表面上展示(通常平均每個(gè)噬菌體單個(gè)拷貝)。

精子抗原

分別從精子抗原fa-1和ylp(12)設(shè)計(jì)肽。下面的肽1是從抗原fa-1設(shè)計(jì)的35個(gè)殘基的肽，而下面的肽2是ylp(12)肽。所述肽被生物素化以易于與下面所述方法中的磁珠結(jié)合。由于肽序列相對(duì)較短，肽2在生物素與肽之間加入了連接物。如下文所述，針對(duì)兩種肽篩選噬菌體展示scfv文庫(kù)。

抗體篩選

文庫(kù)儲(chǔ)備物在lb+amp(100μg/ml)+1％葡萄糖中在37℃下培養(yǎng)。加入助手噬菌體m13ko7，并且培養(yǎng)物與助手噬菌體一起在100μg/mlamp+30μg/mlkan存在下在30℃孵育過(guò)夜。以4000rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物10分鐘，上清通過(guò)0.45微米過(guò)濾器過(guò)濾，加入1/5體積的peg/nacl，將濾液置于冰上最少1小時(shí)，隨后以4000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘，之后將含噬菌體的沉淀物懸浮于pbs中。以4％bsa封閉噬菌體最少30分鐘，并按照r.kontermann和s.dubel(編)，antibodyengineeringvol.1，springer-verlagberlinheidelberg2010,pages267-287中描述的方案，完成基于磁珠的抗體選擇。以2％bsa進(jìn)行封閉最少30分鐘。將封閉的珠粒加入封閉的噬菌體中，然后取出珠粒，由此取出結(jié)合鏈霉親和素的所有噬菌體。隨后將封閉的噬菌體與生物素孵育30分鐘，接著與珠粒孵育30分鐘，之后棄去珠粒。

將噬菌體與下列肽孵育1小時(shí)：

acgvsrpviacsvtikegsqlkqqiqsiqqsierl(seqidno：1)-----生物素；和ylpvgglrrigg(seqidno：2)----ahx---并隨后與珠粒孵育30分鐘，清洗并洗脫。隨后將中和的洗脫液與dh5αf+細(xì)胞在37℃混合60分鐘并在lb+100μg/mlamp+1％葡萄糖平板上培養(yǎng)過(guò)夜。淘選的步驟被重復(fù)多個(gè)循環(huán)。

抗體片段特異性

使用肽作為探針進(jìn)行elisa測(cè)定，并通過(guò)o.d.評(píng)估片段相對(duì)親和力。

將用淘選出的噬菌體(如上所述)感染的大腸桿菌tg-1鋪板以產(chǎn)生個(gè)體菌落。將這些菌落挑入平底無(wú)菌96孔板的孔中的100μlytag培養(yǎng)基中并在30℃，以150rpm搖動(dòng)培養(yǎng)。將10μl噬菌體轉(zhuǎn)移到含有90μlytag+2.5μl/ml(5x10⁸cfu)m13ko7助手噬菌體的新鮮96孔板中，并在37℃在不搖動(dòng)的情況下培養(yǎng)30分鐘，隨后以150rpm搖動(dòng)培養(yǎng)30分鐘。板在4000rpm，14℃下離心5分鐘，棄去上清。加入200μl/孔的ytak(含有卡那霉素)并將板在30℃，150rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。隨后細(xì)菌平板在4000rpm，4℃下離心5分鐘，然后將與100μlpbst混合的100μl上清用于elisa。

將100μl/孔的抗原和對(duì)照抗原鋪于elisa平板上4℃過(guò)夜，以包被平板。elisa平板用清洗緩沖液(300μl/孔的pbst)清洗一次，并用3％牛奶/pbs在室溫下(rt)封閉1小時(shí)。平板用清洗緩沖液清洗一次。隨后向平板中加入噬菌體并在室溫下孵育1小時(shí)，接著以清洗緩沖液清洗3次。加入50-100μl/孔的hrp綴合的抗噬菌體，稀釋的抗m13噬菌體抗體，并在室溫孵育1小時(shí)。在用清洗緩沖液清洗3次之后，加入100μl/孔的opd底物溶液，在室溫下孵育20分鐘。隨后以50ml1mhcl溶液終止反應(yīng)，在450nm處讀板。使用辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的抗噬菌體抗體實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，使用自動(dòng)化elisa讀取器讀取從底物-酶反應(yīng)得到的顏色。

另一個(gè)elisa方案用2μg/mlbsa-生物素(在pbs中)在室溫下包被平板2小時(shí)。平板用pbst清洗并隨后用2μg/ml鏈霉親和素(在pbs中)在室溫下包被2小時(shí)，并再次用pbst清洗。平板隨后用2μg/ml的肽在pbs中在4℃包被過(guò)夜，用pbst清洗一次并用3％牛奶/pbs溶液在37℃封閉1小時(shí)，該方案的其余部分與上述方案相同，除了平板用50μl/孔的在sddw中稀釋4倍的tmb(四甲基聯(lián)苯胺)終止試劑顯影，并在5分鐘后用50μl/孔的1mh2so4終止之外。

結(jié)果

圖1以圖形方式描述了分離并克隆的噬菌體展示的scfv對(duì)用作探針的精子肽的相對(duì)親和力。1-3列顯示了三種scfv與源于fa-1的肽的結(jié)合，而4-6列顯示了三種scfv與源于ylp(12)的肽的結(jié)合。bsa被用作陰性結(jié)合對(duì)照。與對(duì)照相比，所述scfv顯示出顯著的對(duì)所指示的肽的親和力。圖2描述了分離并克隆的某些噬菌體展示的scfv對(duì)用作探針的精子肽的相對(duì)親和力。圖3顯示了鑒定一系列非結(jié)合scfv的elisa結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，這些非結(jié)合scfv隨后被用作對(duì)照。在本文中，通常使用一個(gè)這樣的scfv克隆，j112?？寺102顯示出比其他克隆以及對(duì)照a和b更大的親和力，對(duì)照a和b分別為不含有scfv噬菌體，或不含有肽和scfv的樣品。通過(guò)測(cè)量用抗噬菌體hrp標(biāo)記的抗體(抗pviii的抗體)探測(cè)的樣品中的od來(lái)檢測(cè)結(jié)合。這些scfv中的一些隨后用于下面的實(shí)施例中，按照其所適合的，用作對(duì)照和避孕藥。

實(shí)施例4

表達(dá)scfv的工程化乳桿菌

抗體克隆和測(cè)序

按照既有方案，通過(guò)用ncoi和noti酶切消化，將scfv從噬菌?；蚪M中釋放，以在噬菌體克隆中展示完整的scfv片段。將凝膠純化的產(chǎn)物亞克隆到dr.josseegers饋贈(zèng)的pslp111.1載體中，其產(chǎn)生高產(chǎn)量的產(chǎn)物。圖4a中提供了載體的圖譜。通過(guò)用獨(dú)特的引物pcr擴(kuò)增scfv來(lái)進(jìn)行亞克隆，所述引物在5'引物上含有ncoi限制性位點(diǎn)而在3'引物上含有asci位點(diǎn)(5'-gcgccatggccgaggtgcagctgttg，3'-gcgggcgcgccccagcacagtgagtttggtccc)。凝膠純化擴(kuò)增的dna，并且通過(guò)用ncoi和asci切割來(lái)激活限制性位點(diǎn)。隨后，限制性酶切的dna片段被再次凝膠純化，并且被連接到(使用t4連接酶)之前已用ncoi和asci酶切并凝膠純化的pslp111.1載體上。連接化合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，所述大腸桿菌dh5α用氯化鈣技術(shù)(maniatis)制備為感受態(tài)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于lb瓊脂氯霉素平板上(10微克/ml)，在孵育過(guò)夜后挑取菌落，并且從24個(gè)菌落中制備質(zhì)粒dna。使用qiagenminiprep質(zhì)粒試劑盒從這些菌落中制備質(zhì)粒dna，并用ncoi和asci進(jìn)行酶切，以鑒定含有適合大小的dna插入物的菌落。隨后如下文所述，將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到詹氏乳桿菌中。

依照制造商說(shuō)明書(shū)，使用qiagen-tip20柱純化質(zhì)粒。

為了確認(rèn)cdna插入物在純化的質(zhì)粒中的存在，以ncoi-asci消化每個(gè)克隆，并且將消化的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳。對(duì)含有插入物的克隆進(jìn)行測(cè)序。

重鏈和輕鏈克隆的序列分析

通過(guò)weizman研究所的測(cè)序服務(wù)來(lái)測(cè)序陽(yáng)性克隆，其中以按照制造商說(shuō)明書(shū)的所有條件和試劑使用abi自動(dòng)測(cè)序儀。使用的初始測(cè)序引物為：

正向ccatgattacgccaagcttgggagcc(seqidno：9)

反向gaattcaaccttcaaattgcc(seqidno：10)

將擴(kuò)增的抗體片段克隆入載體

將凝膠純化的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆入載體的適合位點(diǎn)。表達(dá)盒含有四個(gè)組件，包括與乳桿菌兼容的啟動(dòng)子元件，抗體片段，用于分泌的信號(hào)序列或細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域。

在轉(zhuǎn)化入乳桿菌菌株之前，進(jìn)行序列驗(yàn)證。

乳桿菌轉(zhuǎn)化

使用編號(hào)25258的詹氏乳桿菌菌株atcc人陰道分離株，并將其在37℃(5％co2/95％空氣)下用deman，rogosaandsharpe(mrs)培養(yǎng)基(difco)培養(yǎng)。通過(guò)氯化鈣技術(shù)將含有插入片段的pslp111.1導(dǎo)入詹氏乳桿菌。轉(zhuǎn)化的詹氏乳桿菌在含有10μg/ml紅霉素的液體培養(yǎng)基中常規(guī)地增殖。

精子結(jié)合和運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

按照既有的方案分離小鼠精子[liuz等,journalofbiologicalchemistry(2010)285,2758-2770]。將10⁶個(gè)精子懸于錐形管里的精子緩沖液(ham'sf-10，補(bǔ)充有21mmhepes；4mm碳酸氫鈉；0.6％人血清白蛋白；3.6ml乳酸鈉(60％儲(chǔ)備液)和慶大霉素：10微克/ml)中，以促進(jìn)其游到管頂部的能力的方式保存精子，其中通過(guò)取出小體積(數(shù)百微升)的緩沖液來(lái)收集能動(dòng)的精子。通過(guò)血球計(jì)數(shù)器驗(yàn)證精子計(jì)數(shù)，并以1:1或1:2的精子:乳桿菌(cfu)的比率孵育精子。

分離小鼠精子，并通過(guò)使用噬菌體展示scfv的結(jié)合測(cè)定來(lái)評(píng)估scfv與精子的結(jié)合。如上所述的游動(dòng)測(cè)定用于選擇能動(dòng)的精子，其被分離并置于腔室玻片中，風(fēng)干，隨后將含有目的scfv的噬菌體(10⁸)應(yīng)用于腔室中，并孵育1小時(shí)，清洗，隨后用以1:200稀釋的連接至hrp的抗-cp8抗體(enco，israel)探測(cè)精子，隨后清洗腔室，并以dab和過(guò)氧化物顯影。

結(jié)果

圖4b顯示了質(zhì)粒的ncoi和noti消化產(chǎn)物。以ncoi-和noti在37℃酶切質(zhì)粒3小時(shí)。

發(fā)現(xiàn)一種實(shí)施的scfv，j102具有對(duì)高度保守的精子抗原的高結(jié)合親和力。測(cè)序該克隆得到了如圖5a-5b中所示的完整dna和蛋白序列(seqidno：7-8)。

就與人和鼠精子的結(jié)合探測(cè)scfvj102等。盡管scfvj102是來(lái)自人的片段，但fa-1抗原的物種間的高度保守性導(dǎo)致j102能與鼠和人精子結(jié)合，如體外測(cè)定所確定的。圖6a顯示了表達(dá)scfv的乳桿菌與小鼠精子的顯著結(jié)合，其中幾乎每一個(gè)評(píng)價(jià)的精子細(xì)胞都顯示出顯著的染色，然而表達(dá)抗非精子抗原的scfv的對(duì)照乳桿菌未與鼠精子顯著結(jié)合(圖6b)。人精子結(jié)合研究與小鼠中的發(fā)現(xiàn)一致(數(shù)據(jù)未顯示)。

如上文方法部分中所描述的，以人精子進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性研究。雖然表達(dá)無(wú)關(guān)對(duì)照的乳桿菌在體外顯示對(duì)精子運(yùn)動(dòng)性的中度影響，但是當(dāng)使用表達(dá)結(jié)合精子的scfv的乳桿菌時(shí)，觀(guān)察到削弱精子運(yùn)動(dòng)性的顯著效果，其包括在檢測(cè)scfvj102的效果的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，運(yùn)動(dòng)性降低了50％，這表明了表達(dá)結(jié)合精子的scfv的乳桿菌干擾精子功能的潛力。

實(shí)施例5

工程化詹氏乳桿菌的抗精子活性

受精的抑制

將各個(gè)物種的10⁵個(gè)精子在相關(guān)和對(duì)照抗體(以1:50，1:5或1:1稀釋)，或者產(chǎn)生對(duì)照和相關(guān)抗體的構(gòu)建體的溶液中冷孵育過(guò)夜，然后加入卵子，此時(shí)允許精子與卵子的結(jié)合進(jìn)行1小時(shí)。隨后清洗卵子，確定每個(gè)卵子結(jié)合的精子的數(shù)量，并將其表示為與對(duì)照樣品結(jié)合的精子數(shù)的百分?jǐn)?shù)。進(jìn)一步評(píng)價(jià)具有最大抑制百分?jǐn)?shù)的構(gòu)建體。

體內(nèi)受精抑制研究

將純化的相關(guān)抗體片段，純化的對(duì)照抗體片段，表達(dá)相關(guān)抗體片段的工程化乳桿菌，和表達(dá)對(duì)照抗體片段的工程化乳桿菌注入雌性(小鼠，兔)陰道內(nèi)。在將各種試劑施用到雌性陰道內(nèi)后的多個(gè)點(diǎn)將1只雄性與2-4只雌性關(guān)在一起。分組后24小時(shí)，每日目視檢查雌性中陰道栓的存在。標(biāo)記雌性以在它們之間進(jìn)行區(qū)分(例如通過(guò)連續(xù)耳部打孔)和任選地，在交配開(kāi)始后兩周，將雌性移到單獨(dú)的籠中。3周后，計(jì)數(shù)產(chǎn)仔的懷孕雌性和后代。隨后選擇具有最大避孕活性的構(gòu)建體并進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)/優(yōu)化。

如下進(jìn)行融合抑制測(cè)定。年輕雌性小鼠(8-10周齡)被腹膜內(nèi)注射5個(gè)單位的在0.9％nacl中的孕馬血清(pms)。48小時(shí)后，小鼠被腹膜內(nèi)注射5個(gè)單位的在0.9％nacl中的hcg(人絨毛膜促性腺激素)以觸發(fā)超排卵。注射hcg14-16小時(shí)后，收集排出的卵母細(xì)胞并用透明質(zhì)酸酶處理以去除卵丘細(xì)胞。用蛋白酶混合物去除透明帶。將無(wú)透明帶的卵子在培養(yǎng)基中與指定濃度的肽孵育30分鐘[hogan,b.等，manipulatingthemouseembryo,91-101，(1986)]。從雄性小鼠附睪收集的精子通過(guò)孵育來(lái)催熟，并如fleming和yanagimachi[gameteres.4，253-273(1981)]所述進(jìn)行頂體反應(yīng)，然后在對(duì)照和相關(guān)抗體，和表達(dá)對(duì)照和相關(guān)抗體的構(gòu)建體的存在下被加入到卵子中，并孵育15分鐘。隨后卵子被轉(zhuǎn)移到無(wú)精子培養(yǎng)基中，并孵育另外1小時(shí)45分鐘。隨后如primakoff等[j.cell.biol.104，141(1987)]所述，固定并染色卵子。隨后計(jì)數(shù)膨脹的精子頭部的總數(shù)。膨脹的精子頭部是精子和卵子已經(jīng)融合的標(biāo)志。

基于這些觀(guān)察，計(jì)算若干指數(shù)。通過(guò)將膨脹的頭部的總數(shù)除以卵子的總數(shù)來(lái)確定受精指數(shù)(f.i.)。受精率(f.r.)為受精的卵子的百分?jǐn)?shù)。通過(guò)將實(shí)驗(yàn)肽的受精指數(shù)除以對(duì)照肽的受精指數(shù)來(lái)確定抑制百分?jǐn)?shù)。選擇具有最大活性的構(gòu)建體。

實(shí)施例6

用作有效避孕藥的工程化的詹氏乳桿菌

按照實(shí)施例4中描述的方法，檢測(cè)其他動(dòng)物物種。評(píng)價(jià)了兔，大鼠，豚鼠，迷你豬，猴子和其他物種。在該情況下，評(píng)價(jià)了數(shù)種構(gòu)建體，并且注意動(dòng)物物種的差異。在每個(gè)動(dòng)物品系中確定每種構(gòu)建體的有效性百分?jǐn)?shù)。

此外，使用從驗(yàn)證了繁殖力的雄性獲得的精液，對(duì)每個(gè)物種進(jìn)行aif，其中評(píng)估了精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)性。陰道內(nèi)施用表達(dá)相關(guān)和對(duì)照抗體片段的乳桿菌，并在施用后的不同時(shí)間進(jìn)行aif。在人工授精時(shí)，通過(guò)注射例如100iuhcg來(lái)誘導(dǎo)排卵。在排卵和人工授精后，允許雌性完成懷孕過(guò)程以評(píng)估其潛在的致畸效果。

評(píng)價(jià)給雌性施用的乳桿菌對(duì)照和表達(dá)相關(guān)抗體片段的乳桿菌在生殖道中的持久性。

為此，通過(guò)將無(wú)菌pbs反復(fù)吹吸入陰道口來(lái)收集陰道分泌物。通過(guò)在微量離心機(jī)中短暫旋轉(zhuǎn)來(lái)混合液體和粘液，測(cè)定上清液中scfv的存在。通過(guò)elisa確定血清和陰道清洗物中的抗精子抗體片段的滴度。

進(jìn)行時(shí)間進(jìn)程研究。將施用了乳桿菌的雌性重復(fù)地與雄性關(guān)在一起，并評(píng)估妊娠率/避孕效果，將其作為施用后時(shí)間的函數(shù)。

實(shí)施例7

表達(dá)結(jié)合精子的scfv的詹氏乳桿菌是小鼠的有效避孕藥

小鼠施用和交配研究

用0.1ml/gm體重的氯胺酮溶液(濃度100mg/ml)，0.5ml賽拉嗪(濃度20mg/ml)和8.5ml0.9％生理鹽水麻醉雌性icr小鼠。隨后麻醉的小鼠被陰道內(nèi)施以10⁸個(gè)新鮮培養(yǎng)的指數(shù)中期的(通過(guò)od來(lái)確定)工程化詹氏乳桿菌j102或?qū)φ誮112株。(n＝12只小鼠每組)。施用之后，雌性被保持仰面，骨盆向上傾斜30-60分鐘。每日給雌性施用乳桿菌，進(jìn)行3天，隨后與年齡匹配的icr品系雄性交配。將雄性與雌性關(guān)在一起7天，在此期間將雄性每隔一天輪換，然后移走。然后目視評(píng)估雌性中栓的存在，記錄懷孕的小鼠的數(shù)目和每籠產(chǎn)生的后代的數(shù)目。

小鼠定殖研究

在第一次陰道內(nèi)施用后12到24小時(shí)之間，雌性被以拭子擦拭或灌洗陰道，并將回收的樣品/液體涂布在含氯霉素的mrs平板上并在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。菌苔的存在用作陰道定殖的指示。

結(jié)果

小鼠定殖研究表明，高達(dá)50％的灌洗液產(chǎn)生了菌苔，這表明，在單次陰道內(nèi)施用后，高達(dá)50％的小鼠中發(fā)生了定殖。在通過(guò)擦拭來(lái)顯示定殖的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，施用的乳桿菌的陰道內(nèi)持久性高至施用后5天。

進(jìn)行兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，其中雌性被施以表達(dá)抗精子scfv的詹氏乳桿菌或?qū)φ站?，并且在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，都證實(shí)了有效的避孕(圖7a)。雖然在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，92％的對(duì)照雌性懷孕，但是用表達(dá)抗精子scfv的詹氏乳桿菌處理的雌性顯示出妊娠率的明顯降低(58％或50％)。

作為施用表達(dá)抗精子scfv的詹氏乳桿菌的結(jié)果，總后代數(shù)目和每籠的后代數(shù)目，與對(duì)照相比，也降低(圖7b)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，被處理的雌性中每只小鼠的后代數(shù)目也降低。

實(shí)施例8

生物學(xué)避孕藥的安全性

評(píng)價(jià)工程化乳桿菌對(duì)陰道應(yīng)激性的影響。以乳桿菌陰道內(nèi)處理動(dòng)物例如小鼠，每日一次，進(jìn)行連續(xù)10-30天。隨后處死動(dòng)物，并通過(guò)肉眼和顯微鏡檢查生殖道。

檢查陰道組織的上皮潰瘍，水腫，白細(xì)胞浸潤(rùn)和血管充血，將其作為導(dǎo)入乳桿菌，和表達(dá)對(duì)照和相關(guān)抗體的工程化乳桿菌的函數(shù)。將用工程化乳桿菌處理的動(dòng)物與施用了天然分離株的動(dòng)物，以及未處理的動(dòng)物相比較。如果存在的話(huà)，將注意到生殖道組織學(xué)的改善。

實(shí)施例9

避孕藥的可逆性

盡管重復(fù)交配但仍然沒(méi)有妊娠(由于施用乳桿菌)的雌性動(dòng)物被施以抗生素并進(jìn)行交配。評(píng)價(jià)妊娠，作為工程化乳桿菌的可逆性的量度。類(lèi)似地，評(píng)價(jià)動(dòng)物生殖道中乳桿菌的持久性。在指示工程化乳桿菌群體的減少或消失后，將動(dòng)物進(jìn)行交配，并確定它們的妊娠次數(shù)(gravidity)。

一旦已經(jīng)在適合的動(dòng)物模型中進(jìn)行了安全性和有效性研究(例如，如上文所描述的)，則隨后也考慮進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)。

本說(shuō)明書(shū)還包括下列內(nèi)容：

1.基因工程化的雌性生殖道共生細(xì)菌，其中所述基因工程化的細(xì)菌被工程化以表達(dá)抗精子劑。

2.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌，其中所述抗精子劑是抗精子的scfv抗體片段。

3.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述抗精子的scfv抗體片段是人的或人源化的。

4.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述scfv抗體片段與頂體或質(zhì)膜特異性相互作用。

5.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述scfv抗體片段與精子頸部區(qū)域特異性相互作用。

6.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述scfv抗體片段與精子fa-1抗原或其片段特異性相互作用。

7.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述scfv抗體片段跟與seqidno：1或2具有至少90％同一性的肽特異性相互作用。

8.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述scfv抗體片段具有與seqidno：8具有至少90％同一性的序列。

9.實(shí)施方式2的工程化細(xì)菌，其中所述scfv抗體片段由多核苷酸編碼，該多核苷酸具有與seqidno：7具有至少90％同一性的序列。

10.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌，其中所述共生細(xì)菌是乳桿菌。

11.實(shí)施方式8的工程化細(xì)菌，其中所述共生細(xì)菌是詹氏乳桿菌，卷曲乳桿菌或干酪乳桿菌。

12.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌，其中所述共生細(xì)菌是乳球菌。

13.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌，其中所述共生細(xì)菌是大腸桿菌nissle1917株。

14.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌，其中所述共生細(xì)菌是戈登氏鏈球菌。

15.包含實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌的組合物。

16.實(shí)施方式15的組合物，其中所述組合物是陰道栓劑，海綿，乳膏或泡沫的形式。

17.實(shí)施方式15的組合物用于雌性避孕方法的用途。

18.實(shí)施方式15的組合物在制備用于降低雌性群體妊娠的發(fā)生率的藥物中的用途。

19.實(shí)施方式15的組合物在制備用于降低雌性群體受精的發(fā)生率的藥物中的用途。

20.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌在制備用于降低雌性群體妊娠的發(fā)生率的藥物中的用途。

21.實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌在制備用于降低雌性群體受精的發(fā)生率的藥物中的用途。

22.插入陰道的裝置，其包含實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌。

23.實(shí)施方式22的插入陰道的裝置，其中所述裝置是插入陰道的環(huán)。

24.避孕的方法，所述方法包括將雌性對(duì)象生殖道細(xì)胞與在所述雌性對(duì)象中能有效抑制或阻止精子運(yùn)動(dòng)性、精子-卵子融合或卵子穿透的量的實(shí)施方式1的工程化細(xì)菌相接觸的步驟。

25.實(shí)施方式24的避孕方法，所述方法包括將雌性對(duì)象生殖道細(xì)胞與在所述雌性對(duì)象中能有效抑制或阻止精子運(yùn)動(dòng)性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的實(shí)施方式15的組合物相接觸的步驟。