本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向骨細胞分化的方法。

背景技術(shù)：

骨骼移植(植骨)是治療骨缺損、骨折不連接和進行脊柱融合術(shù)的必需手段。傳統(tǒng)植骨材料為自體骨骼、異體骨骼和人工骨材料，這些中除自體松質(zhì)骨有少許成骨細胞外，均只能提供充填和支架作用；需肌體將其逐步吸收、成骨替代，過程緩慢，再出現(xiàn)骨不連、骨缺損或脊椎間假關(guān)節(jié)發(fā)生率高，影響了植骨效果。近年來組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為解決傳統(tǒng)植骨術(shù)后骨形成緩慢和新骨形成不良等技術(shù)難點提供了一種有效解決途徑。骨組織工程技術(shù)主要包括成骨支架、成骨細胞和調(diào)控成骨分化的細胞因子三個方面。目前研究表明，各類已發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細胞等干細胞的研究和應(yīng)用從很大程度上解決了骨組織工程人工骨的種子細胞來源問題。進而，如何促進細胞的增殖和成骨分化成為組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和研究熱點。

骨骼肌源性干細胞(muscle-derived stem cells)是成年動物或人肌肉組織中特有的干細做為中胚層起源的一種成體間充質(zhì)干細胞，具有自我更新能力和多項分化的潛能，可在體外分化為血細胞、骨細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等系的細胞。骨骼肌干細胞這種功能特性極大地吸引了來自基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究者，給基礎(chǔ)科學(xué)的研究者們提供了一種研究發(fā)展生物學(xué)的模式，骨骼肌干細胞所具有的修復(fù)、替代和再生能力也為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個發(fā)展新療法的機會。

目前，對于MDSCs成骨分化誘導(dǎo)的研究主要集中于不同細胞因子對其生物學(xué)行為產(chǎn)生的不同影響，其誘導(dǎo)效果并不理想。因此，進一步開發(fā)MDSCs成骨分化的方法，能夠進一步促進骨骼移植技術(shù)的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種細胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用 和誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向骨細胞分化的方法，本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)液能夠促進骨骼肌干細胞向骨細胞分化，其分化周期短，分化效率高。

本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、IGF-1、BMP-2、PRP和FBS。

胎牛血清(fetal calf serum，簡稱FBS)是血清中的一種，能夠提供維持細胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

富血小板血漿(PRP)是血液經(jīng)過離心得到的血小板濃縮物，富含各種生長因子，經(jīng)激活后釋放大量的生長因子，如血小板源性生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子等。這些生長因子已被證實，在單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用時能刺激細胞增殖、分化，對軟組織和骨組織的愈合有促進作用。

骨成形蛋白(BMP)能誘導(dǎo)機體內(nèi)的間充質(zhì)細胞不可逆地分化為軟骨和骨細胞。將BMP植入軟組織內(nèi)，可異位誘導(dǎo)新骨的形成。

類胰島素一號增長因子(IGF-1)也被稱作“促生長因子”，對維持與細胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長因子合用能促進細胞分化成熟。

維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉是目前干細胞成骨誘導(dǎo)或稱軟骨誘導(dǎo)液中常見組分，其中，地塞米松通過促進Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表達而促進骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化。β-甘油磷酸鈉可以為成骨細胞提供磷酸離子，同時促進生理性鈣鹽的沉積和鈣化，是骨髓基質(zhì)干細胞產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)的必要條件。維生素C(抗壞血酸)在體外能增加鈣鹽的沉積，促進礦化結(jié)節(jié)的形成，并通過間充質(zhì)細胞間接調(diào)節(jié)破骨細胞的分化。

本發(fā)明以維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、IGF-1、BMP-2、PRP、FBS添加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，作為骨骼肌干細胞成骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。提高了骨骼肌干細胞向骨細胞分化的數(shù)量并縮短分化的時間。實驗表明，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)液誘導(dǎo)骨骼肌干細胞，能夠在7d內(nèi)即出現(xiàn)骨細胞的特性，細胞形態(tài)發(fā)生改變且茜素紅染色細胞數(shù)目增多。誘導(dǎo)21天后，細胞中OPN和Col-I基因的表達量增加，且顯著(p<0.05)高于對比例中的OPN和Col-I基因的表達量。

在本發(fā)明的實施例中，PRP的體積分數(shù)為8％～12％；FBS的體積分數(shù)為8％～12％。

在一些實施例中，PRP的體積分數(shù)為10％；FBS的體積分數(shù)為10％。

在一些實施例中，PRP的體積分數(shù)為12％；FBS的體積分數(shù)為8％。

在一些實施例中，PRP的體積分數(shù)為8％；FBS的體積分數(shù)為12％。

在本發(fā)明的實施例中，IGF-1的濃度為20μg/L～30μg/L；BMP-2的濃度為80μg/L～120μg/L。

在一些實施例中，IGF-1的濃度為20μg/L；BMP-2的濃度為120μg/L。

在一些實施例中，IGF-1的濃度為30μg/L；BMP-2的濃度為80μg/L。

在一些實施例中，IGF-1的濃度為25μg/L；BMP-2的濃度為100μg/L。

在本發(fā)明的實施例中，維生素C的濃度為40μg/L～60μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-7mol/L～1×10^-9mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為8mol/L～12mol/L。

在一些實施例中，維生素C的濃度為40μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-7mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為12mol/L。

在一些實施例中，維生素C的濃度為60μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-9mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為8mol/L；

在一些實施例中，維生素C的濃度為50μg/L；地塞米松的濃度為1×10^-8mol/L；β-甘油磷酸鈉的濃度為10mol/L；

在一些實施例中，維生素C的濃度為50μg/L；

地塞米松的濃度為1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉的濃度為10mol/L；

IGF-1的濃度為25μg/L；

BMP-2的濃度為100μg/L。

在一些實施例中，維生素C的濃度為40μg/L；

地塞米松的濃度為1×10^-7mol/L；

β-甘油磷酸鈉的濃度為12mol/L；

IGF-1的濃度為20μg/L；

BMP-2的濃度為120μg/L。

在一些實施例中，維生素C的濃度為50μg/L；

地塞米松的濃度為1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉的濃度為10mol/L；

IGF-1的濃度為25μg/L；

BMP-2的濃度為100μg/L；

PRP的體積分數(shù)為10％；

FBS的體積分數(shù)為10％。

在本發(fā)明的實施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12無血清培養(yǎng)液。

本發(fā)明所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液可為自制也可為購買獲得，本發(fā)明對此不做限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明采用的人干細胞無血清培養(yǎng)基為DMEM/F12無血清培養(yǎng)液。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中不含有抗生素，而是通過更加適宜的培養(yǎng)條件，促進骨骼肌干細胞向骨細胞的分化，增強目標細胞的生長勢，降低感染風險。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠誘導(dǎo)骨骼肌細胞相骨細胞的分化，分化效率高，速度快。實驗表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，堿性磷酸酶活性增高，成骨細胞標志性基因OPN、Col-I表達量增高，茜素紅染色細胞數(shù)量增多。

本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)液在誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向骨細胞分化中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向骨細胞分化的方法，骨骼肌干細胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至70％～80％融合后以本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)。

在本發(fā)明的實施例中，誘導(dǎo)的時間為7d～21d。

在本發(fā)明的實施例中，骨骼肌干細胞為3～5代的骨骼肌干細胞。

一些實施例中，骨骼肌干細胞為第3代的骨骼肌干細胞。

本發(fā)明中，骨骼肌干細胞的分離方法包括：

步驟1：將骨骼肌破碎后，經(jīng)Dispase II和I型膠原酶消化后，以胰蛋白酶消化，獲得細胞以培養(yǎng)基重懸；

步驟2：差速貼壁法對步驟1中所得細胞進行分離，獲得骨骼肌干細胞。

在本發(fā)明中，骨骼肌為顳肌。

差速貼壁具體為：將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分數(shù)為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細胞記為PP1，其中未貼壁細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標記為PP3。以后每24h進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，記為骨骼肌干細胞。

骨骼肌干細胞培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，待細胞生長融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

骨骼肌干細胞(MDSCs)原代培養(yǎng)8-10天，待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，加入含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進行細胞記數(shù)，按8×10⁴cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

在本發(fā)明中，誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向骨細胞分化前，骨骼肌細胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的接種密度為1×10⁴cell/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)液。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、IGF-1、BMP-2、PRP和FBS。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠作為骨骼肌干細胞成骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)液。提高了骨骼肌干細胞向骨細胞分化的數(shù)量并縮短分化的時間。實驗表明，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)液誘導(dǎo)骨骼肌干細胞，能夠在7d內(nèi)即出現(xiàn)骨細胞的特性，14d細胞形態(tài)發(fā)生改變且茜素紅染色細胞數(shù)目增多。誘導(dǎo)21天后，細胞中OPN和Col-I基因的表達量增加，且顯著(p<0.05)高于對比例中的OPN和Col-I基因的表達量。

附圖說明

圖1示MDSCs P2代形態(tài)；其中，圖1-a的放大倍數(shù)為40×；圖1-b的放大倍數(shù)為100×；

圖2示各組細胞染色效果；其中，圖2-a-1示對照組1細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-a-2示對照組1細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-a-3示對照組1細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-a-4示對照組1細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-b-1示對照組2細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖 2-b-2示對照組2細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-b-3示對照組2細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-b-4示對照組2細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-c-1示對照組3細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-c-2示對照組3細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-c-3示對照組3細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-c-4示對照組3細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-d-1示對照組4細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-d-2示對照組4細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-d-3示對照組4細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-d-4示對照組4細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-e-1示對照組5細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-e-2示對照組5細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-e-3示對照組5細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-e-4示對照組5細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-f-1示實驗組1細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-f-2示實驗組1細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-f-3示實驗組1細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-f-4示實驗組1細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-g-1示實驗組2細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-g-2示實驗組2細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-g-3示實驗組2細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-g-4示實驗組2細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；圖2-h-1示實驗組3細胞誘導(dǎo)14天放大40倍效果；圖2-h-2示實驗組3細胞誘導(dǎo)14天放大100倍效果；圖2-h-3示實驗組3細胞誘導(dǎo)21天放大40倍效果；圖2-h-4示實驗組3細胞誘導(dǎo)21天放大100倍效果；

圖3示各組細胞OCN基因、Col-I基因、Runx2基因表達水平比較；柱子從左至右依次示對照組1、對照組2、對照組3、對照組4、對照組5、實驗組1、實驗組2、實驗組3；*示與對照組1存在顯著性差異，p<0.05；**示與對照組1存在極顯著性差異，p<0.01。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種細胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)骨骼肌干細胞向骨細胞分化的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的材料和儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1 MDSCs的分離和傳代

1、取材：

取成人正常顳肌標本(取自于開顱手術(shù)患者)，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗后轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎塊，然后移入50mL離心管中，PBS緩沖液吹打沖洗3次，靜置1分鐘后棄上層液及漂浮組織。

2、酶解：

向上述獲得的肌肉碎塊加入2倍的體積的混合酶，包括2.4u/mLDispase II、1％I型膠原酶，2.5mmol/L CaCl2，混勻后置37℃恒溫搖床中消化60min左右，直到試管中的肌肉碎塊消化為肌糜，肉眼看不到肌塊。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入2～3倍體積的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混勻后置37℃恒溫搖床中消化15min，消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清。加入約3倍肌糜體積的PBS反復(fù)吹打后經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，收集的濾液1000r/min離心5min，棄上清。生長培養(yǎng)基(含20％FBS的DMEM/F12)重懸細胞。

3、分離與純化：

采用差速貼壁分離技術(shù)對MDSCs進行分離。將細胞懸液接種于25mL培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、體積分數(shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后的貼壁細胞記為PP1，其中未貼壁細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，并記為PP2。24h后將PP2中未貼壁的細胞吸出后移入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，標記為PP3。以后每24h進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6，期間根據(jù)細胞的生長情況進行換液。PP6培養(yǎng)3天后換液，以后每2-3天換液，倒置顯微鏡下觀察記錄細胞生長以及形成集落后每日擴增情況，待細胞生長融合至70-80％后傳代培養(yǎng)。

4、MDSCs的傳代培養(yǎng)：

MDSCs原代培養(yǎng)8-10天，待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進行細胞記數(shù)，按8×10⁴cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。

5、MDSCs的鑒定:

1)細胞爬片制作：將無菌蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，對數(shù)生長期細胞制備成細胞懸液，按5×10⁴cell/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，生長培養(yǎng)基為含20％FBS的DMEM/F12，培養(yǎng)24-48小時，使細胞生長于蓋玻片上。

2)Desmin、Sca-1免疫細胞化學(xué)染色:將放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過夜。滴加3％過氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加一抗兔抗人結(jié)蛋白(Desmin)抗體(1:200稀釋)、兔抗人Sca-1抗體(1:100稀釋)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時，4℃過夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來水進行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在鏡下觀察，胞膜和/或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，說明成功分離獲得MDSCs(圖1為MDSCsP2代形態(tài)圖)。

實施例2 MDSCs的分化

富血小板血漿(PRP)的制備：采集志愿者外周血，于超凈臺內(nèi)把血樣轉(zhuǎn)入15mL離心管，10mL每管，2500rpm/min，離心10min。離心結(jié)束后血樣分為淡黃色上清層，中間白細胞層和紅色細胞底層。吸取全部上清、白色細胞層及紅色細胞層上部1-2mm，移入新15ml離心管，2500rpm/min，離心5min。離心結(jié)束后吸取上清層和白細胞層，移入新15mL離心管，1200g/min，離心5min。離心結(jié)束后棄上清，保留最下面的2.5mL，即富血小板血漿。移入含氯化鈣的促凝管，4℃過夜，待血凝塊充分收縮后，4000rpm/min，離心12min，吸取出促凝管內(nèi)的全部上清，上清液即為激活的PRP，0.22μm過濾，濾液-20℃保存待用。

各受試組培養(yǎng)液的配方如表1：

表1實施例2～4

取實施例1制備的第3代MDSCs，按1×10⁴cell/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細胞達到60％～70％融合以上時，各受試組分別更換表1所示成骨誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14～21d后，檢測各受試組細胞分化情況。

1、茜素紅染色

對各組細胞進行茜素紅染色，具體方法為：

棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定10-15min；吸棄多聚甲醛，PBS清洗3次；加入2％茜素紅，37℃孵育30min。孵育結(jié)束后吸棄殘液，用37℃預(yù)熱的去離子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。各組細胞染色效果如圖2。結(jié)果顯示，實驗組1～3的培養(yǎng)基誘導(dǎo)細胞成為骨細胞的數(shù)量更多。

2、礦化結(jié)節(jié)面積

使用圖像分析軟件Image-Pro-Plus 5.0(Media Cybernetics,美國)對各組3個復(fù)孔中的細胞進行礦化結(jié)節(jié)面積計算。礦化結(jié)節(jié)面積如表2所示。

表2礦化面積計算結(jié)果

注：**表示與各對照組相比，P<0.01。

由表2可知，對照組1不含誘導(dǎo)因子，不對細胞進行成骨分化誘導(dǎo)，因此，沒有著色，礦化面積為零。實驗組1與其他各組均有顯著性差異(p<0.01)；其他各對照組之間無顯著性差異。實驗組1中的礦化面積均值為90.45±0.78％，是對照組2礦化面積的2倍以上。其他實驗組的效果也均顯著優(yōu)于對照組(p<0.01)。

3、堿性磷酸酶活性(ALP)測定

對各組MDSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0d、7d、14d和21d對細胞進行堿性磷酸酶活性定量測定。具體測定方法為：

棄原培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加200μL 0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，鏡下可見細胞裂解完全，吸出裂解液至新離心管，離心后取上清，留作備用。

對上述裂解液進行蛋白含量測定，于96孔板中進行。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標準孔和空白孔，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔液體20μL，37℃孵育30min后檢測562nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)標準孔OD值繪制蛋白濃度標準曲線，代入各孔OD值，算出各組的蛋白濃度。

對上述裂解液進行堿性磷酸酶活性測定，于96孔板中進行。按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標準孔和空白孔，37℃孵育15min，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加150μL顯色液，輕輕震蕩孔板混勻。檢測520nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)以下公式計算堿性磷酸酶活性：

堿性磷酸酶活性(U/gprot)＝(測定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(標準孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度(gprot/mL)。

表3不同時間點各組細胞堿性磷酸酶活性

注：*表示與各對照組相比，P<0.05；

**表示與各對照組相比，P<0.01；

如表3所示，細胞培養(yǎng)7d、14d、21d后，在同一時間內(nèi)，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)堿性磷酸酶的活性均有顯著性差異(p﹤0.01，*)，實驗組1與對照組2-5均有顯著性差異(p﹤0.01，**)。堿性磷酸酶活性隨細胞培養(yǎng)時間增加而升高，但未誘導(dǎo)組(對照組1)上升不明顯，實驗組1顯著升高。

4、效果實施例3成骨基因OCN、Col-I、Runx2的檢測

各組MDSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d后，RT-PCR法檢測成骨細胞標志性基因OCN、Col-I、Runx2的表達。按TRIzol試劑盒說明書進行細胞總RNA提取，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。按SYBR Green定量PCR試劑盒說明書對成骨細胞標志性基因OCN、Col-I、Runx2表達水平進行檢測。β-actin作為內(nèi)參基因。2-^△△Ct法定量分析。

表4引物序列

實驗結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，細胞培養(yǎng)21d后，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)比較，成骨細胞標志性基因OCN、Col-I、Runx2表達水平均有顯著性差異(*，p<0.01)，實驗組1與其他各誘導(dǎo)組均有顯著性差異(**，p<0.05)。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。