本發(fā)明屬于基因診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及角蛋白12(KRT12)基因在檢測(cè)圓錐角膜中的應(yīng)用。

發(fā)明背景

圓錐角膜(keratoconus)是一種原發(fā)性變性疾病，以角膜擴(kuò)張、中央變薄向前突出，呈圓錐形為特征的一種眼病。它常造成高度不規(guī)則近視散光，晚期會(huì)出現(xiàn)急性角膜水腫，形成瘢痕，視力顯著下降。多于青春期發(fā)病，緩慢發(fā)展。圓錐角膜在臨床并不少見(jiàn)。世界范圍普通人群的患病率為0.5‰～2.3‰，歐美為0.1‰～0.5‰，日本為0.7‰～0.8‰，中國(guó)0.4‰，不同種族之間存在差異，雖然其發(fā)病率相對(duì)并不高，但由于它主要響影青壯年，因此它對(duì)社會(huì)所造成的健康危害遠(yuǎn)高于它的發(fā)病率及臨床癥狀所表現(xiàn)出來(lái)的嚴(yán)重程度。

原發(fā)性圓錐角膜的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不明了,可能是多因素的結(jié)果,如遺傳學(xué)說(shuō)、膠原學(xué)說(shuō)、基因?qū)W說(shuō)、基質(zhì)學(xué)說(shuō)、代謝與發(fā)育障礙學(xué)說(shuō)等。較多學(xué)者認(rèn)為本病為常染色體隱性遺傳。圓錐角膜可獨(dú)立發(fā)生，也可作為眼部或全身綜合征的伴發(fā)癥狀。根據(jù)病情的進(jìn)展，在疾病的早期，單純眼鏡就可矯正。當(dāng)角膜不規(guī)則散光明顯增大時(shí)，應(yīng)要配戴硬性角膜接觸鏡(RGP)來(lái)矯正視力。但RGP不能阻止病情發(fā)展，當(dāng)RGP不能配戴或矯正視力差時(shí)需要做角膜移植手術(shù)，給患者及全社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在早期及中期可行角膜膠原交聯(lián)手術(shù)來(lái)加固角膜硬度，一定程度上減緩圓錐角膜進(jìn)展速度。這種現(xiàn)狀促使進(jìn)一步去發(fā)現(xiàn)和了解該病新的致病基因，為后續(xù)基因診斷、產(chǎn)前診斷及基因治療提供基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種KRT12基因在制備檢測(cè)圓錐角膜診斷制品中的應(yīng)用，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

申請(qǐng)人從一個(gè)圓錐角膜家系中，發(fā)現(xiàn)該家系的KRT12基因存在遺傳上的致病突變，經(jīng)檢測(cè)為與圓錐角膜疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，從而促成了本發(fā)明。

本發(fā)明首先提供KRT12基因新的用途，是在制備用于檢測(cè)圓錐角膜營(yíng)診斷制品中的應(yīng)用；

上述的診斷制品，作為實(shí)施例的優(yōu)選，是檢測(cè)圓錐角膜的引物或探針。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種與圓錐角膜疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為KRT12基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第1456位與1457位之間,插入了堿基為GAT；

檢測(cè)上述SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，其引物信息如下：

本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)圓錐角膜的試劑盒，包含有上述的引物對(duì)中任一種或幾種。

其中用于檢測(cè)上述SNP位點(diǎn)的引物信息如下：

KRT12-8.1L：CAACCAGTGTTGGATTAATATTTG SEQ ID NO:15

KRT12-8.1R：CCAGGTCCAGAAGGATATAAGG SEQ ID NO:16

本發(fā)明提供了KRT12基因的新的用途，從而提供了一種有效的進(jìn)行圓錐角膜疾病基因診斷、產(chǎn)前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應(yīng)用效果表明本發(fā)明所提供的基因的SNP位點(diǎn)及檢測(cè)引物可以有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進(jìn)行KRT12基因突變位點(diǎn)的快速檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

KRT12基因由7108個(gè)核苷酸堿基組成，位于17q12，可轉(zhuǎn)錄成大約1485bp的mRNA(NM_000223.3)，直接翻譯形成494個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：從圓錐角膜患者中篩選KRT12基因的突變位點(diǎn)

1、提取外周血基因組DNA：

在符合國(guó)家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對(duì)象同意的基礎(chǔ)上，抽取第一個(gè)家系成員外周靜脈血2-5ml，放入EDTA抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆?；凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500μL放于離心管，加入等體積TE(pH8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。

加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過(guò)夜。從水浴中取出樣品，瞬時(shí)離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的Tris-飽和酚(約300μL)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μL)至一新離心管中。重復(fù)酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入l/10體積3mol/L、pH5.2醋酸鈉(約30μL)，2倍體積預(yù)冷100％乙醇，輕輕混合，可見(jiàn)白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃過(guò)夜溶解DNA。

對(duì)提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，檢測(cè)DNA純度及濃度。

2.直接測(cè)序法驗(yàn)證該家系內(nèi)患者KRT12基因的突變

PCR擴(kuò)增目的片段：反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：

(1)PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃40sec，55±2℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。

(2)反應(yīng)體系：(TAKARA LA Taq polymerase)

應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進(jìn)行每名家系成員的基因組DNA模板與該KRT12引物的擴(kuò)增反應(yīng)。1456位與1457位之間,插入了堿基為GAT

PCR產(chǎn)物測(cè)序：應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序法對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，該家系中三名患者的KRT12基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第1456位與1457位之間發(fā)生了雜合突變，插入了堿基為GAT，引起KRT12蛋白第486位由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?，?87位突變?yōu)榻K止密碼子。應(yīng)用突變預(yù)測(cè)程序Mutation Taster預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該突變導(dǎo)致了KRT12蛋白功能“disease causing”級(jí)的損壞，從而引起了該家系中圓錐角膜的發(fā)生。多次測(cè)序結(jié)果表明該突變位點(diǎn)并不是因?yàn)閿U(kuò)增或測(cè)序錯(cuò)誤引進(jìn)的。在200例正常當(dāng)?shù)厝巳杭霸摷蚁抵姓Ｈ说耐庵苎蚪MDNA樣本中進(jìn)行該位點(diǎn)的突變篩查,未發(fā)現(xiàn)該突變。

在山東省眼科研究所暨青島眼科醫(yī)院收集診斷明確的圓錐角膜散發(fā)患者一名，提取其外周血基因組DNA，應(yīng)用該患者的DNA模板與KRT12-8.1L和KRT12-8.1R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用常規(guī)Sanger測(cè)序法對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，該患者的KRT12基因存在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的SNP突變，即編碼區(qū)域由起始密碼子起第1456位與1457位之間發(fā)生了雜合突變，插入了堿基為GAT，引起KRT12蛋白第486位由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔?87位突變?yōu)榻K止密碼子。

上述結(jié)果表明KRT12基因可以用來(lái)檢測(cè)患者是否具有潛在患圓錐角膜的危險(xiǎn)。通過(guò)將檢測(cè)者的KRT12基因的各外顯子片段于正常的對(duì)應(yīng)片段比較，確定待檢測(cè)者的患病風(fēng)險(xiǎn)。