本發(fā)明屬于生物分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的LAMP引物組及其方法。
背景技術(shù)：
伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，全球農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化速度也隨之大大加快，轉(zhuǎn)基因作物的推廣種植面積逐年遞增，然而，由于目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性尚無定論，各國政府和消費(fèi)者普遍對此采取謹(jǐn)慎的態(tài)度，紛紛出臺一系列法規(guī)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的貿(mào)易加以限制，要求對轉(zhuǎn)基因作物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識。因此，建立完善的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品及食品檢測體系顯得尤其重要。
CaMV35S是外源基因在植物中表達(dá)的常用調(diào)控元件，可作為轉(zhuǎn)基因生物的標(biāo)記，目前大部分轉(zhuǎn)基因生物都含有CaMV35S啟動子。CaMV35S啟動子的廣泛使用使其成為進(jìn)行轉(zhuǎn)基因初篩的首要目標(biāo)，因此可減少分析實驗室進(jìn)行特異性檢測的數(shù)量。在風(fēng)險分析和商業(yè)化過程中，考慮到轉(zhuǎn)基因生物的大規(guī)模篩選，篩選CaMV35S啟動子也是一種有效的方法。
現(xiàn)有技術(shù)中對于CaMV35S啟動子的特異性檢測主要有普通PCR方法、實時熒光PCR檢測方法。由于普通PCR方法、實時熒光PCR檢測方法需要經(jīng)歷變溫過程及其相應(yīng)的快速升降溫的溫度控制，也就需要價格高昂的專用PCR設(shè)備，而現(xiàn)場檢測要求降低對儀器的依賴，無法滿足現(xiàn)場檢測需要。不僅如此，PCR方法還存在污染嚴(yán)重、假陽性率高的問題，限制了PCR檢測方法的推廣。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（英文名稱為loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP）能在等溫條件下，短時間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴(kuò)增方法。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。本發(fā)明將LAMP技術(shù)運(yùn)用于農(nóng)產(chǎn)品及食品中轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S啟動子的快速檢測，可以免除高昂的儀器投入，便于基層及現(xiàn)場檢測使用。目前尚未出現(xiàn)可用于檢測CaMV35S啟動子且適于大規(guī)模應(yīng)用的LAMP引物組及其方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種可用于檢測CaMV35S啟動子且適于大規(guī)模應(yīng)用的LAMP引物組。
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中檢測CaMV35S啟動子的方法存在需要投入高昂的儀器、檢測操作繁瑣、檢測成本較高的問題，進(jìn)而提供一種操作簡單、檢測成本低的檢測CaMV35S啟動子的方法。
本發(fā)明的檢測CaMV35S啟動子的LAMP引物組，所述LAMP引物組包括CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；其中，所述CaMV-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.1為5`-GGCTCCTACAAATGCCATCA-3`；所述CaMV-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.2為5`-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3`；所述CaMV-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.3為5`-GGTGGGGGTCCATCTTTGGGTTTTAGGAAAGGCCATCGTTGAA-3`；所述CaMV-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.4為5`-CACGAGGAGCATCGTGGAAAAATTTTACGTCAGTGGAGATATCACA-3`；所述CaMV-LF引物具有如SEQ ID No.5所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.5為5`-ACCACTGTCGGCAGAGG-3`；所述CaMV-LB引物具有如SEQ ID No.6所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.6為5`-GAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA-3`。
優(yōu)選地，所述CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物的摩爾比為（1-3）:（1-3）：（4-24）:（4-24）：（2-12）：（2-12）。
本發(fā)明的檢測CaMV35S啟動子的方法，利用本發(fā)明所述的檢測CaMV35S啟動子的LAMP引物組進(jìn)行檢測。
優(yōu)選地，所述的檢測CaMV35S啟動子的方法，包括以下步驟：將權(quán)利要求1或2中所述的檢測CaMV35S啟動子的LAMP引物組與待測溶液混合，將混合液置于55-65℃下培育10min以上，觀察或檢測所述混合液的變化情況。
優(yōu)選地，所述混合液中還包括Bst DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述混合液中還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、甜菜堿、MgSO4、去離子水中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述混合液中還包括金屬指示劑；所述金屬指示劑為4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述混合液中還包括Mncl2；所述Mncl2與所述金屬指示劑的用量摩爾比為1:1。
本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述的LAMP引物組的檢測試劑盒。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案，相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）本發(fā)明的檢測CaMV35S啟動子的LAMP引物組，可實現(xiàn)對CaMV35S啟動子的檢測，并且具有簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)；更為重要的是，采用本發(fā)明的LAMP引物組對CaMV35S啟動子進(jìn)行檢測，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，所需的檢測儀器簡單，無需昂貴的PCR儀投入，結(jié)果可以通過常規(guī)的電泳判斷，也可以通過顏色變化直接判斷，降低了實驗室投入，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，適合基層實驗室推廣使用；
（2）本發(fā)明的檢測CaMV35S啟動子的方法，采用4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽作為金屬指示劑，由于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度高，極易造成污染，這也是環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增容易產(chǎn)生假陽性的原因，本發(fā)明采用的所述金屬指示劑能夠在反應(yīng)液配制時加入，反應(yīng)結(jié)束后，不需開蓋，直接通過反應(yīng)液顏色變化即可判斷結(jié)果，減少了氣溶膠污染的可能性，避免了假陽性的產(chǎn)生；
（3）本發(fā)明的檢測CaMV35S啟動子的方法，除將LAMP引物組與待測溶液混合外，還在混合液中加入了Bst DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸，保證了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的順利進(jìn)行，并且還加入了Bst DNA聚合酶緩沖液、MgSO4、甜菜堿、去離子水，多重試劑協(xié)同作用，使得其檢測的靈敏度提高、特異性增強(qiáng)、檢測率提高、檢測速度加快，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施方式
實施例1 檢測CaMV35S啟動子的LAMP引物組的設(shè)計
本實施例中，檢測CaMV35S啟動子的LAMP引物組包括所述LAMP引物組包括CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；其中，所述CaMV-F3引物具有如SEQ ID No.1所示的序列結(jié)構(gòu)；所述CaMV-B3引物具有如SEQ ID No.2所示的序列結(jié)構(gòu)；所述CaMV-FIP引物具有如SEQ ID No.3所示的序列結(jié)構(gòu)；所述CaMV-BIP引物具有如SEQ ID No.4所示的序列結(jié)構(gòu)；所述CaMV-LF引物具有如SEQ ID No.5所示的序列結(jié)構(gòu)；所述CaMV-LB引物具有如SEQ ID No.6所示的序列結(jié)構(gòu)。
所述SEQ ID No.1：5`-GGCTCCTACAAATGCCATCA-3`
所述SEQ ID No.2：5`-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3`
所述SEQ ID No.3：5`-GGTGGGGGTCCATCTTTGGGTTTTAGGAAAGGCCATCGTTGAA-3`
所述SEQ ID No.4：5`-CACGAGGAGCATCGTGGAAAAATTTTACGTCAGTGGAGATATCACA-3`
所述SEQ ID No.5：5`-ACCACTGTCGGCAGAGG-3`
所述SEQ ID No.6：5`-GAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA-3`
實施例2 LAMP引物組的對CaMV35S啟動子的檢測
本實施例中使用的轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S啟動子的陽性對照液購買自通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司，所述CaMV35S啟動子的基因片段具有如SEQ ID No.7所示的序列結(jié)構(gòu)，所述SEQ ID No.7為GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATC；DNA提取試劑盒購買自生物工程（上海）有限公司。需要說明的是，不僅僅是CaMV35S啟動子的陽性對照液、DNA提取試劑盒為現(xiàn)有技術(shù)公開的、市售的常規(guī)材料，本實施例中使用的Bst DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸、Bst DNA聚合酶緩沖液、甜菜堿、MgSO4、去離子水、4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽、Mncl2等均為現(xiàn)有技術(shù)公開的、市售的常規(guī)材料，不同原料、來源以及制備方法得到的上述產(chǎn)品并不影響本發(fā)明的實施及其效果（下同，后文不再冗述）。
采用實施例1中所述的LAMP引物組進(jìn)行肺CaMV35S啟動子的檢測，具體步驟如下：
（1）CaMV35S啟動子陽性對照液及陰性對照液的制備：
CaMV35S啟動子陽性對照液：將具有如SEQ ID No.7所示的序列結(jié)構(gòu)的CaMV35S啟動子基因，TA克隆至pUC57載體上，作為陽性對照模板，該陽性對照液由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司提供；
陰性對照液：用LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)大腸桿菌ATCC 25922，生物工程（上海）有限公司DNA提取試劑盒提取DNA，作為陰性對照液。
（2）CaMV35S啟動子的檢測：
將實施例1中所述的CaMV-F3引物、CaMV-B3引物、CaMV-FIP引物、CaMV-BIP引物、CaMV-LF引物、CaMV-LB引物；分別與步驟（1）中制備得到CaMV35S啟動子陽性對照液及陰性對照液混合，將兩組混合液分別置于60℃下培育60min，電泳所述混合液，觀察所述混合液的變化情況；
觀察結(jié)果：加入所述陽性對照液的混合液產(chǎn)生特異梯狀DNA條帶；加入所述陰性對照液的混合液未產(chǎn)生特異梯狀DNA條帶。由此可以說明，本發(fā)明的LAMP引物組可實現(xiàn)對CaMV35S啟動子的檢測。
實施例3 LAMP引物組對CaMV35S啟動子的檢測
采用實施例1中所述的LAMP引物組進(jìn)行CaMV35S啟動子的檢測，具體步驟如下：
取1μl濃度為10μM的所述CaMV-F3引物、1μl濃度為10μM的所述CaMV-B3引物、1μl濃度為40μM的所述CaMV-FIP引物、1μl濃度為40μM的所述CaMV-BIP、1μl濃度為20μM的所述CaMV-LF引物、1μl濃度為20μM的CaMV-LB引物、5μl濃度為5M的甜菜堿（英文名betaine）、3μl濃度為150mM的脫氧核糖核苷三磷酸（簡稱dNTP）、0.5μl濃度為100mM的MgSO4、2.5μl 濃度為10×的Bst DNA聚合酶緩沖液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1μl 濃度為8U/μl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、5μl的去離子水，分別與2μl的實施例2中所述的陽性對照液、所述陰性對照液混合，將兩組所述混合液置于65℃下培育60min，電泳所述混合液，觀察所述混合液的變化情況。
其中，所述Bst DNA聚合酶緩沖液的成分為：200 mMTris-HCl (pH 8.8 @ 25°C), 100 mMKCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100。需要說明的是，所述Bst DNA聚合酶緩沖液的成分并不唯一，只要能在反應(yīng)過程中起到緩沖作用的溶液即可，本實施例只是提供一種具體的實現(xiàn)方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際情況替換為其他成分的緩沖液（下同，后文不再冗述）。
觀察結(jié)果：加入所述陽性對照液的混合液產(chǎn)生特異梯狀DNA條帶；加入所述陰性對照液的混合液未產(chǎn)生特異梯狀DNA條帶。由此可以說明，本發(fā)明的LAMP引物組可實現(xiàn)對CaMV35S啟動子的檢測。
實施例4 LAMP引物組的對CaMV35S啟動子的檢測
采用實施例1中所述的LAMP引物組進(jìn)行CaMV35S啟動子的檢測，具體步驟如下：
取1μl濃度為10μM的所述CaMV-F3引物、1μl濃度為10μM的所述CaMV-B3引物、1μl濃度為40μM的所述CaMV-FIP引物、1μl濃度為40μM的所述CaMV-BIP、1μl濃度為20μM的所述CaMV-LF引物、1μl濃度為20μM的CaMV-LB引物、5μl濃度為5M的甜菜堿（英文名betaine）、3μl濃度為150mM的脫氧核糖核苷三磷酸（簡稱dNTP）、0.5μl濃度為100mM的MgSO4、2.5μl 濃度為10×的Bst DNA聚合酶緩沖液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1μl 濃度為8U/μl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、1μl濃度為0.4mM的4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽、1μl濃度為0.4mM的MnCl2、5μl的去離子水，分別與實施例2的步驟（1）中制備得到2μl的CaMV35S啟動子陽性對照液及2μl陰性對照液混合，將兩組混合液分別置于65℃下培育60min，觀察所述混合液的變化情況。
需要說明的是，作為本實施例的優(yōu)選實現(xiàn)方式，兩組混合液分別置于65℃下培育60min，采用水浴鍋進(jìn)行恒溫培育。
觀察結(jié)果：加入所述陽性對照液的混合液的顏色變?yōu)闇\黃色；加入所述陰性對照液的混合液顏色保持橘紅色。由此可以說明，本發(fā)明的LAMP引物組可實現(xiàn)對CaMV35S啟動子的檢測。
實施例5
采用實施例1中所述的LAMP引物組進(jìn)行CaMV35S啟動子的檢測，具體步驟如下：
取1μl濃度為10μM的所述CaMV-F3引物、1μl濃度為10μM的所述CaMV-B3引物、1μl濃度為40μM的所述CaMV-FIP引物、1μl濃度為40μM的所述CaMV-BIP、1μl濃度為20μM的所述CaMV-LF引物、1μl濃度為20μM的CaMV-LB引物、5μl濃度為5M的甜菜堿（英文名betaine）、3μl濃度為150mM的脫氧核糖核苷三磷酸（簡稱dNTP）、0.5μl濃度為100mM的MgSO4、2.5μl 濃度為10×的Bst DNA聚合酶緩沖液（英文名Bst DNA Polymerase Buffer）、1μl 濃度為8U/μl 的Bst DNA聚合酶（英文名Bst DNA Polymerase）、1μl濃度為0.4mM的4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽、1μl濃度為0.4mM的MnCl2、5μl的去離子水，分別與實施例2的步驟（1）中制備得到2μl的CaMV35S啟動子陽性對照液及2μl陰性對照液混合，每組設(shè)置6個重復(fù)，將兩組混合液分別置于65℃下培育60min，觀察所述混合液的變化情況。
需要說明的是，作為本實施例的優(yōu)選實現(xiàn)方式，兩組混合液分別置于65℃下培育60min，采用水浴鍋進(jìn)行水下恒溫培育，相比公開號為CN102140516B的專利文獻(xiàn)，本發(fā)明將所述混合液置于水下，進(jìn)行恒溫水浴，偶爾泄露的氣體將經(jīng)過水洗將擴(kuò)增產(chǎn)物溶解在水中，可防止核酸擴(kuò)增產(chǎn)物引起的氣溶膠污染，極大的減少了假陽性的產(chǎn)生，解決了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸：氣溶膠污染。
觀察結(jié)果：加入所述陽性對照液的混合液的顏色變?yōu)闇\黃色，6個重復(fù)全部變?yōu)闇\黃色；加入所述陰性對照液的混合液顏色保持橘紅色，6個重復(fù)均保持橘紅色。由此可以說明，本發(fā)明的LAMP引物組可實現(xiàn)對CaMV35S啟動子的檢測。本發(fā)明中金屬指示劑4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚鈉鹽所檢測的是環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的副產(chǎn)物焦磷酸根，即可以提前加入到反應(yīng)體系中，又不受引物二聚體的影響；而公開號為CN102140516B的專利文獻(xiàn)中通過渾濁度或使用指示劑SYBR Green 判斷擴(kuò)增結(jié)果，通過焦磷酸鎂引起的渾濁度來判斷，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引起的渾濁度變化不明顯易受操作人員主觀因素的影響而誤判，SYBR Green 是通過插入到擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA中熒光受到激發(fā)而強(qiáng)度增強(qiáng)，以此判斷擴(kuò)增結(jié)果，而此方法易受引物二聚體的影響。
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 許昌學(xué)院
<120> 用于檢測轉(zhuǎn)基因成分CaMV35S的LAMP引物組及其方法
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 20
<212> DNA
<213> CaMV-F3
<400> 1
ggctcctaca aatgccatca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> CaMV-B3
<400> 2
gatagtggga ttgtgcgtca 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> CaMV-FIP
<400> 3
ggtgggggtc catctttggg ttttaggaaa ggccatcgtt gaa 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> CaMV-BIP
<400> 4
cacgaggagc atcgtggaaa aattttacgt cagtggagat atcaca 46
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> CaMV-LF
<400> 5
accactgtcg gcagagg 17
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> CaMV-LB
<400> 6
gaagacgttc caaccacgtc ttca 24