本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，現(xiàn)已被證實(shí)存在于機(jī)體的多種組織器官中，是一群具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞。與其他來源MSCs相比，脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stromal cells,ADSCs)在分離培養(yǎng)上有很大優(yōu)勢(shì)：

(1)取材方便。脂肪組織儲(chǔ)備豐富，取材痛苦小。目前一次吸脂術(shù)可獲得200ml脂肪，分離出約1×10⁶個(gè)干細(xì)胞，為骨髓分離量的40倍；(2)分離簡單。外周脂肪經(jīng)機(jī)械剪切，膠原酶消化和簡單梯度離心就可獲得ADSCs。

但在目前實(shí)際應(yīng)用過程中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)存在擴(kuò)增能力有限、遷移性差等問題。干細(xì)胞的遷移性已被證實(shí)與干細(xì)胞的分化能力和損傷修復(fù)能力密切相關(guān)，因此，尋找一種新的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法以促進(jìn)其增殖、提高其遷移能力是非常有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)存在擴(kuò)增能力有限、遷移性差等技術(shù)問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，作為本發(fā)明的一方面，提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。所述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法將獲取的原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種至干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理，其中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子和白介素3因子，且所述干細(xì)胞因子與白介素3因子的含量比為(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法通過在干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加干細(xì)胞因子和白介素3因子，并控制兩因子含量比，使得兩細(xì)胞因子產(chǎn)生對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長和增殖的協(xié)效作用，從而提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的擴(kuò)增能力，并獲得較高的遷移能力，有效解決了傳統(tǒng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法存在的擴(kuò)增能力有限、遷移性差的問題，為臨床應(yīng)用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行組織損傷修復(fù)提供了優(yōu)良的種子。

在干細(xì)胞因子和白介素3因子協(xié)效作用的基礎(chǔ)上，通過在培養(yǎng)方法中增設(shè)的含有纖連蛋白包被液的包被處理，使得纖連蛋白與干細(xì)胞因子和白介素3因子之間進(jìn)一步產(chǎn)生協(xié)效作用，從而提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的的增殖以及遷移能力。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：

圖1為實(shí)施例1重組質(zhì)粒pET-30a-rhIL-3酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M:DNA ladder；1～3：質(zhì)粒pET-30a-rhIL-3用Nde I和Xho I進(jìn)行酶切；

圖2為實(shí)施例1中rhIL-3在菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3中誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果的SDS-PAGE檢測(cè)圖；其中，1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌體總蛋白；2：IPTG誘導(dǎo)后的1#BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌體總蛋白；3：IPTG誘導(dǎo)后的2#BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌體總蛋白；4：購買的商業(yè)化IL-3樣本；M：蛋白質(zhì)Marker；

圖3為實(shí)施例1中離子交換層析后的目的IL-3重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)圖；其中，M：蛋白Marker；1：IPTG誘導(dǎo)后的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌體總蛋白；2：300mmol NaCl洗脫物1#管；3：300mmol NaCl洗脫物2#管；

圖4為實(shí)施例1-2和對(duì)比實(shí)施例1-3各實(shí)施例培養(yǎng)的ADSC生長曲線圖；

圖5為實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例3培養(yǎng)的ADSC表型流式檢測(cè)圖；其中圖5A為間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原表達(dá)流式圖，圖5B為造血細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)流式圖；

圖6為實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例3培養(yǎng)的ADSC周期的流式檢測(cè)圖；其中圖6A為Ctr-ADSC細(xì)胞周期的流式檢測(cè)圖；圖6B為F/S/I-ADSC細(xì)胞周期的流式檢測(cè)圖；圖6C為Ctr-ADSC細(xì)胞和F/S/I-ADSC細(xì)胞周期流式檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；

圖7為實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例3培養(yǎng)的ADSC遷移性檢測(cè)圖；其中圖7A為Ctr-ADSC細(xì)胞遷移軌跡跟蹤圖；圖7B為F/S/I-ADSC細(xì)胞遷移軌跡跟蹤圖；圖7C為Ctr-ADSC細(xì)胞和F/S/I-ADSC細(xì)胞遷移平均速度統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

相關(guān)專業(yè)詞匯說明：

纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)：高分子量(～440kDa)的糖蛋白細(xì)胞外基質(zhì)，和細(xì)胞膜內(nèi)稱為整合素的受體蛋白結(jié)合。

干細(xì)胞因子(Stem Cell Factor，SCF)：酪氨酸激酶受體c-Kit的配體。

白介素3(Interleukin 3，IL-3)：一種多效性的細(xì)胞因子，主要由激活了的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生，通過與其受體IL-3R結(jié)合，誘導(dǎo)JAK-STAT5信號(hào)通路的激活，控制DNA合成，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。

IPTG：異丙基硫代半乳糖苷，是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種能夠有效提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。本實(shí)施例脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法含有如下步驟：

將獲取的原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種至干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理。

在步驟中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子和白介素3因子，且控制所述干細(xì)胞因子與白介素3因子的含量比為(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。通過在培養(yǎng)基中添加干細(xì)胞因子與白介素3因子，并控制兩因子的含量比例，使得兩因子在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增中發(fā)揮協(xié)效作用，從而提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的擴(kuò)增能力，并獲得較高的遷移能力。

在一實(shí)施例中，控制干細(xì)胞因子在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為5-20μmol/ml。當(dāng)然在干細(xì)胞因子和白介素3因子含量比例明確的前提下，明確了干細(xì)胞因子在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度，也就明確了白介素3在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度。通過優(yōu)化控制干細(xì)胞因子和白介素3在所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度，能夠進(jìn)一步提高干細(xì)胞因子與白介素3因子的協(xié)效作用，從而進(jìn)一步提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力和遷移能力。

在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上，在一實(shí)施例中，白介素3因子為重組人IL-3，具體是經(jīng)優(yōu)化后的人全長IL-3基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行誘導(dǎo)后的重組人IL-3。其中，人全長IL-3基因序列為GenBank數(shù)據(jù)庫記錄的人全長IL-3基因序列，所述優(yōu)化后的人全長IL-3基因序列是針對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫記錄的人全長IL-3基因序列進(jìn)行的優(yōu)化。在具體實(shí)施例中，所述優(yōu)化后的人全長IL-3基因序列如下：

5'-ATG AGC CGC CTG CCC GTC CTG CTC CTG CTC CAA CTC CTG GTC CGC CCC GGA CTC CAA GCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG CCC TTG AAG ACA AGC TGG GTT AAC TGC TCT AAC ATG ATC GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA AAG CAG CCA CCT TTG CCT TTG CTG GAC TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA GAC CAA GAC ATT CTG ATG GAA AAT AAC CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC AAC AGG GCT GTC AAG AGT TTA CAG AAC GCA TCA GCA ATT GAG AGC ATT CTT AAA AAT CTC CTG CCA TGT CTG CCC CTG GCC ACG GCC GCA CCC ACG CGA CAT CCA ATC CAT ATC AAG GAC GGT GAC TGG AAT GAA TTC CGG AGG AAA CTG ACG TTC TAT CTG AAA ACC CTT GAG AAT GCG CAG GCT CAA CAG ACG ACT TTG AGC CTC GCG ATC TTT TGA-3'?！猄EQ ID NO 1

其中，上述重組人IL-3的誘導(dǎo)獲得方法是以優(yōu)化后的人全長IL-3基因序列為靶基因進(jìn)行設(shè)計(jì)引物和相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，然后按照常規(guī)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)，具體是將優(yōu)化后的人全長IL-3基因序列插入到原核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化獲得含有優(yōu)化后的人全長IL-3基因序列的菌株，最后實(shí)現(xiàn)重組人IL-3的表達(dá)。在具體實(shí)施例中，重組人IL-3的獲得方法可以但不僅僅如下文實(shí)施例1中的重組人IL-3的制備方法制備獲得。采用上述重組人IL-3，使得其與干細(xì)胞因子之間生產(chǎn)的協(xié)效作用更強(qiáng)，從而使得脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力和遷移能力更強(qiáng)。

在上述各實(shí)施例的基礎(chǔ)上，在優(yōu)選實(shí)施例中，上述培養(yǎng)處理是在被包被處理的培養(yǎng)器中進(jìn)行，所述包被處理的包被液含有纖連蛋白。通過事先采用含有纖連蛋白的包被液對(duì)培養(yǎng)器進(jìn)行包被處理，使得功能因子纖連蛋白分布在培養(yǎng)器的內(nèi)部中，當(dāng)將原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種至干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)處理的過程中，該纖連蛋白會(huì)發(fā)揮作用，具體是其能夠參與到干細(xì)胞因子和白介素3因子的協(xié)效作用中，從而使得三因子產(chǎn)生協(xié)效作用，從而提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖以及遷移能力。在此基礎(chǔ)上，一實(shí)施例中，所述纖連蛋白在所述包被液中的濃度為5-20μg/ml。在具體實(shí)施例中，包被處理的方法可以但不僅僅為將含有該濃度的纖連蛋白的緩沖溶液加入培養(yǎng)器中，于優(yōu)選4℃避光過夜。

另外，上述各實(shí)施例中的原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取方法可以按照現(xiàn)有的方法獲得。原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)處理的條件，如培養(yǎng)溫度可以采用常規(guī)的培養(yǎng)溫度，如37℃。

為了有效發(fā)揮干細(xì)胞因子和白介素3因子或者纖連蛋白、干細(xì)胞因子和白介素3因子之間的作用，在一實(shí)施例中，上述各實(shí)施例中的所述培養(yǎng)處理過程中，24小時(shí)后更換新的所述干細(xì)胞培養(yǎng)基，之后每隔兩天更換一次所述干細(xì)胞培養(yǎng)基。

另一方面，在上文本發(fā)明實(shí)施例脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，本實(shí)施例還提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，具體的，該脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是由上文本發(fā)明實(shí)施例脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得。因此，本發(fā)明實(shí)施例脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有高的擴(kuò)增能力和遷移能力。

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1.重組人IL-3(rhIL-3)的制備

1.1 pET-30a-rhIL-3原核表達(dá)菌株的構(gòu)建

對(duì)來自GenBank數(shù)據(jù)庫的人全長IL-3基因進(jìn)行堿基密碼子的優(yōu)化，使其易于在大腸桿菌中表達(dá)。優(yōu)化后的堿基序列如下：

5'-ATG AGC CGC CTG CCC GTC CTG CTC CTG CTC CAA CTC CTG GTC CGC CCC GGA CTC CAA GCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG CCC TTG AAG ACA AGC TGG GTT AAC TGC TCT AAC ATG ATC GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA AAG CAG CCA CCT TTG CCT TTG CTG GAC TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA GAC CAA GAC ATT CTG ATG GAA AAT AAC CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC AAC AGG GCT GTC AAG AGT TTA CAG AAC GCA TCA GCA ATT GAG AGC ATT CTT AAA AAT CTC CTG CCA TGT CTG CCC CTG GCC ACG GCC GCA CCC ACG CGA CAT CCA ATC CAT ATC AAG GAC GGT GAC TGG AAT GAA TTC CGG AGG AAA CTG ACG TTC TAT CTG AAA ACC CTT GAG AAT GCG CAG GCT CAA CAG ACG ACT TTG AGC CTC GCG ATC TTT TGA-3'——SEQ ID NO 1

對(duì)優(yōu)化后的rhIL-3全長基因序列進(jìn)行合成，設(shè)計(jì)引物和酶切位點(diǎn)(其中5’端酶切位點(diǎn)為Nde I，3’端酶切位點(diǎn)為Xho I)，正向引物和反向引物的序列如下：

5'-CGCCATATGATGAGCCGCCTGCCCG-3'——SEQ ID NO 2

5'-CTCGAGCGGTCAAAAGATCGCGAG-3'——SEQ ID NO 3

。將rhIL-3全長基因插入到原核表達(dá)載體pET-30a(+)載體中，得到重組質(zhì)粒pET-30a-rhIL-3，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)中。在LB板上經(jīng)過卡那霉素(30μg/ml)抗性篩選后，挑取單菌落到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將酶切后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示，由此可知，人工合成的rhIL-3全長序列(459bp)已成功插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)(5422bp)中，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)中，即得到的陽性表達(dá)菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3。

1.2 IL-3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

按照1:50的比例接種BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌種到LB培養(yǎng)基(含30ug/ml Kan)中，37℃、220-250rpm震蕩培養(yǎng)過夜。第二天早上按照1:100的比例接種前一天培養(yǎng)的細(xì)菌于LB培養(yǎng)液(含30ug/ml的Kan)中擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600＝0.5-0.6(一般接種培養(yǎng)2-3h)，加入IPTG至終濃度為1mM，30℃誘導(dǎo)表達(dá)3h，收獲菌體，用SDS-PAGE對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，鑒定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，泳道2、3的結(jié)果顯示，菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3在30℃用1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)能夠成功表達(dá)rhIL-3。

1.3 IL-3重組蛋白的純化

將上述收集的菌懸液5000g，4℃離心10min，棄上清，用預(yù)冷的裂解緩沖液(50mMPB，5mMEDTA，pH6.5)40-50倍濃縮菌體，置于50ml離心管或50ml燒杯內(nèi)，進(jìn)行超聲破碎。超聲條件：冰水浴，超聲4s，間隔5s，4min/次，重復(fù)至菌液變澄清為止。將裂解物12000g，4℃離心10min，收集上清，先后用0.8um、0.45μm的濾膜過濾后，利用離子交換層析法進(jìn)行上樣純化和濃縮，大概流程如下：

(1)用20mM PB洗柱子，隨洗脫進(jìn)行，280nm吸光度值先升高后降低，降至0.000-0.005時(shí)換下一洗脫液進(jìn)行洗脫；

(2)180mM NaCl的20mM PB洗柱子，280nm吸光度值先升高后降低，降至0.000-0.007時(shí)換用下一洗脫液；

(3)含300mM NaCl的20mM PB洗脫目的蛋白、分管收集。同時(shí)用SDS-PAGE對(duì)收集的目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)的電泳圖見圖3。從圖3的1、2、3泳道可以看出，利用該方法可以獲得高純度的rhIL-3蛋白；

(4)取50ml收集的目的蛋白樣品加入100ml不含NaCl的PB緩沖液，在4℃冰箱中進(jìn)行超濾，當(dāng)超濾杯內(nèi)液體剩余20ml左右時(shí)停止超濾，在超凈臺(tái)內(nèi)打開超濾杯，吸出少量樣品溶液，檢測(cè)蛋白濃度，將樣品濃縮至1mg/ml，用0.22um的濾器過濾，并分裝備用。

2.原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被：取1個(gè)T75培養(yǎng)瓶，加入5ml含10ug/ml FN的DPBS溶液，4℃避光過夜放置。

1#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10μmol/L SCF+10ug/ml IL-3+1％青鏈霉素。其中，IL-3為步驟1中獲得的重組人IL-3(rh IL-3)。

2.2 Day 1：手術(shù)室脂肪抽取后注入225ml離心管，將離心管置于冰盒中，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

2.3用含有0.1％慶大霉素的DPBS沖洗脂肪去除麻醉劑及血液。

2.4將上層脂肪按10ml每管轉(zhuǎn)移至50ml離心管，每管加入0.1％的I型膠原酶20ml，置于37℃恒溫水浴搖床中，200rpm震蕩60min，期間震蕩混勻一次，取出，液面分三層，上層為油脂層，中間為未消化脂肪組織層，下層為脂肪間充質(zhì)細(xì)胞及紅細(xì)胞混合層。

2.5加入20ml終止培養(yǎng)基(高糖DMEM+10％FBS+1％青鏈霉素)，1500rpm離心15min。

2.6將上兩層轉(zhuǎn)移至新的離心管備用，棄下層混合液，剩細(xì)胞沉淀，加入20ml DPBS重懸細(xì)胞。(若上兩層脂肪顆粒較多，可再次加入0.1％的I型膠原酶20ml，重復(fù)上述操作)。

2.7重懸后的細(xì)胞懸液用100um細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，1500rpm離心15min后，棄上清，用1#完全培養(yǎng)基重懸后，轉(zhuǎn)入棄去包被液的T75培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.8 24h后觀察到大量細(xì)胞貼壁，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每兩天換液一次，生長融合至90％時(shí)，用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)。1#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為F/S/I-ADSC。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1.重組人IL-3(rhIL-3)的制備，參照實(shí)施例1的步驟1；

2.原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)瓶：取1個(gè)T75培養(yǎng)瓶，不進(jìn)行包被處理。

1#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10μmol/L SCF+10ug/ml IL-3+1％青鏈霉素。其中，IL-3為步驟1中獲得的重組人IL-3(rh IL-3)。

步驟2.2至步驟2.8參照實(shí)施例1的步驟2.2至步驟2.8；培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為S/I-ADSC。

對(duì)比實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1.重組人IL-3(rhIL-3)的制備：參照實(shí)施例1中的步驟1。

2.原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)瓶：取1個(gè)T75培養(yǎng)瓶，不進(jìn)行包被處理。

2#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10ug/ml IL-3+1％青鏈霉素。其中，IL-3為步驟1中獲得的重組人IL-3(rh IL-3)。

步驟2.2至步驟2.6參照實(shí)施例1的步驟2.2至步驟2.6；

2.7重懸后的細(xì)胞懸液用100um細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，1500rpm離心15min后，棄上清，用2#完全培養(yǎng)基重懸后，轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.8 24h后觀察到大量細(xì)胞貼壁，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每兩天換液一次，生長融合至90％時(shí)，用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)。2#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為I-ADSC。

對(duì)比實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1.原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)瓶：取1個(gè)T75培養(yǎng)瓶，不進(jìn)行包被處理。

3#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+10μmol/L SCF+1％青鏈霉素。

步驟1.2至步驟1.6參照實(shí)施例1的步驟2.2至步驟2.6；

1.7重懸后的細(xì)胞懸液用100um細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，1500rpm離心15min后，棄上清，用3#完全培養(yǎng)基重懸后，轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8 24h后觀察到大量細(xì)胞貼壁，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每兩天換液一次，生長融合至90％時(shí)，用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)。3#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為S-ADSC。

對(duì)比實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1.原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.1 Day 0：

細(xì)胞培養(yǎng)瓶：取1個(gè)T75培養(yǎng)瓶，不進(jìn)行包被處理。

4#完全培養(yǎng)基的配制：高糖DMEM+2％Ultroser G+1％青鏈霉素。

步驟1.2至步驟1.6參照實(shí)施例1的步驟2.2至步驟2.6；

1.7重懸后的細(xì)胞懸液用100um細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，1500rpm離心15min后，棄上清，用4#完全培養(yǎng)基重懸后，轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8 24h后觀察到大量細(xì)胞貼壁，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每兩天換液一次，生長融合至90％時(shí)，用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)。4#完全培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞標(biāo)記為Ctr-ADSC。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)測(cè)試和測(cè)試結(jié)果

將上述實(shí)施例1-2獲得的F/S/I-ADSC、S/I-ADSC和對(duì)比實(shí)施例1-3分別獲得的I-ADSC、S-ADSC、Ctr-ADSC分別進(jìn)行下述相關(guān)實(shí)驗(yàn)：

1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線繪制

分別取各實(shí)施例中P4代后各ADSC細(xì)胞，以1×10⁴/孔的密度接種24孔板，每隔兩天，取兩孔細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取兩孔細(xì)胞數(shù)均值，繪制不同組的細(xì)胞生長曲線。經(jīng)測(cè)試得知，實(shí)施例1-2獲得的ADSC細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于對(duì)比實(shí)施例1-3中所培養(yǎng)的ADSC，其中對(duì)比實(shí)施例3獲得的Ctr-ADSC細(xì)胞的增殖能力最弱，具體ADSC的生長曲線如圖4所示。由此證明了SCF與重組人IL-3之間、SCF與重組人IL-3和FN三者之間具有對(duì)ADSC的增殖和生長的協(xié)效作用。

2.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表型鑒定

2.1消化各實(shí)施例中P4代后對(duì)數(shù)生長期的ADSC細(xì)胞，計(jì)數(shù)；

2.2分別取10⁶個(gè)細(xì)胞于流式管中，DPBS洗兩遍，離心去上清；

2.3 100ul DPBS重懸后，分別單獨(dú)加入CD90-FITC、CD105-FITC、CD45-PE、CD34-PE抗體，常溫避光孵育30min；

2.4 DPBS洗兩遍，離心去上清；

2.5 0.5ml DPBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，Cell-Quest軟件分析，每個(gè)樣本至少分析10000個(gè)細(xì)胞。

經(jīng)過分別取各實(shí)施例中P4代后對(duì)數(shù)生長期的ADSC細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD90、CD105、CD45、CD34抗原的表達(dá)，流式檢測(cè)結(jié)果顯示，各實(shí)施例中ADSC細(xì)胞表面均低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34，CD45，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD90，CD105。其中，以實(shí)施例1的F/S/I-ADSC細(xì)胞和對(duì)比實(shí)施例3的Ctr-ADSC細(xì)胞為例，其各自流式檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，兩組ADSC細(xì)胞表面均低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34，CD45(<2％)，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD90，CD105(>95％)。

3.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期檢測(cè)3.1消化各實(shí)施例中P4代后對(duì)數(shù)生長期的ADSC細(xì)胞，計(jì)數(shù)；

3.2分別取10⁶個(gè)細(xì)胞于流式管中，DPBS洗兩遍，離心去上清；

3.3一邊震蕩一邊向細(xì)胞沉淀中加入70％預(yù)冷乙醇混勻，4℃固定18h以上；

3.4離心，棄去乙醇上清，加入預(yù)冷的DPBS洗沉淀2次，離心去上清；

3.5 0.5ml DPBS重懸細(xì)胞，加入5ul的5mg/ml RNA酶(終濃度50ug/ml)，37℃下孵育30min；

3.6加入25ul 1mg/ml PI(終濃度50ug/ml)，混勻后室溫、避光反應(yīng)30min；

3.7流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測(cè)，用Modifit軟件分析各時(shí)相細(xì)胞周期的比例。

經(jīng)過分別取各實(shí)施例中P4代后對(duì)數(shù)生長期的ADSC細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測(cè)，用Modifit軟件分析各時(shí)相細(xì)胞周期的比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示處于G2-M期的實(shí)施例1-2培養(yǎng)的F/S/I-ADSC、S/I-ADSC細(xì)胞細(xì)胞比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)比實(shí)施例1-3中I-ADSC、S-ADSC、Ctr-ADSC，且差異有顯著性(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了SCF與重組人IL-3之間、SCF與重組人IL-3和FN三者之間具有對(duì)ADSC的增殖和生長的協(xié)效作用，經(jīng)過SCF和IL-3兩因子或SCF、IL-3和FN三因子處理的ADSC細(xì)胞的增殖能力要強(qiáng)于傳統(tǒng)方法所培養(yǎng)的Ctr-ADSC細(xì)胞。以實(shí)施例1的F/S/I-ADSC和對(duì)比實(shí)施例3的Ctr-ADSC為例，實(shí)施例1中處于G2-M期的F/S/I-ADSC細(xì)胞比例為19.8％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)比實(shí)施例3的Ctr-ADSC細(xì)胞G2-M期的細(xì)胞比例(6.7％)，且兩者的差異有顯著性(P<0.05)，如圖6所示。

4.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

4.1分別取P4代后Ctr-ADSC細(xì)胞和F/S/I-ADSC細(xì)胞，以1x10⁵/孔接種至confocal專用chamber，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h以使細(xì)胞貼壁；

4.2取出chamber，使用1ml注射器針頭，于底面中央進(jìn)行劃線，更換二氧化碳非依賴性的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入10ug/ml IL-3，對(duì)照組加入等量DPBS；

4.3將chamber置于活細(xì)胞工作站中對(duì)劃線處進(jìn)行連續(xù)拍攝觀察，10倍物鏡下設(shè)置每兩分鐘拍攝一張照片，連續(xù)拍攝24h；

4.4所拍攝照片每隔十張?zhí)暨x一張，使用ImageJ軟件處理加工為視頻；

4.5于ImageJ中對(duì)劃線處一端隨機(jī)選取20個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行跟蹤，統(tǒng)計(jì)兩組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率差異。

經(jīng)過分別統(tǒng)計(jì)各實(shí)施例中P4代后ADSC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1-2培養(yǎng)的F/S/I-ADSC、S/I-ADSC細(xì)胞遷移性要強(qiáng)于對(duì)比實(shí)施例1-3中的I-ADSC、S-ADSC、Ctr-ADSC，且差異有顯著性(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了SCF與重組人IL-3之間、SCF與重組人IL-3和FN三者之間具有促進(jìn)ADSC遷移能力的協(xié)效作用，經(jīng)過SCF和IL-3兩因子或SCF、IL-3和FN三因子處理的ADSC細(xì)胞的遷移能力要強(qiáng)于傳統(tǒng)方法所培養(yǎng)的Ctr-ADSC細(xì)胞。以實(shí)施例1的F/S/I-ADSC和對(duì)比實(shí)施例3的Ctr-ADSC為例，實(shí)施例1的F/S/I-ADSC遷移能力與對(duì)比實(shí)施例3的Ctr-ADSC相比，兩者的遷移速度有顯著性差異(P<0.05)，如圖7所示。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。