本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米漿干粉、玉米漿等是常用的發(fā)酵工業(yè)用碳源。牛骨蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆餅粉等是常用的發(fā)酵工業(yè)用氮源。碳源、氮源、無機鹽和微量元素、生長因子是組成基礎(chǔ)發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基的成分。通過在基礎(chǔ)發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基中補充碳源、氮源，進行補料分批高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化，可以顯著提高生物發(fā)酵效價，降低發(fā)酵原料成本，縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期，具有工藝簡單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點。

市場上的同類抗菌肽產(chǎn)品，主要以生物效價作為其產(chǎn)品的質(zhì)量評價指標，其發(fā)酵液的生物效價一般在6，000U/ml以下；噴霧干燥成品的含水量在5%以下，生物效價一般在40，000U/g。目前枯草芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌肽的工藝仍然存在成本過高，過程復雜，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)物效價低等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，采用枯草芽孢桿菌BW115及優(yōu)化的補料分批高密度發(fā)酵生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的抗菌肽，其發(fā)酵液的效價達10，000U/ml以上，噴霧干燥成品的含水量5%以下、生物效價達80，000U/g以上；具有生物效價高，原料成本低、發(fā)酵周期短的優(yōu)勢。該抗菌肽作為飼料添加劑，添加在全價配合飼料中，能顯著提高養(yǎng)殖動物生產(chǎn)性能。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌BW115 (Bacillus subtilis BW115)，已于2016年7月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2016402。

本發(fā)明第一個方面提供一種生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1 獲得生產(chǎn)菌株

將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的生產(chǎn)菌株即枯草芽孢桿菌BW115，將其保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟2 液體種子發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3 發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，經(jīng)流加補充碳源和氮源中的任意一種或者其組合，進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；

步驟4 獲得抗菌肽產(chǎn)品

將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)60-600℃，進行噴霧干燥處理后，得到抗菌肽產(chǎn)品。

其中，枯草芽孢桿菌BW115，是利用基因重組技術(shù)，將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到質(zhì)粒pPIC9K中得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，經(jīng)篩選得到穩(wěn)定表達的菌株，表達家蠶抗菌肽。家蠶抗菌肽屬于殺菌力最強的天蠶素-B類抗菌肽，由37個氨基酸殘基組成，含25%的α-螺旋氨基酸，伸展結(jié)構(gòu)的氨基酸占32%，含43%的無規(guī)則卷曲氨基酸。

優(yōu)選地，上述步驟1中質(zhì)粒是pPIC9K質(zhì)粒。

優(yōu)選地，上述步驟3中補充的碳源選自乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米漿干粉、玉米漿中的一種或幾種。

優(yōu)選地，上述步驟3中補充的氮源選自牛骨蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆餅粉中的一種或幾種。

優(yōu)選地，上述步驟3中發(fā)酵培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度是20-40℃；攪拌轉(zhuǎn)速是100-500r/min；通氣比是1:（0.5-2.0）；罐壓是0.01-0.10Mpa。

優(yōu)選地，上述步驟3中所獲得的發(fā)酵液，其生物效價達到10，000U/ml以上。

優(yōu)選地，以質(zhì)量百分比計，上述步驟3中的補充碳源的用量為0.1-10%。

優(yōu)選地，以質(zhì)量百分比計，上述步驟3中的補充氮源的用量為0.1-10%。

優(yōu)選地，上述步驟4中所獲得的抗菌肽產(chǎn)品含水量小于5%，并且其生物效價達到80，000U/g以上。

本發(fā)明第二個方面提供上述工藝生產(chǎn)得到的抗菌肽。

本發(fā)明第三個方面提供上述工藝所制備的抗菌肽在飼料領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

1）本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌BW115，進行補料分批高密度優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝，發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)酵液的生物效價達到10，000U/ml以上，遠高于已知技術(shù)中的發(fā)酵液生物效價。

2）與傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的抗菌肽相比，本發(fā)明生產(chǎn)的抗菌肽，具有更廣譜的抗菌活性、pH適用范圍更廣、耐熱性能更好，噴霧干燥成品的含水量5%以下，并且生物效價達到80，000U/g以上。

3）采用本發(fā)明中的工藝生產(chǎn)的抗菌肽，原料成本低，發(fā)酵周期短，作為飼料添加劑，可與抗菌素聯(lián)用或替代抗菌素使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。

實施例1

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽工藝中發(fā)酵罐中補充的碳源、氮源和培養(yǎng)條件為：

（1）碳源：葡萄糖5%；

（2）氮源：酵母浸粉4%；

（3）發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃；攪拌轉(zhuǎn)速300r/min；通氣比1:1.5；罐壓0.03-0.08Mpa。

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1：將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的菌株得到生產(chǎn)菌株，即枯草芽孢桿菌BW115，將其放置于液氮罐中，保藏備用；

步驟2：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下，滅菌30分鐘后冷卻至30℃，然后將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3：將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)8小時，流加補充碳源、氮源，繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

步驟4：將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)進風溫度180℃，出風溫度90℃條件下，進行噴霧干燥處理，得到抗菌肽產(chǎn)品。

本實施例獲得的抗菌肽，是在5噸發(fā)酵罐規(guī)模下發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)過檢測，其發(fā)酵液效價為10，450U/ml，噴霧干燥產(chǎn)品效價為86，230U/g，含水量為3.2%。

實施例2

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽工藝中發(fā)酵罐中補充的碳源和培養(yǎng)條件為：

（1）碳源：葡萄糖3%、蔗糖3%；

（2）發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵培養(yǎng)溫度32℃；攪拌轉(zhuǎn)速200r/min；通氣比1:1.2；罐壓0.03-0.05Mpa。

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1：將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的菌株得到生產(chǎn)菌株，即枯草芽孢桿菌BW115，將其放置于液氮罐中，保藏備用；

步驟2：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下，滅菌30分鐘后冷卻至32℃，然后將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3：將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)4小時，流加補充碳源，繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

步驟4：將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)進風溫度160℃，出風溫度80℃條件下，進行噴霧干燥處理，得到抗菌肽產(chǎn)品。

本實施例獲得的抗菌肽，是在10噸發(fā)酵罐規(guī)模下發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)過檢測，其發(fā)酵液效價為11，330U/ml，噴霧干燥產(chǎn)品效價為90，120U/g，含水量為3.9%。

實施例3

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽工藝中發(fā)酵罐中補充的碳源和培養(yǎng)條件為：

（1）碳源：乳糖5%、蔗糖0.5%；

（2）發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵培養(yǎng)溫度37℃；攪拌轉(zhuǎn)速280r/min；通氣比1:1.1；罐壓0.03-0.08Mpa。

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1：將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的菌株得到生產(chǎn)菌株，即枯草芽孢桿菌BW115，將其放置于液氮罐中，保藏備用；

步驟2：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下，滅菌30分鐘后冷卻至37℃，然后將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3：將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)5小時，流加補充碳源，繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

步驟4：將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)進風溫度165℃，出風溫度70℃條件下，進行噴霧干燥處理，得到抗菌肽產(chǎn)品。

本實施例獲得的抗菌肽，是在60噸發(fā)酵罐規(guī)模下發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)過檢測，其發(fā)酵液效價為10，210U/ml，噴霧干燥產(chǎn)品效價為88，100U/g，含水量為2.6%。

實施例4

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽工藝中發(fā)酵罐中補充的碳源、氮源和培養(yǎng)條件為：

（1）碳源：麥芽糖9%；

（2）氮源：酵母膏4%、蛋白胨0.5%；

（3）發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵培養(yǎng)溫度35℃；攪拌轉(zhuǎn)速310r/min；通氣比1:1.3；罐壓0.05-0.08Mpa。

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1：將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的菌株得到生產(chǎn)菌株，即枯草芽孢桿菌BW115，將其放置于液氮罐中，保藏備用；

步驟2：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下，滅菌30分鐘后冷卻至35℃，然后將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3：將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)6小時，流加補充碳源、氮源，繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

步驟4：將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)進風溫度190℃，出風溫度85℃條件下，進行噴霧干燥處理，得到抗菌肽產(chǎn)品。

本實施例獲得的抗菌肽，是在25噸發(fā)酵罐規(guī)模下發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)過檢測，其發(fā)酵液效價為12，400U/ml，噴霧干燥產(chǎn)品效價為82，430U/g，含水量為3.6%。

實施例5

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽工藝中發(fā)酵罐中補充的碳源、氮源和培養(yǎng)條件為：

（1）碳源：乳糖3%、葡萄糖3%；

（2）氮源：酪蛋白胨3%；

（3）發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵培養(yǎng)溫度36℃；攪拌轉(zhuǎn)速250r/min；通氣比1:1.0；罐壓0.02-0.04Mpa。

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1：將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的菌株得到生產(chǎn)菌株，即枯草芽孢桿菌BW115，將其放置于液氮罐中，保藏備用；

步驟2：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下，滅菌30分鐘后冷卻至36℃，然后將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3：將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)9小時，流加補充碳源、氮源，繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

步驟4：將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)進風溫度160℃，出風溫度75℃條件下，進行噴霧干燥處理，得到抗菌肽產(chǎn)品。

本實施例獲得的抗菌肽，是在50噸發(fā)酵罐規(guī)模下發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)過檢測，其發(fā)酵液效價為11，230U/ml，噴霧干燥產(chǎn)品效價為87，130U/g，含水量為2.6%。

實施例6

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽工藝中發(fā)酵罐中補充的碳源、氮源和培養(yǎng)條件為：

（1）碳源：玉米漿干粉6%；

（2）氮源：大豆粕粉3%；

（3）發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃；攪拌轉(zhuǎn)速250r/min；通氣比1:1.2；罐壓0.02-0.05Mpa。

本實施例中生產(chǎn)飼用抗菌肽的工藝，包括如下步驟：

步驟1：將家蠶抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒，然后將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，再篩選出穩(wěn)定表達抗菌肽CAD的菌株得到生產(chǎn)菌株，即枯草芽孢桿菌BW115，將其放置于液氮罐中，保藏備用；

步驟2：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基在121℃條件下，滅菌30分鐘后冷卻至30℃，然后將步驟1中得到的生產(chǎn)菌株活化后接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行液體種子發(fā)酵培養(yǎng)獲得種子發(fā)酵液；

步驟3：將步驟2中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)2小時，流加補充碳源、氮源，繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液；

步驟4：將步驟3中所獲得的發(fā)酵液，添加輔料，經(jīng)進風溫度180℃，出風溫度80℃條件下，進行噴霧干燥處理，得到抗菌肽產(chǎn)品。

本實施例獲得的抗菌肽，是在40噸發(fā)酵罐規(guī)模下發(fā)酵生產(chǎn)，經(jīng)過檢測，其發(fā)酵液效價為10，830U/ml，噴霧干燥產(chǎn)品效價為91，130U/g，含水量為4.6%。

通過上述的各個實施例可以看出，使用本發(fā)明重組基因工程枯草芽孢桿菌BW115及優(yōu)化補料分批高密度發(fā)酵工藝生產(chǎn)的抗菌肽，其發(fā)酵液的效價均在10，000U/ml以上；噴霧干燥成品的含水量均在5%以下，其生物效價均達80，000U/g以上。

同時，采用上述實施例所生產(chǎn)的抗菌肽，作為飼料添加劑添加到全價配合飼料中，經(jīng)畜禽等養(yǎng)殖動物飼喂試驗顯示，能顯著提高養(yǎng)殖動物免疫力，降低死淘率，降低料肉比等生產(chǎn)性能。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。