本發(fā)明屬于單染色體分離技術領域，具體涉及一種植物單染色體的激光顯微切割分離方法。

背景技術：

染色體的微分離是隨著分子生物學發(fā)展、結合了分子生物學和細胞遺傳學技術而誕生的一種特異性基因克隆技術，能根據(jù)實驗需要分離任何染色體或片段，然后創(chuàng)建有關DNA文庫，并完成相關的分子生物學研究。染色體顯微切割是指在顯微鏡下將染色體區(qū)段或目標染色體從標本中切割和分離出來的技術，是細胞遺傳學和分子遺傳學結合的橋梁，在分子遺傳圖譜和物理圖譜構建、重要基因分離、染色體進化、比較基因組和單染色體測序等研究中廣泛應用，特別是隨著第三代測序技術—單分子測序技術的發(fā)展，對單染色體分離提出了更高的要求。激光顯微切割方法是對植物單染色體進行分離的一種方法，現(xiàn)有的染色體制片方法對染色體的分散度有限，增加了后續(xù)激光顯微切割分離單染色體的難度，且現(xiàn)有制片方法還容易破壞染色體或得到的染色體不完整，存在一定不足，不僅如此植物單染色體一般較小，現(xiàn)有采用激光顯微切割的方法中操作參數(shù)多不適用于植物單染色體的切割，紫外激光容易破壞較小的植物染色體，因而分離不出符合后續(xù)試驗研究條件的植物單染色體。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明要解決的技術問題是：針對現(xiàn)有技術中制得的染色體裝片中染色體分離度不夠、給后期紫外顯微切割增加了難度，且現(xiàn)有激光顯微切割方法操作參數(shù)不適用于植物單染色體的分離，容易對植物單染色體造成破壞的技術問題，而提供一種適用于植物單染色體分離、不會對植物單染色體造成破壞、操作難度小的植物單染色體的激光顯微切割分離方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：一種植物單染色體的激光顯微切割分離方法，先將需要進行單染色體分離的植物器官置于一氧化二氮氣體中進行預處理，隨后對預處理后的植物器官進行固定處理和酶解處理，將酶解后的植物器官破碎并配制成細胞懸液，將細胞懸液滴加到載玻片或蓋玻片上得到染色體裝片，向制得的染色體裝片中滴加染液后進行干燥，采用顯微鏡對干燥后的染色體裝片進行觀察確定需要分離的目標染色體，采用激光捕獲顯微切割法對所述目標染色體進行分離。針對采用現(xiàn)有的單染色體分離方法分離得到的染色體裝片上染色體分離度不夠，在后期采用紫外切割方法對單染色體進行分離時容易破壞染色體，且分離難度較大的技術問題，本發(fā)明通過創(chuàng)造性的研究提出前期制片時采用一氧化二氮對植物器官進行預處理，采用這樣的預處理方法處理后的植物細胞經酶解后染色體更容易分散開，且采用滴片的方式進行制片，僅利用滴加時的重力就可以使植物細胞破裂，植物染色體中單個染色體之間分散效果更好，且這種滴片方式不會對染色體造成傷害，能夠得到完整的、均勻分布、分散度較好的染色體，使激光切割后期分離的難度降低，避免了激光切割過程中因染色體之間距離過近而引起的目標染色體被紫外激光破壞或被其他染色體污染的問題，使用激光捕獲顯微切割法對采用上述方法制得的染色體裝片上目標染色體進行分離，操作難度降低，獲得的單染色體形狀不受破壞。

進一步，采用激光捕獲顯微切割法對所述目標染色體進行分離的具體步驟為：先采用紫外激光對目標染色體區(qū)域進行切割使目標染色體區(qū)域與染色體裝片上其他區(qū)域相分離，然后將乙烯乙酸乙烯酯膜置于切割后的目標染色體區(qū)域上，使用紅外激光脈沖激活乙烯乙酸乙烯酯膜，使乙烯乙酸乙烯酯膜熔化并滲透到目標染色體區(qū)域的組織間隙中，將乙烯乙酸乙烯酯膜從染色體裝片上分離使目標染色體粘附在乙烯乙酸乙烯酯膜上，完成對目標染色體的分離。這樣，先采用紫外激光將目標染色體區(qū)域進行切割，使目標染色體區(qū)域與染色體裝片上其他區(qū)域之間相割開，然后采用紅外可以對目標染色體激光脈沖激活乙烯乙酸乙烯酯膜，使乙烯乙酸乙烯酯膜熔化并滲透到目標染色體區(qū)域的組織間隙中，并迅速凝固，由于目標染色體區(qū)域組織與乙烯乙酸乙烯酯膜的粘合力超過目標染色體區(qū)域組織與染色體裝片之間的粘合力，將乙烯乙酸乙烯酯膜從染色體裝片上取下時，目標染色體粘附在乙烯乙酸乙烯酯膜上，完成對目標染色體的分離。

再進一步，采用能量為20-30mW的紫外激光對染色體裝片上目標染色體區(qū)域進行切割，切割速率為280-350μm/s。采用這樣能量的紫外激光進行切割，減少紫外激光對染色體的損傷，且采用這樣的切割速率切割的路徑的寬度較小，更適合于染色體體積比較小的植物染色體進行切割分離，避免對目標染色體造成損傷。

作為優(yōu)化，采用一個紅外激光點脈沖激活乙烯乙酸乙烯酯膜，所述紅外激光點的直徑為15-35μm、能量參數(shù)為50-85mW，對乙烯乙酸乙烯酯膜的激活持續(xù)時間為35-50ms。采用這樣能量、直徑的紅外激光，避免了紅外激光能量過小，膜不能和目標染色體接觸，無法粘附染色體的問題，同時也避免了紅外能量過大容易將粘附的樣品變成黑色，在顯微鏡下無法觀察目標染色體是否被粘附的問題，且植物染色體比較小，因此本發(fā)明選用一個紅外激光點即可對目標染色體進行粘附，對目標染色體沒有造成損傷。

作為又一優(yōu)化，將需要進行單染色體分離的植物器官置于0.5~1個大氣壓力的一氧化二氮氣體中進行預處理2~3h。這樣的預處理方式，使得植物器官酶解后染色體更容易分散開，染色體之間的分散度好。

作為另一優(yōu)化，所述固定處理為采用質量體積比為90%的醋酸水溶液對預處理后的植物器官進行固定處理2~3h。采用醋酸水溶液對植物器官中的染色體進行固定處理，可以使植物器官的染色體保持原有的形態(tài)和結構，便于后期進行觀察。

作為再一優(yōu)化，所述酶解處理為采用復合酶液對植物器官于37~42℃下進行酶解處理5~6 h，所述復合酶液為將質量濃度為4~6 %的纖維素酶溶液和質量濃度為4~6%的果膠酶溶液按照1:1的體積比混合制得。這樣的酶解條件更有利于植物細胞壁的酶解，使酶解后的植物器官更容易進行破碎制成細胞懸液。

更進一步，從載玻片或蓋玻片上方20~30cm高度處將所述細胞懸液滴加到載玻片或蓋玻片上，制得染色體裝片。這樣既避免了高度太矮而使得懸液在空中停留時間過短，重力不足以使細胞破裂或破碎不完全的問題，也避免了高度過高操作不方便且容易將滴加的懸液噴濺到載玻片以外區(qū)域，而使得載玻片上沾染細胞懸液過少的問題。

更進一步，所述植物器官為玉米器官。本發(fā)明方法尤其適用于玉米器官中單染色體的分離，分離效果好、分離效率高，5~10分鐘即可分理出1條染色體。

相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明方法制得的染色體裝片中分裂相染色體呈圓形或橢圓形分散，染色體分布均勻，染色體交叉少，分散度較好，且可以通過調整材料的濃度和滴片的高度，控制染色體分散的程度，解決了現(xiàn)有技術中染色體裝片染色體分散度不夠、染色體相互交叉而使得后期激光顯微分離難度增大、容易破壞染色體的技術問題。

2、本發(fā)明針對植物染色體形態(tài)小等性質，對激光顯微切割的具體參數(shù)進行了創(chuàng)造性的優(yōu)化，減少紫外激光對染色體的損傷，也避免了紅外能量大小不合適造成的無法粘附染色體或容易將粘附的樣品變成黑色，在顯微鏡下無法觀察目標染色體是否被粘附的問題，使本發(fā)明方法更加適合于植物染色體的切割分離。

3、采用本發(fā)明方法分離單染色體的效率高，5-10分鐘可以分離1條染色體，提高了單染色體分離的效率，分離得到的單染色體結構沒有收到破壞，滿足后期試驗研究要求，為今后開展分子遺傳圖譜和物理圖譜構建、重要基因分離、染色體進化、比較基因組和單染色體測序等研研究提供一個重要的手段。

附圖說明

圖1為確定的目標染色體；

圖2為紫外紫光切割之后的目標染色體；

圖3為紅外粘附后的目標染色體區(qū)域；

圖4為EVA膜粘附后觀察的目標染色體。

具體實施方式

下面結合具體實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。本實施案例在以本發(fā)明技術為前提下進行實施，現(xiàn)給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下的實施例。

下述實施例使用的主要儀器耗材、試劑配制及操作步驟如下：

1、儀器耗材

智能光照培養(yǎng)箱、笑氣處理裝置（包括笑氣罐、減壓閥和反應室，笑氣罐的出氣口處安裝有減壓閥，反應室通過管路與笑氣罐的出氣口相連通）、微量移液器（量程100ul），電爐、膜玻片、收集蓋、ArcturusXT 顯微分離儀器。

2、試劑配制

（1）體積濃度90%醋酸：將醋酸：超純水按9:1配成90%的醋酸溶液。

（2）質量濃度2.5%酶液配制：0.05g纖維素酶（R10）+1000ul檸檬酸鈉緩沖液→5%纖維素酶分裝PCR管，沒管40ul；0.05g果膠酶（y-23）+1000ul檸檬酸鈉緩沖液→5%果膠酶，裝入原纖維素酶PCR管中，配成體積比1:1的酶液。

（3）體積濃度70%乙醇：將乙醇：超純水按7:3配成70%的乙醇溶液。

（4）20mg/ml蛋白酶K：將200 mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解，不要渦旋混合，加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

3、操作步驟

（1）供試材料

玉米自交系B73。

（2）發(fā)取根尖

將玉米種子放于裝滿細沙的磁盤中，置于人工氣候箱中，25℃培養(yǎng)。待根長至1-1.5 cm時，剪取根尖，放入5 ml離心管。

（3）笑氣預處理

用雙蒸水將玉米根尖洗凈，將根蘸濕后裝入5ml 離心管中，保持蓋打開，讓濕潤的根貼于管壁，但水不能成股流下。將5ml 離心管放入0.5個大氣壓的笑氣（N₂O）處理罐中，對玉米根尖進行預處理2h。

（4）固定

向5ml 離心管中加入4 ml 90%醋酸，固定2h。

（5）酶解

將根從醋酸中取出，用雙蒸水清洗2-3次。取出玉米根尖，將根置于載玻片上，吸干水，切下根尖乳白色分生區(qū)，置于0.2 ml離心管中，加上述配好的果膠酶和纖維素酶的混合酶液，37℃酶解4-5h，酶解至根尖一觸即破。

（7）滴片

酶解完成后，用70%酒精小心吹洗根尖分生區(qū)外表皮2-3次，吹洗完成的根尖加入三分之一的70%酒精6000轉離心1min，將上清液倒去，如此反復兩次。加純醋酸，用解剖針將根尖搗碎。每次滴片取1-2個根尖1個根尖加20ul醋酸，2個根尖加35ul醋酸，混勻。用移液器吸取10ul混合液，滴于載玻片或蓋玻片上（依裝片用途而定），槍頭距離載玻片或蓋玻片10-20cm，陰涼干燥后加入半滴卡包品紅染液，染色5-10分鐘。37℃干燥2小時，如果制片沒有干燥將嚴重影響切割的效果。

（8）切割

在 Eclipse Ti 顯微鏡下進行鏡檢，確定目標染色體（圖1），由圖1可以看出采用本實施例方法制得的染色體裝片上染色體的分離度好，染色體之間沒有交叉，且沒有破壞染色體的形狀，更有利于后期紫外顯微切割對單染色體進行分離，染色體分散度好使后期切割得到單染色體的難度降低。

使用ArcturusXT 顯微分離儀器分離目標染色體，先用紫外激光進行切割，由于玉米染色體相對較小，要求切割的路徑的寬度要盡量小、能量盡量低，以切割相鄰的染色體、減少紫外激光對染色體的損傷，當能量過大，切割的路徑的寬度較大，容易損傷目標染色體。圖2所示，當能量為20-30mW、速度為時280-350um/s，能較好的對染色體進行切割。

紫外激光切割之后，將乙烯乙酸乙烯酯膜（EVA膜）置于載玻片或蓋玻片對應目標染色體的位置上，將紅外激光對準EVA膜的位置，使紅外激光脈沖激活熱塑膜，使EVA膜局部熔化，熔化后的EVA膜滲透到載玻片或蓋玻片上目標染色體細小的組織間隙中，并迅速凝固，由于目標染色體區(qū)域組織與EVA膜的粘合力超過目標染色體區(qū)域組織與載波片或蓋玻片的粘合力，從而可以借助紅外激光將目標染色體粘附起來，將乙烯乙酸乙烯酯膜從染色體裝片上分離使目標染色體粘附在乙烯乙酸乙烯酯膜上，達到分離目標單染色體的目的。由于玉米染色體比較小，只需要一個紅外激光點即可粘附目標染色體，紅外激光對樣品沒有損傷，但仍需調試紅外激光的能力大小，紅外激光能量過小，膜不能和目標染色體接觸，無法粘附染色體。能量過大，容易將粘附的樣品變成黑色，在顯微鏡下無法觀察目標染色體是否被粘附。如圖3和圖4所示，當紅外激光點直徑為15-35μm，能量參數(shù)為50-85mW、紅外持續(xù)時間為35-50ms時，能較好粘附分離的目標染色體，得到的目標單染色體如圖4，由圖4可以看出采用本實施例方法切割得到的單染色體結構完整，沒有受到破壞，能夠滿足分子遺傳圖譜和物理圖譜構建、重要基因分離、染色體進化、比較基因組和單染色體測序等研究對單染色體的要求。

（9）回收目標染色體

將粘附目標染色體的EVA膜置于收集管中，并加10 ul 20mg/ml蛋白酶K溶解1-2天后，離心，收集上清液得到目標染色體，將目標染色體-20℃保存樣品，備用。

需要說明的是，植物細胞和植物染色體均具有相似性，采用本發(fā)明方法對各種植物細胞進行單染色體分離，均可以獲得形態(tài)完整的單染色體，在此不一一列舉。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。