本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
：心肌梗死是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損壞，是臨床上一種嚴(yán)重的缺血性心臟病。壞死后的心肌細(xì)胞逐漸被癱痕組織所取代，由于癱痕組織缺乏彈性，難以滿足心臟收舒功能的要求，為代償損失心肌細(xì)胞的功能，心臟逐漸發(fā)生退行性左心室重塑，心功能下降，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭，甚至猝死。臨床藥物和介入治療雖可以改善癥狀，但卻不能挽回受損的心肌細(xì)胞。心臟移植雖可以從根本上解決心室重構(gòu)問題，但因為其供體受限，醫(yī)療費用太高而難以廣泛應(yīng)用。近年來的研究表明，心肌細(xì)胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌細(xì)胞也可以發(fā)生分裂和增值，但是，由于其增值能力較弱，不能滿足彌補喪失心肌細(xì)胞數(shù)量的要求而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)過程。近年來隨著干細(xì)胞技術(shù)和組織工程學(xué)研究的不斷深入，干細(xì)胞移植治療心肌梗死成為臨床研究的熱點。干細(xì)胞的多向分化潛能及可塑性使心肌梗死心肌細(xì)胞再生成為可能，在人體的微環(huán)境作用下，干細(xì)胞定向歸巢至損傷處，可以多項分化成各種組織細(xì)胞及血管。目前用于心肌梗死治療研究的干細(xì)胞主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等。目前研究表明，在體外常用5-氮雜胞普，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2等作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，取得了良好分化效率。牙周膜是牙根與牙槽骨之間的一層結(jié)締組織,是重要的牙周支持組織,主要由成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和一些未分化的間充質(zhì)細(xì)胞組成。正常情況下,牙周組織具有自身的更新和修復(fù)能力,其修復(fù)活動是通過牙周膜細(xì)胞自我更新實現(xiàn)的。在疾病或在受到外界刺激時,通過牙周膜中細(xì)胞的不斷增殖和分化使組織再生。2004年Seo等從拔除的第三磨牙牙周膜組織中分離得到牙周膜干細(xì)胞(PeriodontalLigamentSemCells,PDLSCs)。此外，在拔牙后牙槽窩的內(nèi)表面也有PDLSCs存在。近來，有人從成人牙周組織中得到了高度純化的PDLSCs克隆。研究表明，PDLSCs表達間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物STRO-1和CD146/MUC18,這意味著PDLSCs很有可能是來源于血管周圍的細(xì)胞群。而這一點恰恰與同樣表達STRO-1和CD146/MUC18的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMMSCs)非常相似。PDLSCs也具有與BMSCs相似的多向分化能力，可體外分化為多種細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。但是，由于生物體是一個復(fù)雜的存在多誘導(dǎo)因素的有機體，因此在心肌組織再生的復(fù)雜微環(huán)境中，多種誘導(dǎo)因子在心肌組織再生的過程中可能會起到相互協(xié)同或拮抗的作用。目前尚未見對于PDLSCs向心肌樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)的研究報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液能夠促進牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，其分化周期短，分化效率高。本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、FBS、5-aza和Ang-II。胎牛血清(fetalcalfserum，F(xiàn)BS)是血清中的一種，能夠提供維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)是一種可改變基因的去甲基化藥物，作為一種誘導(dǎo)劑常用于體外實驗研究。5-aza是胞苷類似物，為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，當(dāng)其作用于MSC時能整合進入DNA中，通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶使低DNA甲基化,而DNA的甲基化程度和基因調(diào)節(jié)密切相關(guān)。5-aza誘導(dǎo)MSC心肌化，可能是它和控制向心肌分化的特異啟動子基因上阻遏蛋白結(jié)合，使其去甲基化而發(fā)生構(gòu)型改變,從而啟動細(xì)胞向心肌分化,使轉(zhuǎn)變成心肌細(xì)胞。血管緊張素II(AngiontensinII，Ang-II)是人體內(nèi)正常存在的一種多肽類激素類物質(zhì)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展以及血管重塑中起到一定的作用。有研究顯示人類脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)Ang-II誘導(dǎo)之后表達平滑肌特異性基因增加，其向平滑肌樣細(xì)胞分化，而且還可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子合成增加，也可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向中胚層前體細(xì)胞分化和增殖。本發(fā)明利用FBS、5-aza和Ang-II誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞。其中，Ang-II單獨可以促使間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，同時使用5-aza可以進一步提高增殖和分化的效率。誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞不僅具有了心肌細(xì)胞的典型形態(tài)，并表達心肌細(xì)胞的標(biāo)志物：肌間線蛋白(desmin)、心肌肌鈣蛋白I(troponinI)和心肌肌鈣蛋白T(troponinT)，表明牙周膜干細(xì)胞保留了跨胚層分化為非間充質(zhì)細(xì)胞的能力，可跨胚層分化為心肌樣細(xì)胞。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基提高了牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的分化率并縮短分化的時間。實驗表明，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)基誘導(dǎo)后1～2周，細(xì)胞多緊密平行排列生長，細(xì)胞體積變大，紡錘形細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞呈桿狀，少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長梭形或橢圓形；3～4周，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯降低，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)，且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周圍，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。對各組細(xì)胞的分化率進行計算，結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞的分化率顯著高于對照組，(p<0.05，或p<0.01)。在本發(fā)明的實施例中，F(xiàn)BS的體積分?jǐn)?shù)為10％。在本發(fā)明的實施例中，5-aza的濃度為5μmol/L～15μmol/L；TAng-II的濃度為1μmol/mL～10μmol/mL。在一些實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為10％的FBS、濃度為5μmol/L的5-aza、濃度為1μg/mL的Ang-II。在一些實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為10％的FBS、濃度為10μmol/L的5-aza、濃度為5μg/mL的Ang-II。在一些實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為10％的FBS、濃度為5μmol/L的5-aza、濃度為10μg/mL的Ang-II。在一些實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為10％的FBS、濃度為15μmol/L的5-aza、濃度為10μg/mL的Ang-II。在一些具體實施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12。本發(fā)明所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液可為自制也可為購買獲得，本發(fā)明對此不做限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明采用的人干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為DMEM/F12無血清培養(yǎng)液。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中不含有抗生素，而是通過更加適宜的培養(yǎng)條件，促進牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的分化，增強目標(biāo)細(xì)胞的生長勢，降低感染風(fēng)險。本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液在誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的方法，牙周膜干細(xì)胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至70％～80％融合后以本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)。在本發(fā)明的實施例中，誘導(dǎo)的時間為28d。在本發(fā)明的實施例中，牙周膜干細(xì)胞為3～5代的牙周膜干細(xì)胞。一些實施例中，牙周膜干細(xì)胞為第3代的牙周膜干細(xì)胞。所述誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的容器為無菌六孔板，優(yōu)選的，所述六孔板經(jīng)多聚賴氨酸處理。所述誘導(dǎo)過程，接種24h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2～3天更換新的培養(yǎng)液。所述誘導(dǎo)的條件為37℃、5％CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)。本發(fā)明中，牙周膜干細(xì)胞的分離采用磁珠分選法，具體方法包括：步驟1：牙周膜組織以膠原酶和Dispase酶消化后，以含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)至匯合80％～90％；步驟2：收集細(xì)胞與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠4℃孵育30min，后，篩選出STRO-1+的PDLSCs，傳代。所述膠原酶和Dispase酶的質(zhì)量比為3:4。具體的，膠原酶濃度為3g/L，Dispase酶濃度為4g/L，以體積比1:1混合。消化條件為37℃恒溫?fù)u床中消化30min～35min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，然后再以PBS清洗一次。步驟1中所述培養(yǎng)的條件為5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。所述傳代具體為：待細(xì)胞長滿80％～90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶，消化1分鐘～3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，立即加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進行細(xì)胞記數(shù)，按5×104cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2～3天換液一次。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液中包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、FBS、5-aza和Ang-II。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液能夠誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞，且能夠提高牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的分化率并縮短分化的時間。實驗表明，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)基誘導(dǎo)后1～2周，細(xì)胞多緊密平行排列生長，細(xì)胞體積變大，紡錘形細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞呈桿狀，少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長梭形或橢圓形；3～4周，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯降低，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)，且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周圍，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。對各組細(xì)胞的分化率進行計算，結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞的分化率顯著高于對照組，(p<0.05，或p<0.01)。附圖說明圖1示PDLSCsP2代形態(tài)；其中，圖1-a的放大倍數(shù)為40×；圖1-b的放大倍數(shù)為100×；圖1-c的放大倍數(shù)為200×；圖2示PDLSCsP2代流式細(xì)胞檢測結(jié)果，其中，圖2-a～圖2-c示陽性marker(CD145、CD105、CD73)的表達情況；圖2-d～圖2-f示陰性marker(HLA-DR、CD45、CD34)的表達情況。具體實施方式本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)液及其應(yīng)用和誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1PDLSCs原代分離培養(yǎng)、傳代及鑒定取材：取牙根中下1/3段的牙周膜組織，移入離心管，并用眼科剪將組織塊剪成約為1mm3大小。消化：加入適量膠原酶-Dispase酶1:1混合消化液(膠原酶3g/L，Dispase酶4g/L)，置37℃恒溫?fù)u床中消化30-35min。消化結(jié)束后，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量PBS重懸，1000r/min離心5min，棄上清。接種：加入培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液)重懸細(xì)胞，接種于六孔板，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。純化：待細(xì)胞長滿80％～90％，收集細(xì)胞，用磁珠分選法純化細(xì)胞。將收集的細(xì)胞與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠30min4℃孵育，在磁力設(shè)備作用下篩選出STRO-1+PDLSCs，接種于新的六孔板中，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。傳代：待細(xì)胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入適量0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，立即加入適量含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄上清。加入適量含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，進行細(xì)胞記數(shù)，按5×104cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。細(xì)胞接種約4h后開始貼壁，2-3d進入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖速度較快，4-6d進入平臺期。細(xì)胞生長速度平穩(wěn)，呈單層貼壁生長。大部分細(xì)胞呈類梭形，形態(tài)不規(guī)則。鑒定：取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測表面抗原CD146、CD105、CD73、CD34、CD45、HLA-DR表達情況，Cell-Quest軟件分析結(jié)果。每個樣本分析6000～8000個細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞表面抗原CD146、CD105、CD73表達陽性，而CD45、CD34、HLA-DR表達陰性，說明本發(fā)明中得到的PDLSCs屬來源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞(表1，圖2)。表1PDLSCs表面抗原陽性表達率細(xì)胞表型CD146CD105CD73HLA-DRCD34CD45陽性表達率(％)99.899.899.80.20.20.3實施例2PDLSCs的分化各受試組培養(yǎng)液的配方如表2：表2各組分化誘導(dǎo)液配方組別基礎(chǔ)培養(yǎng)基FBS5-azaAng-II實驗組1DMEM/F1210％5umol/L1umol/L實驗組2DMEM/F1210％10umol/L5umol/L實驗組3DMEM/F1210％5umol/L10umol/L實驗組4DMEM/F1210％15umol/L10umol/L對照組1DMEM/F1210％————對照組2DMEM/F1210％10umol/L——對照組3DMEM/F1210％——5umol/L選取實施例1制備的第3代PDLSCs，按1×104cell/mL密度接種于放有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。24h后更換各組對應(yīng)的培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)，每隔2～3天更換新的培養(yǎng)液。觀察培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)：對照組1為陰性對照組，細(xì)胞形態(tài)無變化，實驗組4細(xì)胞狀態(tài)較差，細(xì)胞增殖緩慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，3～4周偶見部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長梭形或橢圓形；對照組2、對照組3、實驗組1、實驗組2和實驗組3細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，誘導(dǎo)后1～2周，細(xì)胞多緊密平行排列生長，細(xì)胞體積變大，紡錘形細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞呈桿狀，少部分細(xì)胞呈不規(guī)則外形、長梭形或橢圓形；3～4周，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，細(xì)胞數(shù)量較對照組1明顯減少，相鄰細(xì)胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯降低，胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的顆粒樣結(jié)構(gòu)，且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細(xì)胞核周圍，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)4周后取出細(xì)胞爬片,按照免疫組化染色試劑盒的說明書進行肌間線蛋白(desmin)、心肌肌鈣蛋白I(troponinI)和心肌肌鈣蛋白T(troponinT)的免疫組化染色,DAB顯色。將各組放有蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸出，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞鋪片5分鐘，重復(fù)3次。用4％多聚甲醛固定15分鐘，PBS緩沖液漂洗后甩干，中性樹膠粘附于載玻片上，4℃冰箱過夜。滴加3％過氧化氫孵育15分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次。分別滴加適量一抗(desmin、troponinI、troponinT)，37℃濕盒內(nèi)孵育1小時，4℃過夜。次日取出后PBS緩沖液漂洗5分鐘，滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育40分鐘，PBS緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)3次，滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5-10分鐘，在光鏡下觀察，用自來水進行沖洗終止顯色。將甩干片子后，蘇木素復(fù)染1分鐘，分化返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。對各組所得細(xì)胞經(jīng)免疫組化檢測后，對desmin、troponinI、troponinT染色的細(xì)胞按公式：誘導(dǎo)分化率＝染色陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％進行計數(shù)，計算出各組的分化率進行比較。每組取樣3次，分別檢測后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果如表3。表3各組細(xì)胞分化率其中，*示與對照組1相比存在顯著性差異，p<0.05**示與對照組1～3相比皆存在極顯著差異，p<0.01表3結(jié)果顯示，對照組1為陰性對照組，細(xì)胞無著色；其余各組中，三種蛋白均有細(xì)胞著色，表明desmin、troponinI、troponinT均表達陽性。其中對照組2、對照組3之間分化率無顯著性差異，說明5-aza與Ang-II分別單獨誘導(dǎo)PDLSCs向心肌樣細(xì)胞分化效果作用無差異。而實驗組1、實驗組4的誘導(dǎo)效果與對照組1～3相似，未體現(xiàn)兩者聯(lián)合誘導(dǎo)分化的效果；實驗組2～3的分化率則顯著高于其他各組(p<0.01)，其中實驗組2的效果與實驗組3的分化率相比，也存在顯著性差異(p<0.01)。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3