本發(fā)明屬于豬標記輔助選擇技術領域，涉及與豬生產(chǎn)性狀相關的分子標記及其應用，具體涉及豬ROCK2基因編碼序列中的3處SNP標記，這3處標記均可應用到豬的標記輔助選擇中。

背景技術：

肉類是人類營養(yǎng)的主要來源，而豬肉在所有肉類消費中所占的比例是最大的。隨著社會的發(fā)展與人們生活水平的提高，人們對肉類的消費觀念已由原來對量的追求轉(zhuǎn)變?yōu)閷|(zhì)的追求。過去的幾十年里，傳統(tǒng)的育種方法在提高豬的生長速度、瘦肉率以及飼料轉(zhuǎn)化率等方面發(fā)揮了重要的作用，并取得了顯著的成績。但隨著對高生長率與高瘦肉率的強度選擇導致了豬肉品質(zhì)的嚴重下降，劣質(zhì)豬肉大量涌現(xiàn)。因此，改良豬肉品質(zhì)，培育出安全環(huán)保優(yōu)質(zhì)的新品種豬成為目前豬遺傳育種中的重要研究課題。

近年來，隨著現(xiàn)代分子和基因組學突飛猛進的發(fā)展，分子標記輔助選擇越來越受到人們的關注。通過尋找對動物特定性狀有較大影響的數(shù)量性狀位點附近的分子標記，利用這些分子標記可以實現(xiàn)對特定性狀的選擇。相對傳統(tǒng)的育種方法，分子標記輔助選擇具有許多明顯的優(yōu)勢，它不受年齡、性別等的限制，可以進行早期選種，縮短世代間隔，加快遺傳改良的進度，降低選育的成本；對遺傳力低、晚期表現(xiàn)、以及活體難于度量的性狀(肉質(zhì)性狀)更具有顯著的優(yōu)勢。到目前為止，已成功鑒定了多個可用于豬育種的分子標記。其中氟烷基因(也稱蘭尼定I型受體基因)、酸肉基因、胰島素生長因子2、黑皮質(zhì)素受體4以及肌肉生長抑制素已被證實對肌肉的發(fā)育以及豬肉的品質(zhì)有顯著影響，已經(jīng)成功的應用到了豬育種當中。此外，豬的雌激素受體基因、牛的雙肌基因與雞的矮小基因也在育種和生產(chǎn)中得以應用。

肌肉的發(fā)育以及豬的肉質(zhì)性狀與胴體性狀具有復雜的特性，許多性狀只具有中等遺傳力，而且這些性狀由多基因控制。迄今為止，雖然找到了少數(shù)幾個影響豬生產(chǎn)性能的主效基因，但還遠遠不能滿足育種工作的需求。因此，找到更多的主效基因或與主效基因緊密連鎖的分子標記，并合理的運用到豬肉品質(zhì)改良中，勢必成為育種工作者們迫在眉睫的要事。在所有分子標記中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)有望成為最重要最有效的分子標記?，F(xiàn)階段能夠有效用于豬生產(chǎn)性狀相關的分子標記仍有待挖掘。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺點與不足，提供與豬生產(chǎn)性狀相關的分子標記，該分子標記在豬ROCK2基因的編碼序列中。本發(fā)明的另一目的在于提供檢測所述分子標記的擴增引物以及檢測所述分子標記的測序引物。本發(fā)明的目的還在于提供所述分子標記在豬標記輔助選擇中的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

與豬生產(chǎn)性狀相關的分子標記，其序列如SEQ ID NO.1所示，長度為145bp，在豬ROCK2基因的編碼序列中。所述的分子標記為3處SNP：A27G、C42T和T61C，即SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第27位堿基存在突變，第27位堿基是A或G；或SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第42位堿基存在突變，第42位堿基是C或T；或SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第61位堿基存在突變，第61位堿基是T或C。

檢測上述分子標記的擴增引物對的序列如下所示：

上游引物：ACAGGCATGGTGCATTGTG(SEQ ID NO.2)，

下游引物：CCACCAGCATCTCAAAAAGGA(SEQ ID NO.3)。

檢測上述分子標記的測序方法優(yōu)選為焦磷酸測序法。

檢測上述分子標記的測序引物的序列如下所示：

測序引物：GGTGCATTGTGATACG(SEQ ID NO.4)。

通過上述分子標記與豬生產(chǎn)性狀的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)上述3個SNP與豬胴體性狀、肉質(zhì)性狀呈顯著相關。因此，上述分子標記可用于豬標記輔助選擇中。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了3個與豬生產(chǎn)性狀相關的分子標記，為豬的分子育種提供了新的分子標記。

(2)本發(fā)明所采用的焦磷酸測序法可以同時檢測3個突變位點，與PCR-RFLP方法相比更加迅速。

(3)本發(fā)明的結(jié)果判定由焦磷酸測序儀自動完成，判定方便，節(jié)約人工成本。

附圖說明

圖1是所擴增得到的豬ROCK2基因的部分編碼序列，片段大小為145bp，圖中下劃線標記的分別為上、下游引物序列，圖中陰影所標記的為焦磷酸測序引物序列，括號內(nèi)所顯示的是堿基突變。

圖2是PCR擴增的ROCK2基因片段的核酸電泳鑒定圖，1、2和3泳道為目的片段，M為DL2000。

圖3是分子標記A27G、C42T和T61C的焦磷酸測序儀測序峰圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1(制備實施例)

1、豬ROCK2基因部分DNA序列克隆及SNP尋找

(1)引物設計

用人ROCK2基因的mRNA序列為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90％以上的豬ESTs序列，以其中存在多處突變的一段序列為模板設計一對引物，以豬的基因組DNA為模板擴增圖1所示序列(SEQ ID NO.1)，序列大小為145bp。

所設計引物的序列如下：

上游引物：ACAGGCATGGTGCATTGTG，

下游引物：CCACCAGCATCTCAAAAAGGA。

(2)目的片段的克隆和測序

分別以10頭大白豬和10頭梅山豬的基因組DNA樣品作為模板，按照以下體系(25μL)進行PCR反應：2×GC bufferⅠ12.5μL，dNTPs(2mM)2.5μL，Taq(1U/μL)1μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，DNA模板1μL，ddH₂O 7μL。PCR反應程序為：94℃預變性4min；94℃變性50s，55℃退火50s，72℃延伸10s，重復35次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(圖2)，并在紫外燈照射下割取含有目的片段的膠塊，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(DP1701，購自北京百泰克生物技術有限公司)純化PCR產(chǎn)物，將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自TAKARA公司)4℃冰箱過夜連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性的菌液送去測序，利用DNAStar中的Seqman對測序結(jié)果進行多序列比對，確定SNP。通過測序和比對，確認了所擴增PCR產(chǎn)物長度為145bp，該序列第27位、42位和61位存在突變，第27bp處有1個A27-G27突變，第42bp處有1個C42-T42突變，第61bp處有1個T61-C61突變。

2、焦磷酸測序檢測方法的建立

用上游引物與帶有生物素標記的下游引物擴增基因組DNA得到145bp特異擴增片段，采用焦磷酸測序的方法對此序列上的3個位點進行檢測，測序引物序列為：GGTGCATTGTGATACG。焦磷酸測序(Pyrosequencing)的方法與傳統(tǒng)方法相比，更加精準，另外一個突出的優(yōu)點就是它能同時對多個位點進行分析，本發(fā)明中的前兩個突變位點間隔14個堿基，而后兩個突變位點間隔18個堿基，本發(fā)明設計的一對擴增引物所擴增的145bp特異擴增片段同時包含了這3個突變位點。與此同時，本發(fā)明另外設計了一條可以同時檢測這3個突變位點的測序引物對所擴增的序列進行測序。焦磷酸測序儀(PSQ 96MA)根據(jù)峰值自動判別3個突變的基因型，測序結(jié)果如圖3所示。

實施例2(應用實施例1)：多態(tài)性在各豬品種中的分布情況

利用焦磷酸測序的方法同時檢測了序列中A27G、C42T和T61C 3個突變位點在4個豬種中的多態(tài)性。3個SNP位點在各豬種的基因型與基因頻率分布如表1所示。在所檢測的31頭大白豬、50頭長白豬、32頭梅山豬和30頭清平豬中，對于A27G突變位點，A等位基因的頻率分別為0.82、1、0.64和0.85，A等位基因占優(yōu)勢；對于C42T突變位點，C等位基因的頻率分別為0.82、1、0.64和0.85，C等位基因占優(yōu)勢；對于T61C突變位點，T等位基因的頻率分別為0.95、0.80、0.78和0.63，T等位基因占優(yōu)勢。這3個突變位點的優(yōu)勢等位基因在國外豬種和國內(nèi)地方豬種間沒有差異。

表1 豬ROCK2基因3個突變位點在不同品種豬中基因型和等位基因頻率的分布

注：大白豬、長白豬為國外豬種；梅山豬、清平豬為中國地方豬種。

實施例3(應用實施例2)：豬標記―性狀關聯(lián)分析

用焦磷酸測序的方法對前面3個SNP即A27G、C42T和T61C在大白豬、長白豬、梅山豬和清平豬以及2003年、2004年的大白豬×梅山豬F₂代群體中的基因頻率、基因型頻率進行了檢測，并將這3處SNP與胴體性狀和肉質(zhì)性狀進行了關聯(lián)分析。用于關聯(lián)分析的主要胴體性狀包括皮率、骨率、肥肉率、瘦肉率、瘦肥肉比例、胴體重、屠宰率、板油重、花油重、內(nèi)脂率、至第一頸椎胴體長、至第一肋胸胴體長、6-7腰椎間背膘厚、肩部背膘厚、胸腰椎間背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、腿臀比率、眼肌高、眼肌寬、眼肌面積。用于關聯(lián)分析的主要肉質(zhì)性狀包括背最長肌pH、股二頭肌pH、頭半棘肌pH、失水率、系水力、背最長肌色值、股二頭肌色值、背最長肌大理石紋評分、股二頭肌大理石紋評分、肌內(nèi)脂肪、肌內(nèi)水分。

采用SAS統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc,Version 8.0)glm程序進行單標記方差分析，同時采用reg程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗，所采用單標記回歸統(tǒng)計模型為：

Y_ijkl＝μ+G_i+F_j+S_k+Y_l+b_ijklX_ijkl+e_ijkl

Y_ijkl為性狀表型值；μ為平均值；G_i為基因型效應(包括基因加性效應和顯性效應；加性效應用-1、0和1分別代表AA、AB和BB基因型，顯性效應用1、-1和1分別代表AA、AB和BB基因型)；F_j、S_k、Y_l分別為家系、性別和年度效應；b_ijkl為屠宰體重的回歸系數(shù)，X_ijkl為屠宰體重；e_ijkl為殘差效應。

A27G基因型檢測結(jié)果表明：在所檢測的大白×梅山兩個F₂代家系中，AA基因型87頭，AG基因型157頭，GG基因型23頭。不同基因型與生產(chǎn)性狀的統(tǒng)計結(jié)果總結(jié)于表2。

C42T基因型檢測結(jié)果表明：在所檢測的大白×梅山兩個F₂代家系中，CC基因型86頭，CT基因型159頭，TT基因型22頭。不同基因型與生產(chǎn)性狀的統(tǒng)計結(jié)果總結(jié)于表3。

T61C基因型檢測結(jié)果表明：在所檢測的大白×梅山兩個F₂代家系中，CC基因型2頭，TC基因型18頭，TT基因型247頭。不同基因型與生產(chǎn)性狀的統(tǒng)計結(jié)果總結(jié)于表4。

A27G突變位點與胴體性狀中皮率和胸腰椎間背膘厚呈顯著相關，其中GG型個體的皮率顯著高于AA型個體(p<0.05)，而GG型個體的胸腰椎間背膘厚顯著低于AA型個體(p<0.05)；與至第一頸椎背膘厚和至第一肋胸背膘厚呈極顯著相關，其中GG型個體的至第一肋胸背膘厚顯著高于AA型個體(p<0.05)，GG型個體的至第一頸椎背膘厚極顯著高于AA型個體(p<0.01)。

C42T突變位點與胴體性狀中的至第一頸椎背膘厚呈顯著相關，與至第一肋胸背膘厚呈極顯著相關，TT型個體的至第一頸椎背膘厚顯著高于CC型個體(p<0.05)。

對于T61C突變位點，由于CC型個體只有兩個，不符合統(tǒng)計學的要求，我們將其剔除后進行性狀關聯(lián)分析。該位點與胴體性狀中的皮率呈顯著相關，TT型個體的皮率顯著高于TC型個體；該位點與肉質(zhì)性狀中的背最長肌和股二頭肌大理石紋評分呈顯著相關，與股二頭肌pH值呈極顯著相關，TC型個體的背最長肌和股二頭肌大理石紋評分顯著高于TT型個體，而TC型個體的股二頭肌pH值則極顯著高于TT型個體。

表2 豬ROCK2基因A27G突變位點與豬生產(chǎn)性狀的關聯(lián)分析

注：以上數(shù)值為最小二乘均值±標準誤；同行含有相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)?！?”表示P<0.05，“**”表示P<0.01(下表同)。

表3 豬ROCK2基因C42T突變位點與豬生產(chǎn)性狀的關聯(lián)分析

表4 豬ROCK2基因T61C突變位點與胴體性狀的關聯(lián)分析

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢生物工程學院

<120> 與豬生產(chǎn)性狀相關的分子標記及其應用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 145

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

acaggcatgg tgcattgtga tacggcagtt ggaacacctg actatatatc acctgaggtt 60

ttgaaatcac aagggggtga tggttactat gggcgagaat gagattggtg gtctgtgggt 120

gttttccttt ttgagatgct ggtgg 145

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物

<400> 2

acaggcatgg tgcattgtg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 3

ccaccagcat ctcaaaaagg a 21

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 測序引物

<400> 4

ggtgcattgt gatacg 16