本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)聚乙二醇水凝膠生物相容性和降解性的方法。

背景技術(shù)：

聚乙二醇具有安全、可自由改性、優(yōu)良的生物物理性能等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個(gè)醫(yī)藥領(lǐng)域，并且是通過美國FDA安全認(rèn)證的可外用內(nèi)服的生物材料?；诰垡叶歼@些優(yōu)良的性能，通過多種交聯(lián)技術(shù)而構(gòu)建的生物材料支架可以廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。但是該生物材料目前在運(yùn)用中也存在一些問題，首先聚乙二醇對較為敏感的細(xì)胞生物相容性不太理想，其次聚乙二醇生物材料無法被生物體降解，這些缺點(diǎn)限制了它更為廣泛的應(yīng)用，而對其缺點(diǎn)的改進(jìn)方法研究較少，目前仍然沒有很好的方法能夠解決此問題。

多肽鏈GRGDS和MMP-sensitive可以促進(jìn)細(xì)胞生長，并且能為細(xì)胞提供可降解的位點(diǎn)。將多肽?；?，并且與酰基化的聚乙二醇同時(shí)交聯(lián)，可以將這些多肽鏈化學(xué)結(jié)合至聚乙二醇骨架，由此提升該生物材料支架的生物相容性和可降解性，促進(jìn)細(xì)胞繁殖和組織再生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有聚乙二醇生物材料存在的不足，現(xiàn)提供一種增強(qiáng)聚乙二醇水凝膠生物相容性和降解性的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種增強(qiáng)聚乙二醇水凝膠生物相容性和降解性的方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于：包括以下步驟：

（1）?；垡叶嫉闹苽洌涸诘?dú)鈼l件下，取一定量聚乙二醇與甲基丙烯酰氯過夜反應(yīng)，反應(yīng)完成后純化合成的?；垡叶?，然后通過核磁共振檢驗(yàn)，檢驗(yàn)其純度是否大于95%；

（2）?；嚯牡闹苽洌涸诘?dú)鈼l件下，取一定量的GRGDS、MMP-sensitive多肽溶解在無水甲醇中，再加入甲基丙烯酰氯和二甲基氨基吡啶，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完成后加入乙醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得酰基化多肽，將其溶解在去離子水中備用，所述蒸發(fā)溫度為50℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙醇消失為止；

（3）人間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：無菌條件下取健康成人骨髓液，用硫化鉛漂洗并計(jì)數(shù)，將漂洗后的細(xì)胞培養(yǎng)在α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

（4）間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞：取生長狀態(tài)良好的第二代或第三代間充質(zhì)干細(xì)胞傳代，調(diào)整密度至5×10³個(gè)/cm²，待細(xì)胞貼壁將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述步驟（1）中每克聚乙二醇加0.2毫升甲基丙烯酰氯反應(yīng)，純化方法為乙醚析出和過夜凍干，純化后的?；垡叶技兌却笥?5%。

進(jìn)一步的，所述步驟（2）中無水甲醇、甲基丙烯酰氯的量對于GRGDS、MMP-sensitive多肽為過量反應(yīng)；二甲基氨基吡啶的量占總體積比的5%，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)次數(shù)為5次，每次加入5mL甲醇以去除丙烯酸甲酯副產(chǎn)物。

進(jìn)一步的，所述步驟（3）中α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基含體積濃度為20%的胎牛血清和體積濃度為1%的PSG，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，含體積濃度為5%的CO₂，培養(yǎng)48小時(shí)后更換培養(yǎng)液，之后每3天更換一次培養(yǎng)液。

進(jìn)一步的，所述步驟（4）中DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-丙酮酸鈉，0.1mmol/L抗壞血酸磷酸鹽, 1.25mg/mL人血清白蛋白, 10^-7mol/L地塞米松, 1%體積濃度的青霉素-鏈霉素-慶大霉素,10 ng/mL TGF-b1，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，含體積濃度為5%的CO₂，培養(yǎng)48小時(shí)后更換培養(yǎng)液，之后每3天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間2-6周。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明具有工藝先進(jìn)、步驟簡單、操作簡便、可以提升生物材料支架的生物相容性和可降解性、促進(jìn)細(xì)胞繁殖和組織再生。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的?；垡叶己舜殴舱褡V圖；

圖2為間充質(zhì)干細(xì)胞在該生物材料中的成骨分化結(jié)果；

圖3為間充質(zhì)干細(xì)胞在該生物材料中的成軟骨分化的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下由特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)及功效。

一種增強(qiáng)聚乙二醇水凝膠生物相容性和降解性的方法，包括以下步驟：

（1）?；垡叶嫉闹苽洌涸诘?dú)鈼l件下，取一定量聚乙二醇與甲基丙烯酰氯過夜反應(yīng)，反應(yīng)完成后純化合成的酰基化聚乙二醇，每克聚乙二醇加0.2毫升甲基丙烯酰氯反應(yīng)，純化方法為乙醚析出和過夜凍干，然后通過核磁共振檢驗(yàn)，如圖1所示，其檢驗(yàn)純度大于95%，?；潭冉咏?00%；

（2）?；嚯牡闹苽洌涸诘?dú)鈼l件下，取一定量的GRGDS、MMP-sensitive多肽溶解在無水甲醇中，再加入甲基丙烯酰氯和二甲基氨基吡啶，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完成后加入乙醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得?；嚯?，將其溶解在去離子水中備用，蒸發(fā)溫度為50攝氏度，旋蒸至乙醇基本消失為止，無水甲醇、甲基丙烯酰氯的量對于GRGDS、MMP-sensitive多肽為過量反應(yīng)；二甲基氨基吡啶的量占總體積比的5%，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)次數(shù)為5次，每次加入5mL甲醇以去除丙烯酸甲酯副產(chǎn)物；

（3）人間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：無菌條件下取健康成人骨髓液，用硫化鉛漂洗并計(jì)數(shù)，將漂洗后的細(xì)胞培養(yǎng)在α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基含體積濃度為20%的胎牛血清和體積濃度為1%的PSG，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，含體積濃度為5%的CO₂，培養(yǎng)48小時(shí)后更換培養(yǎng)液，之后每3天更換一次培養(yǎng)液；

（4）間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞：取生長狀態(tài)良好的第二代或第三代間充質(zhì)干細(xì)胞傳代，調(diào)整密度至5×10³個(gè)/cm²，待細(xì)胞貼壁將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-丙酮酸鈉，0.1mmol/L抗壞血酸磷酸鹽,1.25mg/mL人血清白蛋白,10^-7mol/L地塞米松,1%體積濃度的青霉素-鏈霉素-慶大霉素,10 ng/mL TGF-b1，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，含體積濃度為5%的CO₂，培養(yǎng)48小時(shí)后更換培養(yǎng)液，之后每3天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間2-6周，如圖2和圖3所示。

本發(fā)明具有工藝先進(jìn)、步驟簡單、操作簡便、可以提升生物材料支架的生物相容性和可降解性、促進(jìn)細(xì)胞繁殖和組織再生。

上述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動即可在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利的權(quán)利保護(hù)范圍內(nèi)。