本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及UCKL1AS在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性第二大類常見腫瘤，位于癌癥相關(guān)死亡率第六位。在歐美等發(fā)達國家和地區(qū)，它是男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲，其發(fā)病率低于西方國家，但近年來呈迅速上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達國家更加迅速。我國前列腺癌發(fā)病率也在逐年提高，已位于男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，僅次于膀胱癌和腎癌。前列腺癌一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時，病變已達晚期，預后不良。所以，前列腺癌的早期診斷對前列腺癌病人的治療有極為重大的意義。目前前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有前列腺直腸指檢(DRE)、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是前列腺癌診斷的經(jīng)典技術(shù)，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，以判斷前列腺結(jié)節(jié)的大小和形狀，從而判斷是否患有前列腺癌。但直腸指檢的局限性也很強：(1)患者前列腺腫塊不大時，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期；(3)患者直腸有疾患時不能使用此檢測；(4)醫(yī)生經(jīng)驗不足時可能有漏診或者誤診的可能。前列腺超聲波檢測雖然操作簡單直觀、無損傷，但該方法容易與前列腺炎和前列腺肥大混同，已不再用于前列腺癌分期診斷。活組織病理檢查因其創(chuàng)傷性、復雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標準，一般與其他方法技術(shù)連用。目前對前列腺癌的篩查診斷主要依靠血清PSA檢測和前列腺穿刺病理活檢相結(jié)合的方法。正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，當處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態(tài)時，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標，但PSA增高也常見與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前列腺增生等多重泌尿系統(tǒng)疾病有關(guān)，因此不易確診，甚至可能導致疾病的誤檢、誤診或者病情的延誤。此外，PSA增高確診前列腺癌時，往往患者已經(jīng)屬于中后期，達不到早期診斷的目的。而穿刺活檢的檢出率與活體穿刺的次數(shù)、位置都有較大關(guān)系，不是非常穩(wěn)定的診斷方案。因此，研究更有效的前列腺癌標記物對提高前列腺癌的早期診斷及為患者制定合理的個體化治療方案，減少前列腺癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義，如果能有一種檢測試劑盒，可以提高前列腺癌的檢出率和準確率，對于前列腺癌的臨床治療有著重大的意義。lncRNA(longnon-codingRNA，長鏈非編碼RNA)，是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200bp核苷酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在細胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，越來越多的權(quán)威研究證實lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有較多l(xiāng)ncRNAs被證實在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。早期有效檢測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及提高抗癌藥物的療效對于癌癥的治療尤為重要，發(fā)明新型腫瘤標志物作為診斷與治療的靶點一直是腫瘤研究的熱點。UCKL1AS屬于lncRNA，全稱是UCKL1antisenseRNA1，位于第20號染色體，全長3571bp，目前尚未發(fā)現(xiàn)它在前列腺癌發(fā)生發(fā)展和診斷中的相關(guān)報道。近年來的研究表明，lncRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，所以對腫瘤的發(fā)病機制、早期診斷、個體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測和預后等可能有相應的作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預，本發(fā)明的目的在于提供一種與前列腺癌相關(guān)的新的分子標記物。本發(fā)明的還一目的是提供該分子標記物在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供UCKL1AS作為檢測前列腺癌的分子標記物的應用。優(yōu)選的，所述分子標記物UCKL1AS包含如SEQIDNO:2所示的特異核苷酸序列。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)UCKL1AS在前列腺癌生物學樣品中表達下調(diào)，顯示UCKL1AS與前列腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。進一步地，本發(fā)明提供了UCKL1AS在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應用。優(yōu)選的，所述的試劑是指檢測所述的UCKL1AS表達量的寡聚核苷酸，所述的試劑盒是指包含檢測所述的UCKL1AS表達量的寡聚核苷酸。進一步地，本發(fā)明提供了檢測UCKL1AS表達量的寡聚核苷酸序列在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應用，其特征在于，所述寡聚核苷酸包含如SEQIDNO:3-6的組合。更進一步地，本發(fā)明提供了一種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分：(1)組織樣本、血液或尿液中總RNA提取試劑：Trizol、氯仿、異丙醇和75％乙醇等。(2)反轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制劑和T重復寡核苷酸OligodT。(3)定量PCR試劑：PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs組成的SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系，引物和RNaseFreeH2O。(4)前列腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應體系使用與檢測樣本cDNA相同量。優(yōu)選的，所述試劑盒中的定量PCR試劑中的引物為SEQIDNO:3-6的組合。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與前列腺癌相關(guān)的新的分子標記物UCKL1AS，并進一步證實UCKL1AS在前列腺癌組織中表達下調(diào)，可在制備檢測前列腺癌的試劑或工具中應用。利用該分子標記物可以在腫瘤發(fā)生的早期進行診斷，快速有效，不僅對腫瘤的早期治療和醫(yī)療成本的節(jié)約有重要意義，而且為基因治療、藥物治療等臨床應用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1本發(fā)明中實施例2中前列腺癌組織樣本中UCKL1AS表達下調(diào)。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。本發(fā)明的發(fā)明人對10例前列腺癌組織樣本及對應癌旁組織樣本進行高通量測序，結(jié)合生物信息學方法進行基因篩選，挑選出候選lncRNAUCKL1AS，現(xiàn)有研究中并沒有UCKL1AS和前列腺癌相關(guān)的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子生物學方法驗證，證實了UCKL1AS在前列腺癌組織中表達下調(diào)，其相關(guān)制劑可用于治療前列腺癌。本發(fā)明的UCKL1AS是在本發(fā)明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號：GeneID:100113386，來源于人類基因組，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明采用RT-PCR方法檢測上述lncRNA在前列腺癌患者和正常人群中的表達，并驗證了該lncRNA在前列腺癌患者中表達下調(diào)。熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結(jié)合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。本發(fā)明UCKL1AS的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴增而得到有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次擴增，然后再將多次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。實施例1高通量測序篩選差異表達基因1、取樣選取10例新鮮前列腺癌組織及對應癌旁組織，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、對組織樣本進行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織樣本放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達分析時，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認算法EBSeq進行差異篩選。其中，篩選時，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對差異表達基因進行了GeneOntology和信號通路分析，并對差異表達基因進行功能注釋，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻我們篩選了差異表達UCKL1AS，UCKL1AS在前列腺癌樣本組織中表達下調(diào)。實施例2RT-PCR驗證前列腺癌組織中UCKL1AS表達情況1、材料選取10例前列腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、方法2.1對被試者組織樣本進行總RNA提取，同實施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.3、Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。2.3.2引物設計采用在線引物設計軟件，基因序列參照NCBI:NR_027287.1(UCKL1AS)，內(nèi)參選GAPDH，引物設計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表1所示：表1引物序列操作過程如下：(一)反應體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，61℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。表2RealTime反應體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別對目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。(四)瓊脂糖電泳上述反應結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖電泳，用快速膠回收試劑盒(invitrogen公司)將大小為346bp的片段進行切膠回收，取部分測序，結(jié)果用blast軟件進行同源性分析。(五)實驗結(jié)果實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較UCKL1AS在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，其中UCKL1AS在前列腺癌組織中的表達水平僅為對照組織的38％，如圖1所示。以上結(jié)果驗證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)的整合分析UCKL1AS在前列腺癌患者中表達下調(diào)的結(jié)果。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，在ABI3730全自動測序儀上測序，該346bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。用VectorNTIadvance10軟件(Invitrogen公司)將該序列與UCKL1AS整個mRNA序列進行比對，比對結(jié)果顯示，如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列為UCKL1AS的一部分序列，符合率為100％。實施例3試劑盒的制備基于實施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的前列腺癌診斷試劑盒，特異擴增如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物對如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，和特異擴增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定前列腺癌診斷試劑盒的組成包括：(1)組織樣本、血液或尿液中總RNA提取試劑；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；(3)定量PCR試劑；(4)前列腺正常組織cDNA:作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應體系使用與檢測樣本cDNA相同量。每50mg組織或200μL血液或200μL尿液中總RNA提取試劑如表3所示，反轉(zhuǎn)錄試劑的具體成分和用量如表4所示，定量PCR試劑的具體成分和用量如表5所示。表3組織樣本、血液或尿液中總RNA提取試劑組分使用量Trizol1mL氯仿0.2mL異丙醇0.5mL75％乙醇1mL表4反轉(zhuǎn)錄試劑組分每個反應體系使用量5xPrimeScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer(50微摩爾)0.5μLRandom6mers(100微摩爾)0.5μLRNaseFreedH20補齊至10μL表5定量PCR試劑組分每個反應體系使用量SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系12.5μLForwardPrimer(1μM)1μLReversePrimer(1μM)1μLRNaseFreedH2O至25μL最佳反應條件為：95℃預變性5min，(95℃變性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環(huán)，72℃延伸15min。實施例4本前列腺癌的診斷試劑盒的應用1、病例選取30例待篩查的前列腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間泌尿科治療的病人。獲取所有研究對象的前列腺癌組織樣本，編號后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會通過。2、方法使用常規(guī)方法或使用特定的試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實施例3中的試劑盒進行檢測反應。以試劑盒中前列腺正常組織cDNA作為QPCR定量檢測中的對照cDNA，檢測組織樣本中的UCKL1AS相對前列腺正常組織表達量變化。3、結(jié)果通過溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCt法進行相對定量，樣本和對照間比較采用t檢驗，P<0.05為差異顯著。結(jié)果顯示，待篩查的30例前列腺癌患者的組織樣本中有4例患者組織樣本中UCKL1AS的表達量和前列腺癌正常組織表達量無顯著差異；有26例患者組織樣本中UCKL1AS的表達量是前列腺癌正常組織表達量的65％以下，其中有23例患者組織樣本中UCKL1AS的表達量是前列腺癌正常組織表達量的40％以下。經(jīng)臨床進一步檢測，30例待篩查的患者中確診23例前列腺癌，這23例前列腺癌患者與本發(fā)明制備的試劑盒檢測結(jié)果一致。據(jù)此推斷，本前列腺癌的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前列腺癌患者，并以此為臨床提供診斷線索。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3