本發(fā)明涉及dna編碼分子庫技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及了一種dna編碼分子庫及dna編碼分子庫化合物的篩選方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)代藥物研發(fā)中，針對疾病的藥物靶點(diǎn)，通過構(gòu)建大型的候選藥物分子庫，進(jìn)行高通量、大規(guī)模篩選是新藥研發(fā)中不可或缺的手段。當(dāng)今世界上主要的制藥公司均擁有大型的分子庫和大規(guī)模的篩選平臺用于新藥研發(fā)。然而，傳統(tǒng)的分子庫和篩選平臺成本高昂、技術(shù)門檻高、管理運(yùn)行復(fù)雜，成為高通量篩選發(fā)展和應(yīng)用中的嚴(yán)重制約。近5年來，dna編碼分子庫技術(shù)逐漸發(fā)展起來，成為藥物研發(fā)中的新興篩選方法。在dna編碼分子庫中，每一個(gè)化合物與一個(gè)特異性的dna鏈相連接，成為一個(gè)特異的條形碼，實(shí)現(xiàn)對化合物的特異性編碼。dna編碼分子庫能夠在極小的體系中，實(shí)現(xiàn)千萬乃至上億級的高通量篩選。篩選結(jié)果可以通過pcr擴(kuò)增和dna測序進(jìn)行解碼分析，已獲得先導(dǎo)化合物用于進(jìn)一步藥物研發(fā)。近年來，dna編碼分子庫已經(jīng)得到新藥研發(fā)領(lǐng)域中的廣泛認(rèn)可和應(yīng)用，成為新藥研發(fā)中的一種重要支撐技術(shù)。

使用dna編碼分子庫進(jìn)行藥物篩選，所使用的靶點(diǎn)大多為純化后的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)靶點(diǎn)經(jīng)修飾后，固載在磁珠之類的固相之上，再與分子庫進(jìn)行孵育。不能與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的小分子被洗脫，與結(jié)合在蛋白靶點(diǎn)上的小分子相分離。再在蛋白質(zhì)變性條件下，對結(jié)合的小分子進(jìn)行洗脫，pcr擴(kuò)增，以及dna測序，從而讀出編碼序列，獲得與靶點(diǎn)結(jié)合的小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)(如圖1所示)。然而，使用純化、固載的蛋白靶點(diǎn)限制了dna編碼分子庫的應(yīng)用范圍，很多其它類型的藥物靶點(diǎn)，例如膜蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合體、活細(xì)胞、病理組織等，由于較難或無法純化和固載，并不能夠用于dna編碼分子庫的篩選，成為本領(lǐng)域中的一個(gè)瓶頸問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種dna編碼分子庫及化合物篩選方法。使用本發(fā)明的dna編碼分子庫的篩選方法，使得蛋白質(zhì)靶點(diǎn)不需純化和固載，并且能夠直接應(yīng)用于膜蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合體、活細(xì)胞、病理組織等其它方法無法應(yīng)用的藥物靶點(diǎn)。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種dna編碼分子庫，其引入一具有8～12個(gè)堿基的短鏈dna，所述短鏈dna一端具有光交聯(lián)基團(tuán)。

在本發(fā)明中，所述光交聯(lián)基團(tuán)為苯基疊氮、二苯甲酮、丙基吖啶中的一種。

一種dna編碼分子庫化合物篩選方法，其包括以下步驟：

步驟a、將如權(quán)利要求1所述的dna編碼分子庫與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)孵育，其中分子庫中的部分小分子與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合，使得所述短鏈dna上所帶的光交聯(lián)基團(tuán)處于蛋白質(zhì)靶點(diǎn)附近，在光照條件下，光交聯(lián)基團(tuán)與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)以保護(hù)能與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的小分子的dna標(biāo)簽；

步驟b、往步驟a中的體系加入dna外切酶，沒有和所述蛋白質(zhì)靶點(diǎn)交聯(lián)的分子庫化合，其所帶的dna標(biāo)簽被所述dna外切酶所降解，和所述蛋白質(zhì)靶點(diǎn)交聯(lián)的分子庫化合物，其所帶的dna標(biāo)簽被蛋白質(zhì)靶點(diǎn)本身所保護(hù)，不被所述dna外切酶所降解；在dna外切酶處理后，體系中余下的dna為能與所述蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的小分子的dna標(biāo)簽；

步驟c、進(jìn)行pcr擴(kuò)展和dna測序，即可讀出被選擇的小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，完成篩選。

在本發(fā)明中，所述蛋白質(zhì)靶點(diǎn)為非固載、無修飾的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。

在本發(fā)明中，所述光交聯(lián)基團(tuán)為苯基疊氮、二苯甲酮、丙基吖啶中的一種。

本發(fā)明具有如下有益效果：使用本dna編碼分子庫的篩選方法徹底擺脫了傳統(tǒng)dna編碼分子庫篩選中對蛋白靶點(diǎn)純化和固載的要求。本方法不再依賴于物理洗脫來分離結(jié)合靶點(diǎn)和不結(jié)合靶點(diǎn)的化合物，而是利用配體誘導(dǎo)的選擇性酶降解的方法從體系中去除不與靶點(diǎn)結(jié)合的化合物。因此從原理上講，本方法能夠應(yīng)用于任何蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。本方法已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明能夠用于非固載蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合體、活細(xì)胞表面膜蛋白、細(xì)胞裂解液等多種復(fù)雜體系的dna編碼分子庫的篩選，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

附圖說明

圖1為傳統(tǒng)dna編碼分子庫化合物篩選方法，其中蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行純化修飾；

圖2為本發(fā)明所述的短鏈dna；

圖3為本發(fā)明引入所述短鏈dna的dna編碼分子庫化合物的篩選方法的流程示意圖；

圖4a為本發(fā)明選取的小分子化合物，其均分別連接到所述短鏈dna上；

圖4b為本發(fā)明驗(yàn)證能與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的小分子所帶的dna編碼不會被酶切水解的流程示意圖；

圖4c為圖4b所獲得的數(shù)據(jù)表格，其中kd：解離常數(shù)，ki：抑制常數(shù)，兩者均為定量表示小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合或抑制能力的常數(shù)；nm指nanomolar，納摩爾的意思；

圖5a為本發(fā)明合成的具有1027個(gè)不同系列的分子庫，該分子庫除了大量的背景序列之外，包含了一個(gè)glcbs、一個(gè)cbs、一個(gè)cbm；其中g(shù)lcbs為蛋白質(zhì)靶點(diǎn)ca-ii的高結(jié)合力小分子，cbs為中等結(jié)合了小分子，而cbm則不與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)ca-ii相結(jié)合，用作于陰性對照；

圖5b為圖5a的分子庫按照本發(fā)明的篩選方法進(jìn)行篩選后的數(shù)據(jù)結(jié)果；

圖6a為本發(fā)明合成的另一分子庫，該分子庫包含4800個(gè)dna編碼的大環(huán)多肽化合物，以及一個(gè)glcbs用于陽性控制；

圖6b為圖6a的分子庫按照本發(fā)明的篩選方法進(jìn)行篩選后的數(shù)據(jù)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。

如圖2所示，其顯示了一種具有8～12個(gè)堿基的短鏈dna(pc-dna)，所述pc-dna在一端具有光交聯(lián)基團(tuán)，如苯基疊氮、二苯甲酮、丙基吖啶等，但不局限于此。本發(fā)明所述的dna編碼分子庫為引入該pc-dna的常規(guī)dna編碼分子庫。由于在分子庫中，所有的dna編碼在兩個(gè)末端具有相同的pcr引物區(qū)，所述pc-dna能夠結(jié)合在所有化合物的pcr引物區(qū)(圖3)。

如圖3所示，一種dna編碼分子庫化合物的篩選方法包括以下步驟：

步驟a、將具有所述pc-dna的dna編碼分子庫與非固載、無修飾的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)孵育之后，該dna編碼分子庫中的一部分小分子能夠與所述蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合，使得pc-dna上所帶的光交聯(lián)基團(tuán)處于蛋白質(zhì)靶點(diǎn)附近，再在光照條件下，光交聯(lián)基團(tuán)能夠與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)發(fā)送交聯(lián)反應(yīng)以保護(hù)能與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的小分子的dna標(biāo)簽；而如果小分子不與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合，則蛋白質(zhì)靶點(diǎn)與pc-dna的交聯(lián)不能發(fā)生。

步驟b、在步驟a的體系中加入dna外切酶exonucleasei(exoi)。其中，沒有和蛋白質(zhì)靶點(diǎn)交聯(lián)的分子庫化合物，其所帶的dna標(biāo)簽將被exoi所降解；而與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)交聯(lián)的分子庫化合物，其dna標(biāo)簽被蛋白靶點(diǎn)本身所保護(hù)，不被exoi所降解。因此在exoi處理之后，體系中余下的dna即為能夠與蛋白靶點(diǎn)結(jié)合的小分子的dna標(biāo)簽。

步驟c、最后進(jìn)行pcr擴(kuò)展和dna測序，即可讀出被選擇的小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

本方法徹底擺脫了傳統(tǒng)dna編碼分子庫篩選中對蛋白質(zhì)靶點(diǎn)純化和固載的要求。本方法不再依賴于物理洗脫來分離結(jié)合蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和不結(jié)合蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的化合物，而是利用配體誘導(dǎo)的選擇性酶降解的方法從體系中去除不與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的化合物。因此從原理上講，本方法能夠應(yīng)用于任何蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。本方法已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證明能夠用于非固載蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合體、活細(xì)胞表面膜蛋白、細(xì)胞裂解液等多種復(fù)雜體系的dna編碼分子庫的篩選。

下面通過實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證是否本發(fā)明人所提出的末端保護(hù)的策略，能夠在小分子和蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合時(shí)，其所帶的dna編碼不會被酶切水解。如圖4a所示，本發(fā)明人選取了一系列的小分子化合物，將它們連接到所述pc-dna上。將這些小分子-dna偶合物與它們的已知蛋白質(zhì)靶點(diǎn)相孵育結(jié)合之后，再按照圖4b中的流程進(jìn)行光照、酶切，以及實(shí)時(shí)定量pcr(qpcr)的分析。qpcr能夠給出ct值，ct值越小，表明存留dna越多；ct值越大，表明dna已經(jīng)被酶切水解，難以被pcr擴(kuò)增出來。圖4c中為所獲得的數(shù)據(jù)表格，其中δct值為：沒有蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的ct值-有蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的ct值；該值越大，表明蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的保護(hù)作用越強(qiáng)。數(shù)據(jù)表明，對于多種類型的小分子，其與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的結(jié)合都能夠有效的實(shí)現(xiàn)對dna編碼的保護(hù)。即便是作用力較弱的4和5，也能有很好的效果。本數(shù)據(jù)在原理上驗(yàn)證了本發(fā)明人所提出的方法的可行性。

更進(jìn)一步，本發(fā)明人合成了一個(gè)具有1027個(gè)不同序列的分子庫。除了大量的背景序列之外，包含了一個(gè)glcbs、一個(gè)cbs、一個(gè)cbm(圖5a)，其中g(shù)lcbs為蛋白質(zhì)靶點(diǎn)ca-ii的高結(jié)合力小分子，cbs為中等結(jié)合了小分子，而cbm則不與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)ca-ii相結(jié)合，用作于陰性對照。本發(fā)明人將所述pc-dna引入至該分子庫進(jìn)行合成后，按照圖3的方法，進(jìn)行了與非固載、無修飾的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)ca-ii的篩選。篩選出的分子庫成員進(jìn)行了pcr擴(kuò)展和dna測序，數(shù)據(jù)顯示在圖5b之中?？梢钥闯觯?jīng)過第一輪的篩選，強(qiáng)結(jié)合力的glcbs被富集了38.4倍，中結(jié)合力的cbs被富集了7.2倍，而不結(jié)合ca-ii靶點(diǎn)的cbm基本沒有被富集。本篩選方法的一個(gè)特點(diǎn)是，第一輪篩選出來的分子庫，能夠直接進(jìn)入下一輪進(jìn)行二次篩選，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的富集。如圖5b所示，經(jīng)過第二輪的篩選，glcbs和cbs得到了約200倍的富集。

更進(jìn)一步，本發(fā)明人合成了一個(gè)更大、化學(xué)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的分子庫。該分子庫包含4800個(gè)dna編碼的大環(huán)多肽化合物，以及一個(gè)glcbs用于陽性控制(圖6a)。經(jīng)過分子庫合成、對非固載無修飾的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)ca-ii的篩選之后，進(jìn)行pcr擴(kuò)增和dna測序來解碼。最終數(shù)據(jù)以散點(diǎn)圖的方式顯示在圖6b之中。可以看到陽性控制glcbs被富集了近100倍(圖6b，上)。而分子庫中的其它化合物，由于缺乏和ca-ii相結(jié)合的化學(xué)結(jié)構(gòu)，基本沒有被富集(圖6b，下)。以上數(shù)據(jù)驗(yàn)證了本發(fā)明所提出來的分子庫篩選方法針對于非固載、無修飾蛋白質(zhì)靶點(diǎn)篩選的可行性。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。