本發(fā)明涉及一種抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的領(lǐng)域。

技術(shù)背景

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，對人類生命和健康有著非常大威脅，是惡性腫瘤死亡的首位原因，其發(fā)病率仍呈持續(xù)上升趨勢。對早期肺癌最有效的治療方法是手術(shù)切除，但因手術(shù)后病人出現(xiàn)較高全身和局部的復(fù)發(fā)率。傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物的化療效果已經(jīng)達(dá)到了一個平臺期，其進一步發(fā)展的空間極小，而且傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療藥物的毒副反應(yīng)也限制其應(yīng)用和發(fā)展。放射治療對已發(fā)生的原發(fā)腫瘤就不再適合。放療結(jié)合化療可以通過增加腫瘤療效，但不良反應(yīng)也相應(yīng)的增加，從而限制了其臨床的應(yīng)用。

隨著分子生物學(xué)的進一步發(fā)展，分子靶向治療必然會為肺癌的治療開辟廣闊的應(yīng)用前景。靶向治療為肺癌的治療提供了新的策略。近二十年來，免疫毒素已成為尋找新型抗腫瘤藥物一個十分活躍的研究領(lǐng)域。免疫毒素是將生物毒素與抗體或細(xì)胞因子連接起來的導(dǎo)向藥物，又稱作生物導(dǎo)彈或?qū)蚨舅?。?dǎo)向藥物的概念最早由德國藥物化學(xué)家Paul Erhlich提出，它由兩部分組成：能識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物的導(dǎo)向部分和在導(dǎo)向部分的引導(dǎo)下進入細(xì)胞并發(fā)揮細(xì)胞毒作用的效應(yīng)部分。由于導(dǎo)向性治療藥物可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，具有副作用低、高效的特點，因此對一些難治愈和多藥耐藥的惡性腫瘤尤其有著重要意義?，F(xiàn)在FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的分子靶向藥物如Hereeptin，Rituximab，ZD1839都成功地對那些常規(guī)療法無效的腫瘤患者顯現(xiàn)出驚人的療效。白喉毒素與IL-2重組的免疫毒素也經(jīng)FDA批準(zhǔn)作為人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的搶救藥物上市，還有很多已呈現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用的其它免疫毒素和靶向藥物，目前正在進行I/II期臨床試驗。

利用分子技術(shù)和基因技術(shù)進行腫瘤的免疫治療的研究也日益增多，其中一些針對肺癌分子的靶向藥物己經(jīng)在臨床前研究和臨床應(yīng)用上顯示出一定抗癌活性。如針對表皮生長因子受體，蛋白激酶C，血管內(nèi)皮生長因子，環(huán)氧化酶-2，法尼基轉(zhuǎn)移酶等調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動和與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)的靶目標(biāo)都可能作為肺癌治療的分子靶向目標(biāo)。

以往的研究已經(jīng)證實IL-4R也表達(dá)于許多正常的造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞。Puri等報道了IL4-PE(PE:假單胞桿菌外毒素)對T細(xì)胞、B細(xì)胞和CD34+前體細(xì)胞等靜止性的造血細(xì)胞僅有很小的敏感性，因為這些細(xì)胞表達(dá)的IL-4R水平很低。IL4-PE對高水平表達(dá)的IL-4R的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等非造血細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)，與同樣高表達(dá)IL-4R的腫瘤細(xì)胞相反。他們通過毒理學(xué)研究，當(dāng)IL4-PE靜脈注射斷尾猴(其體內(nèi)細(xì)胞可以與人IL-4R結(jié)合)，只有在非常大的劑量時(200μg/kg)才會對肝臟產(chǎn)生毒性反應(yīng)，而對其它器官及血液系統(tǒng)不會產(chǎn)生毒性反應(yīng)。這些研究成果表明IL-4R有高度的腫瘤細(xì)胞表達(dá)特異性，具備作為免疫毒素作用靶點的要求，其配體或抗體易于獲得、便于實驗，作為免疫毒素的載體它們無需人源化改造。

免疫毒素是近年來新興的一種腫瘤導(dǎo)向治療方法。它利用抗腫瘤單抗與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合，將生物毒蛋白與抗體偶聯(lián)，去定向攻擊腫瘤細(xì)胞，而其對正常組織的殺傷較小，故被形象地稱為“生物導(dǎo)彈”。免疫毒素的導(dǎo)向載體部分與毒素“彈頭”部分的連接方式有兩種，包括化學(xué)偶聯(lián)法和基因工程融合法。通過將毒素和單克隆抗體在體外進行化學(xué)偶聯(lián)途徑制備的免疫毒素稱為第一代免疫毒素。而通過將毒素的編碼基因與腫瘤細(xì)胞表面特異性分子的配體基因進行克隆重組，然后在大腸桿菌中高效表達(dá)，從而制備出的免疫毒素稱為第二代免疫毒素。但第一代免疫毒素存在分子量大，穩(wěn)定性不好等缺點。

自20世紀(jì)80年代，Huston和Bird等分別利用基因工程技術(shù)在體外獲得具有與天然抗體分子相似的抗原親和力及特異性的單鏈Fv蛋白，被稱為單鏈抗體(single chain variable fragment，scFv)，其最重要的進展是噬菌體抗體庫技術(shù)的建立，被譽為又一次革命性進展。噬菌體展示技術(shù)將表型和基因型聯(lián)系在一起，不經(jīng)人體免疫，繞過雜交瘤技術(shù)，通過幾輪“吸附-洗脫-擴增”的體外篩選富集過程，即可得到人源的基因工程抗體。scFv具有分子質(zhì)量小，免疫原性低，無Fc端，不易與具有Fc受體的靶細(xì)胞結(jié)合，對腫瘤組織的穿透力強，可以與其他效應(yīng)分子連接成抗腫瘤融合蛋白等特點，是保持抗體親和性和特異性的最小功能性抗體片段。因此，scFv還可作為載體與藥物、放射性同位素、細(xì)胞毒素、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的酶及細(xì)胞因子等結(jié)合，而形成對腫瘤細(xì)胞有特異性殺傷作用的復(fù)合物用于腫瘤的導(dǎo)向治療。目前報道較多的是構(gòu)建重組單鏈免疫毒素，重組單鏈免疫毒素是將單鏈抗體基因與毒素基因相連，原核表達(dá)scFv與毒素的融合蛋白，利用抗體的特異性將毒素帶到指定部位，而發(fā)揮殺傷作用，這種重組單鏈免疫毒素去除了毒素原有的受體結(jié)合位點，毒性低，還具有免疫原性低、易于穿透腫瘤組織、分子穩(wěn)定性好、靶向性好等優(yōu)點，在腫瘤等疾病的導(dǎo)向治療中比完整抗體更 具優(yōu)勢和潛力。

腫瘤靶向治療具有特異性載體的優(yōu)越性，能將藥物或其它具有殺傷腫瘤細(xì)胞活性的物質(zhì)，有選擇性地運送到腫瘤部位，最大限度地殺傷腫瘤細(xì)胞，而不影響正常細(xì)胞的功能，從而提高療效、減少毒副作用，它是一種有異于傳統(tǒng)手術(shù)、放療、化療的新的治療模式?，F(xiàn)在靶向治療己成功應(yīng)用于乳癌、淋巴瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、黑色素瘤、卵巢癌和大腸癌等惡性腫瘤的治療。

由單一的抗原決定簇刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體為單克隆抗體，是第二代抗體。但由于鼠源單克隆抗體對人體而言是異源蛋白抗原，可誘發(fā)人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA)，加上鼠源性單克隆抗體在人體的半衰期短(1-2d)，因而臨床應(yīng)用受到了限制。

完整抗體由兩條完全相同的重鏈(heavy chain,H)和兩條完全相同的輕鏈(light chain,L)構(gòu)成，相對分子質(zhì)量較大。通過對抗體基因進行人工改造，使其只表達(dá)可變區(qū)(variable region,V)，即通過采用人工合成的連接肽(linker)基因?qū)⒖贵w重鏈可變區(qū)(V_H)和輕鏈可變區(qū)(V_L)連接成重組基因，由重組基因表達(dá)的抗體稱為單鏈抗體(single chain Fv,ScFv)。到目前為止，scFv是分子量最小的抗體，相對分子質(zhì)量約為25000，僅為完整抗體的1/6。ScFv有眾多的優(yōu)勢，如分子量小，穿透力強，與抗原結(jié)合能力較好等，也克服了單克隆抗體的異源等方面弱點，因此具有廣闊的應(yīng)用前景和推廣價值。

竹葉青蛇毒LAAO對多種癌細(xì)胞具有直接殺傷和誘導(dǎo)調(diào)亡的作用，但對腫瘤殺傷作用沒有選擇性；白介素-4受體(IL-4R)在癌細(xì)胞上特異性過度表達(dá)，是抗癌藥物作用的良好靶標(biāo)。但目前尚未有構(gòu)建抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO的融合蛋白用于靶向治療肺癌的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于，提供一種抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明采用分子生物學(xué)技術(shù)抗IL-4R單鏈抗體基因(scFv)與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合基因的表達(dá)載體，在體外進行體外表達(dá)，重組抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白可用于治療肺癌，療效好，基本無副作用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述融合蛋白制備方法：通過 重疊延伸PCR技術(shù)方法將抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO基因連接成scFv-LAAO融合基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-scFv-LAAO，轉(zhuǎn)入BL21(DE3)原核表達(dá)菌，誘導(dǎo)表達(dá)scFv-LAAO融合蛋白，即得。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述融合蛋白的制備具體包括以下步驟：

(1)選擇酶切位點為EcoRⅠ和XhoⅠ的scFv基因序列，將scFv與LAAO兩段基因通過重疊延伸PCR技術(shù)進行連接，連接前將scFv基因序列的XhoⅠ酶切位點去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位點，在竹葉青蛇毒LAAO基因序列5’端加上帶有一段與抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列相同的重疊序列，以及一段連接肽連接基因，另外在“重疊序列”基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位點；

其中，設(shè)計引物F1和引物F2去除抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列的Xho I酶切位點；

(2)設(shè)計引物F1和F3，通過SOE-PCR技術(shù)連接抗IL-4R單鏈抗體scFv基因與竹葉青蛇毒LAAO基因，得融合基因scFv-LAAO；

(3)pET-28a載體/scFv-LAAO基因片段的雙酶切與目的片段回收：設(shè)計反應(yīng)體系：scFv-LAAO基因片段5-15μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各1-3μL，10×Buffer Tango 2-3μL，ddH₂O 30-40μL；以上成分加入PCR管中，于35-40℃酶切3-5h，78-82℃下滅活XhoⅠ酶18-22min后；冷卻至10-14℃，再加入1.5-2.5μL EcoRⅠ內(nèi)切酶，35-40℃酶切3-5h，60-70℃，滅活18-22min；取scFv-LAAO基因片段進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段；按照同樣方法對pET-28a載體進行雙酶切和回收目的片段；

(4)重組質(zhì)粒pET-28a-scFv-LAAO的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化：取經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切的pET-28a載體目的片段5-15μL、scFv-LAAO雙酶切目的片段35-45μL、Rapid T4DNA ligase 1-3μL、快速連接緩沖液5-25μL、ddH₂O 15-20μL，14-18℃過夜；參照《分子克隆實驗指南》中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建的pET-28a-scFv-LAAO重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后進行培養(yǎng)；所述快速緩沖液含Tris-HCl 0.1mol/L、MgCl₂20mmol/L、二硫蘇糖醇DTT20mmol/L、三磷酸腺苷ATP 0.4mmol/L、鹽酸亞精胺1mmol/L和牛血清白蛋白BSA 0.1mg/mL；

(5)重組質(zhì)粒酶切鑒定和蛋白質(zhì)分子量大小預(yù)測：取10個單菌落用裝有15mL的TB培養(yǎng)液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培養(yǎng)瓶中，于36-38℃環(huán)境下震蕩培養(yǎng)至0D₆₀₀＝0.6～0.8，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒；依次用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對該質(zhì)粒進行雙酶切鑒定；將成功酶切的質(zhì)粒送進行測序，并對測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)氨基酸序列翻譯，并對 翻譯結(jié)果進行預(yù)測分析；

(6)重組毒素scFv-LAAO抗體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：取平板上的單個菌落接種至裝有8-12mL的含卡那霉素45-55μg/mL的TB培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，于35-40℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液3500-4500rpm離心10-20min，重復(fù)三次，轉(zhuǎn)移菌液至裝有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，于35-40℃下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入濃度為0.5-1.5mM的IPTG，于35-40℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)2-4h，即得。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于：所述scFv基因序列為：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述引物F1為：

5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述引物F2為：

5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述引物F3為：

5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述步驟(2)為：去除XhoⅠ酶切位點的scFv基因片段15μL，LAAO基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH₂O； 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重復(fù)30個循環(huán)；72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳并用膠回收試劑盒回收基因片段。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述步驟(3)為：pET-28a載體/scFv-LAAO基因片段的雙酶切與目的片段回收：設(shè)計反應(yīng)體系：scFv-LAAO基因片段10μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH₂O 35.5μL；以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min滅活XhoⅠ酶；待冷卻至12℃，再加入2μL EcoRⅠ內(nèi)切酶，37℃酶切4h，65℃，滅活20min；取scFv-LAAO基因片段進行1％瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的片段；按照同樣方法對pET-28a載體進行雙酶切和回收目的片段。

前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述步驟(6)為：重組毒素scFv-LAAO抗體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：挑取平板上的單個菌落接種至裝有10mL的含卡那霉素50μg/mL的TB培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液4000rpm離心15min，重復(fù)三次，轉(zhuǎn)移菌液至裝有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入濃度為1mM的IPTG，于37℃快速振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)3h，即得。

一種前述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白的應(yīng)用，包括用于治療肺癌及其并發(fā)癥。

蛇毒中的LAAO成分是一種有潛力的抗腫瘤制劑，將其開發(fā)為一種新型的抗腫瘤藥，具有廣闊的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用前景。竹葉青蛇毒LAAO具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抗菌作用；王鴻程將抗白介素-4受體單克隆抗體與眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素構(gòu)建的免疫毒素靶向治療胰腺癌，取得很好的效果；重組竹葉青蛇毒L-氨基酸氧化酶蛋白對腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制殖作用。然而，竹葉青蛇毒LAAO對多種癌細(xì)胞具有直接殺傷和誘導(dǎo)調(diào)亡的作用，但對腫瘤殺傷作用沒有選擇性，白介素-4受體(IL-4R)在癌細(xì)胞上特異性過度表達(dá)，是抗癌藥物作用的良好靶標(biāo)。故本研究成功制備抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO的融合蛋白，并具有一定靶向抗腫瘤作用，研究結(jié)果為開發(fā)利用scFv-LAAO融合蛋白提供實驗依據(jù)，為進一步研制新型的抗腫瘤藥物打基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用分子生物學(xué)手段將編碼抗IL-4R單鏈抗體片段基因(scFv)和編碼竹葉青蛇毒的基因LAAO構(gòu)建成復(fù)合基因(scFv-LAAO)，插入載體pET-28a使其通過BL21(DE3)原核表達(dá)菌表達(dá)融合蛋白，并對此重組蛋白進行靶向治療肺癌的實驗研究，旨在研制新型的肺癌的靶向治療藥物。

申請人進行了下列實驗，可證明本發(fā)明具有有效的效果；

實驗例

1實驗材料

E.coli BL21(DE3)由本實驗室保存。pET-28a，由上海英駿生物公司提供。Anti-6×His抗體[GT359](HRP)(批號：GR212114-6)與Rabbit anti-mouse antibody(批號：990150311)購自Abcam公司。卡那霉素(批號：4240320)購自北京索萊寶生物科技有限公司，XhoⅠenzyme(批號：00238777)與EcoRⅠenzyme(批號：00189088)購自美國Thermo Scientific公司。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：0020150129)考馬斯亮藍(lán)R250(批號：416B035)與ECL Plus熒光檢測試劑(ECL超敏發(fā)光液)(批號：20150128)，蛋白Marker PR1800(22KD-120KD)(批號：PR1800)，4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)(批號：20150224)購自北京索萊寶生物科技有限公司?？焖貲NA連接試劑盒(T4連接酶)(批號：20150423)購自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜(批號：K4CA1978G)購自Millipore公司；健康昆系小鼠(4-6周齡、體重18～20g的雄性清潔級)；人肺腺癌細(xì)胞株H460，購自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2方法

2.1竹葉青蛇毒LAAO基因設(shè)計與合成

scFv基因的制備已經(jīng)完成。scFv基因序列選擇的酶切位點為EcoRⅠ和XhoⅠ，在將scFv與LAAO兩段基因通過重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)進行連接前將scFv的XhoⅠ酶切位點去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位點。SOE-PCR成功后將保持EcoRⅠ和XhoⅠ以適用于pET-28a載體。在LAAO序列5’端加上帶有一段與抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列相同的重疊序列(40bp)，以及一段連接肽(linker)基因，委托上海英俊生物公司合成，將其在命名為“重疊序列-linker-LAAO”，并在該基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位點。委托上海英俊生物公司合成的scFv基因序列如下：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACAT TGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG。

“重疊序列-linker-LAAO”基因序列如下：

CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAAAAGCTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGTCGACATGAATGTCTTCTTTATGTTGTCACTGCTGTTCTCGGCTGCCTTGGGACGCTGTGCAGATGACAGAAACCCCCTAGAGGCATGCTTCCGAGAAACTGACTATGAAGTTTTTCTAGAGATCGCCAGAAATGGTCTGACCGCGACATCAAACCCAATTCATGTTGTGATTGTAGGTGCAGGAATGTCTGGGCTTAGTGCAGCCTATGTTCTTGCAGGGGCTGGACATGAGGTGACAGTTCTTGAAGCCAGTGAACGTGCGGGAGGACGAGTGAGGACTTATCGAAATGACGAAGAAGGCTGGTATGCCAATCTCGGGCCCATGCGTTTACCTGAGAAACACAGGATTGTCCGGGAATATATCAGAAAGTTTAATCTGCAGTTGAATGAATTTTCTCAGGAATTTGACAATGCCTGGCATTTTGTCAAAAACATCAGGAAGACAGTAGGGGAAGTCAAGATTGACCCTGGCGTCTTGAAATATCCCGTGAAGCCTTCAGAAGAAGGCAAAAGTGCTGAACAGCTATATGAAGAGTCCCTCAGAAAGGTTGAAAAAGAATTAAAAAGGACTAACTGCAGTTACATACTAAATAAATATGACACCTACTCAACGAAGGAGTATCTAATTAAAGAAGGAAATCTGAGCCCTGGAGCTGTAGATATGATTGGAGACTTAATGAATGAAGATGCTGGCTATTATGTGTCTTTTATTGAGAGCATGAAACATGATGATATCTTCGCTTATGAAAAAAGATTCGATGAAATTGTTGATGGAATGGATAAGTTGCCAACATCCATGTATCGAGCCATTGAGGAAAAGGTGCATTTCAATGCCCAAGTAATCAAGATACAGAAGAATGCCGAGGAAGTCACAGTGACATATCATACCTTAGAACCGGACACGTCGTTTGTGACAGCCGATTATGTCATTGTATGCACTACGTCAAGGGCCGCCCGTCGCATCAAGTTTGAACCACCCCTTCCGCTAAAGAAAGCGCATGCTCCGAGGTCTGTCCACTACAGAAGTGGCACCAAGATCTTCCTCACTTGCACTAAGAAATTTCGGGAGGATGAAGGCATTCATGGTGGGAAGTCCACAACTGATCTTCCATCCCGATTCATCTACTTCCCTAACCATAACTTTACTAGTGGCGTTGGGGTTATTATAGCCTATGGCATTGGTGATGATGCCAATTTCTTTCAAGCTCTTGATTTGAAGGACTGTGGTGATATTGTCATTAATGACCTTTCATTGATCCATCAGCTGCCCAGGGAAGAGATCCAGACCTTCTGTTATCCCTCAATGATTCAAATTTGGAGCCTGGATAAGTATGCTATGGGTGGTATAACCACCTTCACTCCCTACCAGTTTCAACATTTTAGTGAAGCGCTCACTTCACATGTAGACAGAATCTACTTTGCAGGCCAGTATACGGCCCATGCTCATGGTTGGATTGACAGCTCAATTATGTCAGGGCTGACAGCAGCAAGAGATGTGAATCGTGCTTCTGAGAATCCATCAGGAATCCACCTGAGCAATGACGATGAACTTTAACTCGAG。

重疊區(qū)堿基序列：CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA。

2.2引物設(shè)計

設(shè)計引物F1和引物F2去除抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列的Xho I酶切位點；根據(jù)抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列與合成的“重疊序列-linker-LAAO”基因序列，設(shè)計引物F1和F3，通過SOE-PCR技術(shù)連接抗IL-4R單鏈抗體(scFv)與竹葉青蛇毒LAAO基因成融合基因scFv-LAAO。委托上海英俊生物公司合成的引物序列如下：

引物F1：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’；

引物F2：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’；

引物F3：5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’。

2.3抗IL-4R單鏈抗體(scFv)與竹葉青蛇毒LAAO基因的連接

設(shè)計反應(yīng)體系為：去除XhoⅠ酶切位點的scFv基因片段15μL，LAAO基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH₂O。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重復(fù)30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳并用膠回收試劑盒回收基因片段。

2.4pET-28a載體/scFv-LAAO基因片段的雙酶切與目的片段回收

設(shè)計反應(yīng)體系：scFv-LAAO基因片段10μL，XhoⅠ/EcoRⅠ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH₂O 35.5μL。將以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min滅活XhoⅠ酶。待冷卻至12℃，再加入2μL EcoRⅠ內(nèi)切酶，37℃酶切4h，65℃，滅活20min。取scFv-LAAO基因片段進行1％瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的片段。按照同樣方法對pET-28a載體進行雙酶切和回收目的片段。

2.5重組質(zhì)粒pET-28a-scFv-LAAO的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

按照北京索萊寶科技有限公司的快速DNA連接試劑盒(T4連接酶)說明書進行連接pET-28a-scFv-LAAO融合基因，pET-28a載體雙酶切目的片段：10μL；scFv-LAAO雙酶切目的片段：40μL；Rapid T4DNA ligase：2μL；2快速連接緩沖液：20μL；ddH₂O：18μL。將該反應(yīng)體系置于16℃過夜；參照《分子克隆實驗指南》，將pET-28a重組質(zhì)粒scFv-LAAO 導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后進行培養(yǎng)。

2.6重組質(zhì)粒酶切鑒定鑒定和蛋白質(zhì)預(yù)測

挑取10個單菌落用裝有15mL的TB培養(yǎng)液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培養(yǎng)瓶中，于37℃環(huán)境下震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒。先后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對該質(zhì)粒進行雙酶切鑒定；將成功酶切的質(zhì)粒送上海英駿生物公司測序，利用DNAStar7.10軟件對測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)氨基酸序列翻譯，并對翻譯結(jié)果進行預(yù)測分析。

2.7重組毒素scFv-LAAO抗體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取平板上的單個菌落接種至裝有10mL的TB培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)的50mL錐形瓶中于37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.2～0.4。取菌液4000rpm離心15min，反復(fù)三次。轉(zhuǎn)移菌液至裝有100mL的TB培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/mL)的500mL錐形瓶中，于37℃快速振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入終濃度為1mM的IPTG，于37℃快速振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)3h。

2.8SDS-PAGE及Western-Blot檢測表達(dá)蛋白

將誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)3h的菌液進行離心，將上清和菌體分別進行SDS-PAGE分析，確定為可溶性表達(dá)后，取100μL表達(dá)菌上清取加入20μL的4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)混合，于沸水中加熱使蛋白變性，冷卻至常溫后進行離心，取上清液用SDS-PAGE方法分離樣品中的蛋白，并進行考馬斯亮藍(lán)染色和Western-Blot分析。

2.9MTT法測定scFv-LAAO融合蛋白對人肺腺癌細(xì)胞株H460的抑制作用

用低血清1640培養(yǎng)基將培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞株H460稀釋至1～2×10⁵個/mL，每孔100μL接種96孔培養(yǎng)板，在5％的CO₂濃度培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液。實驗設(shè)置空白對照組、環(huán)磷酰胺組和高、中、低融合蛋白組(融合蛋白組用低血清1640培養(yǎng)基配置成終濃度分別為4.0、2.0、1.0mg/mL)?？瞻讓φ战M加入等量的低血清1640培養(yǎng)基。每組每個濃度設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)4h取出培養(yǎng)板，每孔加入50μL的MTT(1mg/mL),4h后棄MTT，加入DMSO 100μL/孔溶解formazan結(jié)晶。環(huán)磷酰胺組用藥劑量終濃度為2.0mg/mL，處理方法同融合蛋白組。用酶標(biāo)儀檢測各組每孔的OD₄₉₀值，根據(jù)OD₄₉₀值計算不同濃度的融合蛋白對肺癌細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率(IR)(％)＝[(對照組OD值-藥物作用組OD值)/對照組OD值]×100％。

2.10抗IL-4R單鏈抗體與LAAO融合蛋白對人肺腺癌細(xì)胞株H460荷瘤小鼠抑瘤率和生 命延長率影響

將健康昆系小鼠動物隨機分5組，每組15只。融合蛋白組包含高、中、低劑量三個小組(100、50和20mg/kg)；其余3組分別為小鼠肺癌實體瘤模型組和環(huán)磷酰胺組(腹腔注射(0.1mL/10g體重))。模型組制備方法：將人肺癌細(xì)胞復(fù)蘇后進行培養(yǎng)，調(diào)整活細(xì)胞數(shù)至1×106個/mL，在小鼠右腋下注射接種0.2mL/只，3周后，荷瘤肺癌小鼠出現(xiàn)腫塊。

所有動物按照各組劑量每天給藥1次，連續(xù)10d。停藥第7d后，每組處死5只小鼠，剖取瘤塊進行稱重。根據(jù)計算公式，腫瘤抑制率(％)＝(對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100，計算抑瘤率。

每組余下小鼠5只停藥后，繼續(xù)觀察小鼠存活天數(shù)，計算小鼠生命延長率。生命延長率(％)＝(給藥組平均存活天數(shù)－對照組平均存活天數(shù))/對照組平均存活天數(shù)×100。

2.11數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS16.0軟件進行分析，統(tǒng)計結(jié)果用“x^_±s”來表示。

3結(jié)果

3.1SOE-PCR結(jié)果

通過SOE-PCR連接的scFv-LAAO基因進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1，在2000～3000bp之間有一條明顯的條帶，與預(yù)期2355bp長度相似，表明scFv與LAAO兩段基因連接成功。

3.2篩選后scFv-LAAO酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，通過1％瓊脂糖凝膠進行電泳后在2000～3000bp之間有一條明顯的條帶，符合插入的scFv-LAAO片段大小(圖2)。

3.3scFv-LAAO序列分析

將成功酶切的質(zhì)粒送上海英駿生物公司測序，測序結(jié)果進行通過Geneious9.1.2軟件分析scFv-LAAO序列共計2355bp，利用DNAStar7.10軟件對測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)氨基酸序列翻譯，scFv-LAAO序列能編碼785個氨基酸，蛋白分子量約在86KD左右。

scFv-LAAO序列為：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC GTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAAAAGCTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGTCGACATGAATGTCTTCTTTATGTTGTCACTGCTGTTCTCGGCTGCCTTGGGACGCTGTGCAGATGACAGAAACCCCCTAGAGGCATGCTTCCGAGAAACTGACTATGAAGTTTTTCTAGAGATCGCCAGAAATGGTCTGACCGCGACATCAAACCCAATTCATGTTGTGATTGTAGGTGCAGGAATGTCTGGGCTTAGTGCAGCCTATGTTCTTGCAGGGGCTGGACATGAGGTGACAGTTCTTGAAGCCAGTGAACGTGCGGGAGGACGAGTGAGGACTTATCGAAATGACGAAGAAGGCTGGTATGCCAATCTCGGGCCCATGCGTTTACCTGAGAAACACAGGATTGTCCGGGAATATATCAGAAAGTTTAATCTGCAGTTGAATGAATTTTCTCAGGAATTTGACAATGCCTGGCATTTTGTCAAAAACATCAGGAAGACAGTAGGGGAAGTCAAGATTGACCCTGGCGTCTTGAAATATCCCGTGAAGCCTTCAGAAGAAGGCAAAAGTGCTGAACAGCTATATGAAGAGTCCCTCAGAAAGGTTGAAAAAGAATTAAAAAGGACTAACTGCAGTTACATACTAAATAAATATGACACCTACTCAACGAAGGAGTATCTAATTAAAGAAGGAAATCTGAGCCCTGGAGCTGTAGATATGATTGGAGACTTAATGAATGAAGATGCTGGCTATTATGTGTCTTTTATTGAGAGCATGAAACATGATGATATCTTCGCTTATGAAAAAAGATTCGATGAAATTGTTGATGGAATGGATAAGTTGCCAACATCCATGTATCGAGCCATTGAGGAAAAGGTGCATTTCAATGCCCAAGTAATCAAGATACAGAAGAATGCCGAGGAAGTCACAGTGACATATCATACCTTAGAACCGGACACGTCGTTTGTGACAGCCGATTATGTCATTGTATGCACTACGTCAAGGGCCGCCCGTCGCATCAAGTTTGAACCACCCCTTCCGCTAAAGAAAGCGCATGCTCCGAGGTCTGTCCACTACAGAAGTGGCACCAAGATCTTCCTCACTTGCACTAAGAAATTTCGGGAGGATGAAGGCATTCATGGTGGGAAGTCCACAACTGATCTTCCATCCCGATTCATCTACTTCCCTAACCATAACTTTACTAGTGGCGTTGGGGTTATTATAGCCTATGGCATTGGTGATGATGCCAATTTCTTTCAAGCTCTTGATTTGAAGGACTGTGGTGATATTGTCATTAATGACCTTTCATTGATCCATCAGCTGCCCAGGGAAGAGATCCAGACCTTCTGTTATCCCTCAATGATTCAAATTTGGAGCCTGGATAAGTATGCTATGGGTGGT ATAACCACCTTCACTCCCTACCAGTTTCAACATTTTAGTGAAGCGCTCACTTCACATGTAGACAGAATCTACTTTGCAGGCCAGTATACGGCCCATGCTCATGGTTGGATTGACAGCTCAATTATGTCAGGGCTGACAGCAGCAAGAGATGTGAATCGTGCTTCTGAGAATCCATCAGGAATCCACCTGAGCAATGACGATGAACTTTAACTCGAG。

3.4SDS-PAGE分析

考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明，經(jīng)過不同條件的表達(dá)實驗，確定scFv-LAAO以可溶性形式表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)的最佳方案為IPTG濃度1mM，37℃環(huán)境下保持一定通氣量振蕩培養(yǎng)3h(圖4)。

3.5Western-Blot檢測scFv-LAAO蛋白

scFv-LAAO蛋白在X光膠片下成像的結(jié)果也顯示出了如預(yù)期設(shè)想的含有His-tag的目的蛋白的成功表達(dá)(圖5)，位置與預(yù)期的大小86KD相符，呈可溶性表達(dá)。

3.6scFv-LAAO融合蛋白在體外對人肺腺癌細(xì)胞株H460的活性測定

MTT法檢測scFv-LAAO融合蛋白對人肺腺癌細(xì)胞株H460生長的影響結(jié)果顯示，scFv-LAAO對肺癌細(xì)胞有明顯抑制作用，高、中、低濃度融合蛋白組與模型對照組差異極顯著(P<0.01)，劑量的增加后抑制作用迅速增強，呈明顯的劑量依賴性(表1)。

表1融合蛋白對人肺腺癌細(xì)胞株的影響(n＝5)

注：與模型組比較，^##P<0.01。

3.7scFv-LAAO融合蛋白對人肺腺癌細(xì)胞株H460荷瘤小鼠抑瘤率和生命延長率的影響

荷瘤小鼠注射scFv-LAAO融合蛋白后，高、中、低各組(100、50、20mg/kg體重)對小鼠實體瘤均有明顯的抑制作用。結(jié)果表明：在對荷瘤小鼠抑瘤方面，高、中、低各組融合蛋白與模型對照組相比為差異極顯著(P<0.01)(表2)；對肺癌荷瘤小鼠生命延長的影響方面，各純化融合蛋白組與模型對照組差異極顯著(P<0.01)(表3)。

表2融合蛋白對肺癌荷瘤小鼠抑瘤率的影響(n＝5)

注：與模型組比較，^##P<0.01；整個過程有小鼠死亡，因此，每組取5只。

表3融合蛋白對肺癌荷瘤小鼠生命延長率的影響(n＝5)

注：與模型組比較，^##P<0.01；整個過程有小鼠死亡，因此，每組取5只。

將兩段基因連接形成新的融合基因最常用的和效果最好的方法為重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)，這項技術(shù)在醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。SOE-PCR的主要原理是用PCR方法將兩段基因擴增出一段長約40bp的堿基序列重疊區(qū)，再通過兩段基因的上、下游引物進行連接與擴增。因竹葉青蛇毒LAAO基因是由人工合成的，故在5’-端設(shè)計了抗IL-4R單鏈抗體(scFv)的3’-端的重疊區(qū)用于兩段基因的連接橋梁，同時在基因序列時在3’-端加上了XhoⅠ酶切位點，并加上了一條連接肽用于蛋白形成時的正確空間折疊。其目的是簡化SOE-PCR的操作過程和引物設(shè)計，其中40bp堿基序列重疊區(qū)的長度有利于兩段基因的成功連接^[14]。單鏈抗體(scFv)是噬菌體抗體庫技術(shù)的建立，被譽為又一次革命性進展，其產(chǎn)生依賴于反轉(zhuǎn)錄PCR擴增全套免疫球蛋白可變區(qū)基因、大腸桿菌表達(dá)分泌功能性免疫球蛋白分子片段的成功和噬菌體表面展示技術(shù)的建立。scFv對腫瘤組織的穿透力強，可以與其他效應(yīng)分子連接成抗腫瘤融合蛋白等特點，是保持抗體親和性和特異性的最小功能性抗體片段，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)研究領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是SOE-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測；其中，M:Marker DNA2000；1:scFv與LAAO連接的PCR產(chǎn)物；

圖2是重組質(zhì)粒的XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切；(M:Marker DNA10000；1：XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的質(zhì)粒)；

圖3是scFv-LAAO蛋白序列預(yù)測分析；

圖4是融合蛋白scFv-LAAO考馬斯亮藍(lán)染色(M:Marker PR1800(22KD-120KD)；1,2：誘導(dǎo)3h蛋白表達(dá)產(chǎn)物上清液)；

圖5 scFv-LAAO蛋白在X光膠片下Western-Blot檢測(M:Marker PR1800(22KD-120KD)；1：誘導(dǎo)3h蛋白表達(dá)產(chǎn)物上清液)。

結(jié)論，本發(fā)明制備的抗IL-4R單鏈抗體與竹葉青蛇毒LAAO的融合蛋白，具有一定靶向抗腫瘤作用，可用于治療肺癌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用分子生物學(xué)技術(shù)抗IL-4R單鏈抗體基因(scFv)與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合基因的表達(dá)載體，在體外進行體外表達(dá)，重組抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白可用于治療肺癌，療效好，無副作用。

下面結(jié)合實施例對發(fā)明作進一步的說明，但并不作為對本發(fā)明限制的依據(jù)。

具體實施方式：

實施例1.

一種抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述融合蛋白的制備具體包括以下步驟：

(1)選擇酶切位點為EcoRⅠ和XhoⅠ的scFv基因序列，將scFv與LAAO兩段基因通過重疊延伸PCR技術(shù)進行連接，連接前將scFv基因序列的XhoⅠ酶切位點去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位點，在竹葉青蛇毒LAAO基因序列5’端加上帶有一段與抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列相同的重疊序列，以及一段連接肽連接基因，另外在“重疊序列”基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位點；

其中，設(shè)計引物F1和引物F2去除抗IL-4R單鏈抗體scFv基因序列的Xho I酶切位點；

(2)設(shè)計引物F1和F3，去除XhoⅠ酶切位點的scFv基因片段15μL，LAAO基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH₂O；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重復(fù)30個循環(huán)；72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳并用膠回收試劑盒回收基因片段；

(3)pET-28a載體/scFv-LAAO基因片段的雙酶切與目的片段回收：設(shè)計反應(yīng)體系：scFv-LAAO基因片段10μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH₂O 35.5μL；以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min滅活XhoⅠ酶；待冷卻至12℃，再加入2μL EcoRⅠ內(nèi)切酶，37℃酶切4h，65℃，滅活20min；取scFv-LAAO基因片段進行1％ 瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的片段；按照同樣方法對pET-28a載體進行雙酶切和回收目的片段；

(4)重組質(zhì)粒pET-28a-scFv-LAAO的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化：取經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切的pET-28a載體目的片段5-15μL、scFv-LAAO雙酶切目的片段35-45μL、Rapid T4DNA ligase 1-3μL、快速連接緩沖液5-25μL、ddH₂O 15-20μL，14-18℃過夜；參照《分子克隆實驗指南》中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建的pET-28a-scFv-LAAO重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后進行培養(yǎng)；所述快速緩沖液含Tris-HCl 0.1mol/L、MgCl₂20mmol/L、二硫蘇糖醇DTT 20mmol/L、三磷酸腺苷ATP 0.4mmol/L、鹽酸亞精胺1mmol/L和牛血清白蛋白BSA0.1mg/mL；

(5)重組質(zhì)粒酶切鑒定和蛋白質(zhì)分子量大小預(yù)測：取10個單菌落用裝有15mL的TB培養(yǎng)液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培養(yǎng)瓶中，于36-38℃環(huán)境下震蕩培養(yǎng)至0D₆₀₀＝0.6～0.8，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒；依次用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對該質(zhì)粒進行雙酶切鑒定；將成功酶切的質(zhì)粒送進行測序，并對測序結(jié)果進行蛋白質(zhì)氨基酸序列翻譯，并對翻譯結(jié)果進行預(yù)測分析；

(6)重組毒素scFv-LAAO抗體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：挑取平板上的單個菌落接種至裝有10mL的含卡那霉素50μg/mL的TB培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液4000rpm離心15min，重復(fù)三次，轉(zhuǎn)移菌液至裝有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入濃度為1mM的IPTG，于37℃快速振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)3h，即得。

所述scFv基因序列為：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGA TGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG；

所述引物F1為：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’；

所述引物F2為：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’；

所述引物F3為：5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’；

所述的抗IL-4R單鏈抗體與蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白用于治療肺癌及其并發(fā)癥。