本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對EGFR和CD3的雙特異性抗體的構(gòu)建和制備方法，以及該抗體在疾病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雙特異性抗體(bispecific antibody,BiAb)是由兩種不同的抗體片段構(gòu)成的人工抗體，能夠特異性識別和結(jié)合兩個(gè)不同的抗原或兩個(gè)不同的抗原表位。

單克隆抗體廣泛應(yīng)用于癌癥、炎癥和其它疾病的治療，由于這些抗體所針對的都是單一的靶標(biāo)，很多患者不能充分響應(yīng)單一的療法，時(shí)常出現(xiàn)抗藥性。雙特異性抗體能夠同時(shí)識別兩個(gè)不同的抗原或抗原表位，可以作為一種媒介重新定向免疫效應(yīng)細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞，加強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。此外，雙特異性抗體還可以定位于同一個(gè)細(xì)胞的兩個(gè)不同的抗原，導(dǎo)致細(xì)胞信號的改變，包括癌癥擴(kuò)散信號或炎癥信號。經(jīng)過長時(shí)間的研究和發(fā)展，出現(xiàn)了多種形式的雙特異性抗體，如雙特異性微抗體、雙鏈抗體、單鏈雙價(jià)抗體和多價(jià)雙特異性抗體等。這些雙特異性抗體基本上分為兩大類：含有Fc的和不含有Fc的。前者具有較好的溶解性、穩(wěn)定性和半衰期，而Fc介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒性作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解效應(yīng)(CDC)可以帶來一些治療所需的附加效應(yīng)。相比之下，缺乏Fc的雙特異性抗體完全依賴其抗原結(jié)合能力發(fā)揮其治療作用；另外Fc蛋白可以延長藥物蛋白(或多肽)在體內(nèi)的半衰期，從而延長活性分子在體內(nèi)的作用時(shí)間。

腫瘤細(xì)胞表面抗原表皮生長因子受體(EGFR)：表皮生長因子受體廣泛分布于除血管組織外的上皮細(xì)胞膜上，是一個(gè)跨膜蛋白,分子量約為l80KDa，具有配體誘導(dǎo)酪氨酸蛋白激酶活性，它是ErbB這個(gè)保守的受體家族中的一員,這個(gè)家族的其他成員包括HER2/Neu/ErbB2,HER3/ErbB3和HER4/ErbB4。ErbB受體的共同特征是：包含一個(gè)胞外(EC)配體結(jié)合區(qū)，由兩個(gè)重復(fù)的富含半胱氨酸的區(qū)域組成的單一跨膜區(qū)，以及含有酪氨酸蛋白激酶和自身磷酸化位點(diǎn)的胞內(nèi)序列；配體和受體結(jié)合后，引起受體的二聚化作用，形成同型或異型二聚體；二聚化的受體發(fā)生交聯(lián)磷酸化，激活胞內(nèi)區(qū)的TK亞區(qū)，從而激發(fā)下一級信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化。EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，其機(jī)制包含有：EGFR的高表達(dá)引起下游信號傳導(dǎo)的增強(qiáng)，突變型EGFR受體或配體表達(dá)的增加導(dǎo)致EGFR的持續(xù)活化，自分泌環(huán)的作用增強(qiáng)，受體下調(diào)機(jī)制的破壞，異常信號傳導(dǎo)通路的激活等。研究表明EGFR在很多實(shí)體瘤中高表達(dá)或異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。EGFR的過表達(dá)在腫瘤的演進(jìn)中發(fā)揮著重要作用，如膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等組織中都有EGFR的過度表達(dá)。

免疫細(xì)胞表面抗原分化簇3(CD3)：CD3分子是T細(xì)胞膜上的重要分化抗原,是成熟T細(xì)胞的特征性標(biāo)志，由6條肽鏈組成，以非共價(jià)鍵與T細(xì)胞抗原受體(TCR)組成TCR-CD3復(fù)合體，不僅參與TCR-CD3復(fù)合體的胞漿內(nèi)組裝，而且通過各多肽鏈胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)傳遞抗原刺激信號。CD3分子的主要功能為：穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)，傳遞T細(xì)胞活化信號,當(dāng)TCR特異性識別并結(jié)合抗原后,CD3參與將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞胞漿內(nèi),作為誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的第一信號，在T細(xì)胞抗原識別和免疫應(yīng)答產(chǎn)生過程中具有極其重要的作用。

在醫(yī)學(xué)中，特別是腫瘤的免疫治療中，雙特異性抗體具有良好的效果和前景，能夠同時(shí)結(jié)合腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞上的特異性抗原-抗免疫活性細(xì)胞CDl6或CD3的部分，具有激活NK細(xì)胞或T細(xì)胞作用，而抗腫瘤的特異性抗原部分可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞，將免疫細(xì)胞靶向到腫瘤細(xì)胞，提高局部NK細(xì)胞或T細(xì)胞濃度，從而使免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞起到特異性殺傷作用?，F(xiàn)有技術(shù)中，還沒有成功上市的EGFR和CD3雙特異性抗體藥物產(chǎn)品，該項(xiàng)技術(shù)有待研究。

相對于中國專利CN201510030519.9，本發(fā)明是采用四價(jià)雙特異性抗體，完整的保留了抗EGFR抗體的生物學(xué)活性；四價(jià)雙特異能夠更好的識別腫瘤抗原和效應(yīng)細(xì)胞(T細(xì)胞和NK細(xì)胞等)，從而能夠更好地發(fā)揮雙特異抗體的生物學(xué)活性。美國專利US9249217B2則采用ScFv-ScFv(BITE)形式，而BITE是二價(jià)的且沒有Fc片段。與BITE相比，本發(fā)明除了具有四價(jià)抗體的優(yōu)勢外，還含有Fc片段；Fc片段可以延長效應(yīng)分子在體內(nèi)的半衰期，從而延長了效應(yīng)分子在體內(nèi)的作用時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明中提供了一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體在抗EFGR的C-端增加了抗CD3的ScFv序列，這種雙特異抗體保留了抗EGFR抗體完整分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)增加了結(jié)合CD3抗原的能力，這樣既保持了原有EGFR抗體在體內(nèi)生物學(xué)活性，同時(shí)通過特異性識別兩種不同的抗原，靶向免疫效應(yīng)細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞，從而增加了免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

本發(fā)明提供了抗EGFR和抗CD3雙特異抗體及其應(yīng)用，

包含(a)完整的單克隆抗體，(b)單鏈抗體ScFv和(c)連接子；所述(a)與EGFR抗原特異性結(jié)合并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成；所述(b)與免疫細(xì)胞抗原CD3特異性結(jié)合，所述(b)為兩條單鏈抗體ScFv；所述(b)為兩條單鏈抗體ScFv；所述(b)的兩條單鏈抗體ScFv分別通過所述(c)連接子linker與所述(a)的兩條重鏈的C末端連接。

其中，所述雙特異抗體中所述(c)連接子linker的氨基酸序列為(GGGGX)n,X包含Ser或Ala，X優(yōu)選Ser；n為1-4的自然數(shù)，n優(yōu)選3。

其中，所述雙特異性抗體(a)完整的單克隆抗體是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，每條重鏈和輕鏈之間通過二硫鍵連接，兩條重鏈之間通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接。所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面EGFR抗原。

其中，所述(a)完整的單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一種，優(yōu)選IgG2。

其中，所述(a)完整的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3中的一種；所述(a)完整的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 4、EQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中的一種。所述(b)單鏈抗體ScFv的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 8，所述(b)單鏈抗體ScFv的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 9。

其中，所述(b)兩條單鏈抗體ScFv的氨基酸序列均為SEQ ID NO 7。

其中，每個(gè)(b)單鏈抗體ScFv是由重鏈可變區(qū)、(c)連接子linker和輕鏈可變區(qū)組成，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)特異性結(jié)合免疫細(xì)胞表面CD3抗原；所述(c)連接子linker的氨基酸序列為(GGGGS)n，n為1-4的自然數(shù)，優(yōu)選為(GGGGS)₃。

其中，構(gòu)建雙特異抗體的表達(dá)載體，其中所述雙特異抗體可以構(gòu)建到一個(gè)載體中，或者分別構(gòu)建到兩個(gè)不同的載體上。

其中，通過基因工程方法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞包含原核細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞或其他哺乳細(xì)胞，優(yōu)選為CHO細(xì)胞。

其中，通過常規(guī)的免疫球蛋白方法，包含蛋白質(zhì)A親和層析和離子交換、疏水層析或分子篩方法獲得所述雙特異性抗體。

其中，所述雙特異性抗體用于EGFR高表達(dá)或非正常表達(dá)的腫瘤組織的治療及其他EGFR過表達(dá)引起疾病的治療。

其中，所述完整的單克隆抗體為全長抗體。

采用上述技術(shù)方案，包括以下有益技術(shù)效果：

本發(fā)明的雙特異性抗體是采用四價(jià)抗體的形式，這種形式的四價(jià)抗體完整的保留了結(jié)合腫瘤抗原的抗體序列，具有較高的親和力。同時(shí)四價(jià)雙特異抗體可以更好的連接腫瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，從而更有利于發(fā)揮雙特異抗體的生物學(xué)功能。相對于現(xiàn)在常用的BITE雙特異抗體形式，本發(fā)明中的分子還包括了Fc片段；Fc片段的存在可以延長藥物分子在體內(nèi)的半衰期，從而能夠使藥物分子更好的發(fā)揮作用，降低病人用藥頻率，減輕病人的痛苦。本發(fā)明用于高表達(dá)或非正常表達(dá)EGFR腫瘤組織的治療，以及其他EGFR過表達(dá)引起疾病的治療。

附圖說明

圖1示例性示出了雙特異抗體的分子示意圖；

圖2示例性示出了雙特異分子質(zhì)粒表達(dá)的構(gòu)建圖；

圖3示例性示出了純化后的雙特異分子的變性SDS電泳圖；

圖4示例性示出了ELISA法檢測雙特異分子與抗原的結(jié)合能力；

圖5示例性示出了雙特異抗體與A431細(xì)胞的結(jié)合；

圖6示例性示出了雙特異抗體與Jukart細(xì)胞的結(jié)合；

圖7示例性示出了雙特異抗體介導(dǎo)的PBMC對A431的結(jié)合；

圖8示例性示出了雙特異抗體介導(dǎo)的PBMC對H520的殺傷效果。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本發(fā)明提供了抗EGFR和抗CD3雙特異抗體及其應(yīng)用，包含(a)完整的單克隆抗體，(b)單鏈抗體ScFv和(c)連接子；所述(a)與EGFR抗原特異性結(jié)合并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成；所述(b)與免疫細(xì)胞抗原CD3特異性結(jié)合，所述(b)為兩條單鏈抗體ScFv；所述(b)為兩條單鏈抗體ScFv；所述(b)的兩條單鏈抗體ScFv分別通過所述(c)連接子linker與所述(a)的兩條重鏈的C末端連接。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙特異抗體中所述(c)連接子linker的氨基酸序列為(GGGGX)n,X包含Ser或Ala，X優(yōu)選Ser；n為1-4的自然數(shù)，n優(yōu)選3。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙特異性抗體(a)完整的單克隆抗體是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，每條重鏈和輕鏈之間通過二硫鍵連接，兩條重鏈之間通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接。所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面EGFR抗原。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述(a)完整的單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的一種，優(yōu)選IgG2。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述(a)完整的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3中的一種；其中，

SEQ ID NO 1(尼妥珠單克隆抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTKATLTVDESSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTLTVSS；

SEQ ID NO 2(西妥昔單克隆抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列)：QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA；

SEQ ID NO 3(帕尼單抗單克隆抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS。

其中，所述(a)完整的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 4、EQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中的一種，

SEQ ID NO 4(尼妥珠單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

DVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFRGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQYSHVPWTFGGGTKLEIK；

SEQ ID NO 5(西妥昔單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK；

SEQ ID NO 6(帕尼單抗單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIK。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述(b)單鏈抗體ScFv的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 8，所述(b)單鏈抗體ScFv的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 9；其中，

SEQ ID NO 8(抗CD3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS；

SEQ ID NO 9(抗CD3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列)：

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述(b)兩條單鏈抗體ScFv的氨基酸序列均為SEQ ID NO 7；其中，

SEQ ID NO 7(抗CD3單鏈抗體氨基酸序列)：

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK。

進(jìn)一步優(yōu)選地，每個(gè)(b)單鏈抗體ScFv是由重鏈可變區(qū)、(c)連接子linker和輕鏈可變區(qū)組成，所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)特異性結(jié)合免疫細(xì)胞表面CD3抗原；所述(c)連接子linker的氨基酸序列為(GGGGS)n，n為1-4的自然數(shù)，優(yōu)選為(GGGGS)₃。

進(jìn)一步優(yōu)選地，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞包含原核細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞或其他哺乳細(xì)胞，優(yōu)選為CHO細(xì)胞。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述雙特異性抗體用于EGFR高表達(dá)或非正常表達(dá)的腫瘤組織的治療及其他EGFR過表達(dá)引起疾病的治療。

具體實(shí)施例1、雙特異抗體分子的表達(dá)載體的構(gòu)建

a)雙特異瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

按照圖1中雙特異抗體的形式設(shè)計(jì)相應(yīng)的基因序列。選擇PTSE作為表達(dá)載體去克隆和表達(dá)抗EGFR的輕鏈基因和抗EGFR重鏈—CD3的ScFV融合基因。輕鏈基因和融合基因分別在編碼區(qū)序列兩側(cè)加入Sall、BamHl酶切位點(diǎn)，兩條基因由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成并分別克隆到PUC19載體中。將兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到TOP感受態(tài)(匯天東方，貨號HT702-03)中，用康為世紀(jì)小提試劑盒(貨號CW0500)進(jìn)行小提后與載體分別用限制性內(nèi)切酶Sall-HF和BamHI-HF酶切，進(jìn)行同源重組，分別得到含有輕鏈及融合基因的表達(dá)載體(示意圖見圖2A和圖2B)，質(zhì)粒分別命名為：PTSE-JY016L-TetBiAb、PTSE-JY016H-TetBiAb。

b)雙特異穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)載體構(gòu)建

選擇PGN-2CMV作為表達(dá)載體去克隆和表達(dá)抗EGFR的輕鏈基因和抗EGFR重鏈-CD3的ScFV融合基因，該載體包括篩選標(biāo)記Neomycin和GS，含有兩個(gè)CMV啟動子及相應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元。設(shè)計(jì)輕鏈及融合基因的引物并引入Kozak序列、信號肽及相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行合成。以質(zhì)粒PTSE-JY016L-TetBiAb、PTSE-JY016H-TetBiAb為模板，PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶并與載體進(jìn)行同源重組(質(zhì)粒圖譜見圖2C)。

具體實(shí)施例2、雙特異抗體分子的表達(dá)與純化

a)四價(jià)抗體的表達(dá)

利用無內(nèi)毒素大提試劑盒(康為世紀(jì)，CW2104)進(jìn)行質(zhì)粒大提，具體操作步驟按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。

人胚腎細(xì)胞(HEK293ES懸浮細(xì)胞)在FreeStyle 293Expressi on Medium(Gibco，12338-026)中培養(yǎng)，細(xì)胞每隔一到兩天傳代一次，傳代后細(xì)胞起始密度維持在0.2～0.6×10⁶/ml，細(xì)胞培養(yǎng)體積為搖瓶容積的15～35％，細(xì)胞培養(yǎng)瓶放在搖床(搖床轉(zhuǎn)速:135rpm，溫度:37℃，CO₂:5％)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的HEK293ES細(xì)胞，傳代到細(xì)胞密度為0.5×10⁶/ml，放搖床(135rpm，37℃，5％CO₂)培養(yǎng)過夜，待第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染前將準(zhǔn)備好的1×10⁶/ml細(xì)胞懸液在搖床(135rpm，39℃，5％CO₂)培養(yǎng)2h，轉(zhuǎn)染時(shí)，依次加入PTSE-antiEGFR-H-TetBiAb(終濃度0.5μg/ml)、PTSE-antiEGFR-L(終濃度0.5μg/ml)、聚乙烯亞胺PEI(Sigma)(終濃度2ug/ml)，混勻，一起共轉(zhuǎn)染到HEK293ES懸浮細(xì)胞中，之后，置于搖床(135rpm，39℃，5％CO₂)培養(yǎng)40min。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)在135rpm，37℃，5％CO₂搖床中培養(yǎng)，表達(dá)抗EGFR×CD3的四價(jià)抗體。轉(zhuǎn)染96小時(shí)后離心收獲表達(dá)上清。

b)四價(jià)雙特異抗體的純化

表達(dá)上清用0.22uM濾膜過濾，利用親和層析柱從表達(dá)上清中獲得帶有Fc結(jié)構(gòu)域的抗體。平衡緩沖液和洗脫緩沖液分別為50mM Tris-HCl0.15M NaCl PH7.0和0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉PH3.0。通過陽離子交換層析獲得目標(biāo)雙特異抗體，陽離子交換柱為HiTrap SP FF，通過平衡緩沖20mM PB PH6.3平衡SP層析柱，用洗脫緩沖液20mMPB+1M NaCl(PH6.3)進(jìn)行洗脫，最后用PBS緩沖液進(jìn)行換液濃縮。純化后的雙特異分子還原SDS-PAGE如圖3所示。其中Bispecific-1的EGFR抗體序列為尼妥珠單抗(nimotuzumab)序列；Bispecific-2的EGFR抗體序列為西妥昔單抗(Cetuximab)；Bispecific-3的EGFR抗體序列為帕尼單抗(Panitumumab)。

具體實(shí)施例3：雙特異抗體分子與CD3和EGFR分子結(jié)合情況

用pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被EGFR胞外區(qū)或者CD3E與CD3G亞基胞外區(qū)的二聚體，100ng/孔/100ul，4℃包被過夜。用300ul/孔含0.1％的PBS(PBS-T)緩沖液洗五次，再加入1％BSA-PBS溶液在室溫封閉2h。加入不同稀釋度的雙特異抗體或者是對應(yīng)的抗體。各種雙特異抗體(或抗體)最高濃度是1uM，3倍稀釋做10個(gè)梯度，最后一個(gè)孔只加稀釋液PBS作為陰性對照，37℃孵育1h。用300ul/孔PBS-T溶液洗五次，再加入用1％BSA-PBS溶液1:40000稀釋的Anti-Human Fc-HRP二抗37℃孵育1h。用100ul/孔的TMB顯色試劑盒顯色，室溫顯色8min，然后用2M H₂SO₄終止顯色，50ul/孔,450nm/630nm讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，所有雙特異抗體結(jié)合EGFR的能力均與其對應(yīng)的單抗能力相似[即由尼妥珠單抗序列構(gòu)建的雙特異抗體結(jié)合EGFR的能力與尼妥珠單抗的相似(圖4A)；由西妥昔單抗序列構(gòu)建的雙特異抗體結(jié)合EGFR的能力與西妥昔單抗的相似(圖4B)；由帕尼單抗序列構(gòu)建的雙特異抗體結(jié)合EGFR的能力與帕尼單抗的相似(圖4C)]；而各種雙特異抗體結(jié)合CD3E和CD3G二聚體的能力相近(圖4D)。結(jié)果表明了文中采用的雙特異抗體的形式幾乎完整的保留了原先抗體結(jié)合抗原的能力；而且CD3的ScFv結(jié)合CD3的能力與其連接的不同抗體無關(guān)(圖4D)。

具體實(shí)施例4、雙特異抗體分子與過表達(dá)EGFR或CD3細(xì)胞結(jié)合情況

a)雙特異性抗體與A431細(xì)胞的結(jié)合情況

本發(fā)明采用過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞系(A431)來檢測不同的雙特異抗體與細(xì)胞表面EGFR的結(jié)合情況，采用相對應(yīng)的抗體做陽性對照，用人的IgG(hIgG)作為同型對照。用0.25％胰酶消化、離心收集A431細(xì)胞。同時(shí)稀釋各種抗體，最高濃度為1uM，3倍梯度稀釋。將收集的細(xì)胞用PBS+1％BSA洗三遍，再加PBS+1％BSA重懸細(xì)胞,然后鋪細(xì)胞于96孔板中，每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞，加入100ul稀釋好的雙特異性抗體，室溫孵育1小時(shí)；離心去上清，用PBS洗細(xì)胞三遍，再用稀釋好的Alexa488標(biāo)記的抗人IgG-Fc抗體重懸細(xì)胞，室溫避光孵育1小時(shí)，PBS洗三遍，再用100ul PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。結(jié)果用Graphpad Prism分析。結(jié)果顯示(圖5)，每種雙特異抗體與A431的結(jié)合能力與其對應(yīng)的抗體具有可比性，而hIgG與A431的結(jié)合力很弱。證明雙特異抗體較好的保持了其母本抗體的特異結(jié)合細(xì)胞表面EGFR特異結(jié)合的活性。

b)雙特異抗體與Jurkat細(xì)胞結(jié)合情況

Jurkat細(xì)胞過表達(dá)CD3，可以用來檢測雙特異抗體與細(xì)胞表面CD3的結(jié)合情況。雙特異抗體與Jurkat細(xì)胞結(jié)合情況實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)施例4a類似，區(qū)別在于Jurkat細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，而A431是貼壁細(xì)胞。離心收集Jurkat細(xì)胞，加入各種抗體，其余操作與A431實(shí)驗(yàn)相同。結(jié)果顯示(圖6)，同型對照結(jié)合Jurkat的能力很弱；不同的雙特異抗體均能夠很好的結(jié)合細(xì)胞，而且三種雙特異抗體結(jié)合Jurkat細(xì)胞的能力一致，表明了圖1的雙特異抗體中抗CD3的ScFv結(jié)合細(xì)胞表面抗原的能力不受與它連接的抗體影響。

具體實(shí)施例5、雙特異抗體分子介導(dǎo)的PBMC對效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用

a)A431或H520細(xì)胞PKH26標(biāo)記

A431是一種過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞株；而H520則不表達(dá)EGFR。本實(shí)驗(yàn)采用A431作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株；而H520作為陰性對照。

取2×10⁶個(gè)細(xì)胞于1.5ml離心管中1500rpm離心5min，棄完全培養(yǎng)基，用無血清的培養(yǎng)基分別清洗細(xì)胞兩次；用PKH26試劑盒中的DiluentC溶液重懸細(xì)胞，然后加入等體積的2×P KH26染料液(配制比例：0.4μl染料原液溶于100μl的Diluent C)，混勻后室溫放置1min。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入與管中溶液等體積的0.5％BSA-PBS溶液終止反應(yīng)，再加入1ml相應(yīng)的完全培養(yǎng)基稀釋重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min收集細(xì)胞沉淀。用完全培養(yǎng)基重懸后與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)待用。

b)PBMC分離

在50ml管中加入20ml單個(gè)核細(xì)胞分離液；用全血稀釋液將采集到的血液按1:1進(jìn)行稀釋處理，混勻后沿康寧管內(nèi)壁勻速緩慢的鋪至分離液上層，每管內(nèi)加入稀釋后全血體積為20ml；待各管加液完畢后放入提前預(yù)冷至22℃的離心機(jī)內(nèi)，600g水平離心15min(加減速設(shè)置為1)；離心完成后取出離心管，用移液器小心吸取置于分離液和血清間呈圓弧狀分布的細(xì)胞層—單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，置于新的50ml管中；按照1:5比例在細(xì)胞液中加入細(xì)胞洗滌液，充分混勻后離心，棄上清，再重復(fù)洗滌一次，收集細(xì)胞沉淀，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)于細(xì)胞瓶中待用。

c)CD3+T細(xì)胞磁珠分選

PBS(Ph7.2,含0.5％BSA，2mM EDTA),過濾除菌，同時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。

離心去血小板(20度，200g，10-15分鐘)，然后30μm濾膜去除細(xì)胞團(tuán)塊。收集PBMC細(xì)胞：200g離心10分鐘，棄上清。2x10⁷細(xì)胞重懸于60μl buffer+20μl FcR Blocking Reagent中。加入20μl磁珠，混勻，2-8℃孵育15分鐘；加入1-2ml buffer，300g，離心10分鐘，棄盡上清；500μl重懸。將分選柱置于分選架上，500μl潤洗；加入細(xì)胞懸液，收集未結(jié)合細(xì)胞；柱體頂端液體流盡后，500μl洗三次；將分選柱從分選架上取下，置于收集管中，1ml快速沖洗，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并觀察活細(xì)胞比例。

d)雙特異抗體效應(yīng)功能檢測

按照終濃度1uM起，1:3倍比稀釋，10梯度，2復(fù)孔；同時(shí)設(shè)立2個(gè)無藥物對照孔，用培養(yǎng)基補(bǔ)足體積,將標(biāo)記后的A431或H520細(xì)胞(2×10⁴個(gè)/孔/50μl)與CD3+T細(xì)胞(2×10⁵個(gè)/孔/50μl)，按照所需用量混勻后分至V-bottom 96孔板各孔，同時(shí)設(shè)立以下三個(gè)流式對照孔：①無標(biāo)記的Raji細(xì)胞(2×10⁴個(gè)/孔)②PKH26標(biāo)記后的細(xì)胞(2×10⁴個(gè)/孔)；③CD3+T細(xì)胞(2×10⁵個(gè)/孔)。培養(yǎng)18小時(shí)，孵育結(jié)束后按照1:50000的比例加入TO-PRO3染料，37℃避光孵育10min；同時(shí)設(shè)立一個(gè)流式對照④TO-PRO3標(biāo)記后的細(xì)胞。3000rpm離心5min后棄部分培養(yǎng)基上清，用0.5％BSA-PBS溶液重懸，流式檢測。

計(jì)算公式：

細(xì)胞死亡率％＝(1-PKH26⁺TOPRO3^-細(xì)胞數(shù)目(藥物作用組)/PKH26⁺TOPRO3^-細(xì)胞數(shù)目(無藥物作用組))X100

e)結(jié)果分析

由圖7可知，雙特異抗體分子介導(dǎo)的PBMC對過表達(dá)EGFR的A431效應(yīng)細(xì)胞有非常好的殺傷作用；而他們對應(yīng)的抗體和hIgG則殺傷效果很弱。同時(shí)所有的雙特異抗體對不表達(dá)EGFR的H520細(xì)胞殺傷效果都非常弱，且與同型對照hIgG類似(圖8)。這表明了所有構(gòu)建的雙特異抗體對靶細(xì)胞的殺傷作用是特異的；三種不同的雙特異抗體殺傷特異性靶細(xì)胞的能力相似，而且細(xì)胞死亡率在80％左右。以上表明了圖1中雙特異抗體具有良好的生物學(xué)活性。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。