本發(fā)明屬于生物學(xué)和組織工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法。

背景技術(shù)：

軟骨組織作為一種結(jié)締組織，主要起支撐、保護(hù)、分散應(yīng)力等作用，組織學(xué)上可分為透明軟骨、彈性軟骨、纖維軟骨三類。它們在組織學(xué)上都是只含有軟骨細(xì)胞的單一組織，內(nèi)部無血管，營養(yǎng)主要依靠組織液的滲透。創(chuàng)傷和骨性關(guān)節(jié)炎等疾病引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷和退行性疾病依然是全球范圍內(nèi)威脅健康的主要問題之一。盡管手術(shù)或非手術(shù)措施干預(yù)治療方面進(jìn)展很快，但軟骨損傷的修復(fù)依然是十分棘手的問題。近年來，組織工程的出現(xiàn)為軟骨損傷的修復(fù)提供了一種新的、有效的治療手段。

基于熱噴墨打印技術(shù)的生物打印于2003年被提出并用于生物制造，具有高通量、數(shù)字控制、在二維/三維能高度準(zhǔn)確放置細(xì)胞、生物因子及生物支架材料等優(yōu)點。此技術(shù)已有很多成功的前例。通過生物3d打印并種植人的軟骨細(xì)胞來體外構(gòu)建功能關(guān)節(jié)軟骨是一種極具科學(xué)研究和臨床治療意義的方法。臨床上自體細(xì)胞軟骨修復(fù)的一個主要挑戰(zhàn)就是有限的活體軟骨細(xì)胞資源，迫切需要一種既能在生物打印后有效擴(kuò)增細(xì)胞，同時又能保證外基質(zhì)質(zhì)量的方法。目前最受關(guān)注的就是直接移植富集的自體軟骨細(xì)胞或者間充質(zhì)干細(xì)胞而不用體外擴(kuò)增，并且為了最大限度的發(fā)揮生物打印在3d結(jié)構(gòu)中準(zhǔn)確放置細(xì)胞、生長因子、生物支架材料的優(yōu)點，有限的初始細(xì)胞密度將使放置準(zhǔn)確度最優(yōu)化。

綜上所述，軟骨組織工程領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種新的構(gòu)建功能軟骨的方法，一方面能夠有效降低軟骨細(xì)胞的使用量，另一方面能夠有效促進(jìn)軟骨組織的生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種能夠極大減少細(xì)胞用量并能顯著加速組織生長的促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法，其創(chuàng)新點在于：包括以下步驟：a）取人體關(guān)節(jié)軟骨樣品，剪成軟骨碎片，分別用胰蛋白酶和ⅳ型梭菌膠原酶對軟骨碎片進(jìn)行消化，消化后立即洗滌；b）用含1%(v/v)1×青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺的dmem洗滌釋放出的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，對分離的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng)；c）采用培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯和pbs制備生物墨水；d）使用生物打印機(jī)在生物打印紙上打印構(gòu)建3d水凝膠軟骨組織；e）在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d水凝膠軟骨組織，形成關(guān)節(jié)軟骨組織。

進(jìn)一步的，所述步驟a）中消化過程具體步驟包括：先將軟骨碎片置于0.5mg/ml的胰蛋白酶中，在37℃下消化15min，然后，去除胰蛋白酶，再置于含2mg/ml的ⅳ型梭菌膠原酶、5%（v/v）胎牛血清的dmem中，在37℃下消化12-16h。

進(jìn)一步的，所述步驟b）中洗滌次數(shù)為3次；洗滌后的細(xì)胞活力大于95%；分離的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于t175組織培養(yǎng)瓶內(nèi)，進(jìn)行單層擴(kuò)增培養(yǎng)，接種量為每瓶5百萬個細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10%(v/v)小牛血清、1%(v/v)1×青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺的dmem，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)環(huán)境為5%(v/v)co2的濕潤空氣，培養(yǎng)基每4天更換一次。

進(jìn)一步的，所述步驟c）中制備生物墨水的具體步驟包括：取一定量的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于pbs中形成終濃度為10%(w/v)的溶液，再加入光引發(fā)劑2959使溶液濃度為0.5%(w/v)，將培養(yǎng)好的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞懸浮于溶液中，細(xì)胞密度為8×10⁶cells/ml。

進(jìn)一步的，所述步驟d）中生物打印機(jī)在生物打印紙上打印構(gòu)建3d水凝膠軟骨組織的具體步驟包括：生物打印機(jī)打印前準(zhǔn)備工作；將制備好的生物墨水裝入打印筆并用錫箔紙包??；使用打印軟件設(shè)計目標(biāo)模型及模型尺寸；在生物打印紙上層層打印構(gòu)建3d水凝膠軟骨組織。

進(jìn)一步的，所述生物打印機(jī)打印前準(zhǔn)備工作包括：生物打印機(jī)除菌，將生物打印機(jī)用紫外線下照射2h以上除菌；打印筆清洗，先用70%(v/v)乙醇沖洗消毒，再用無菌水沖洗干凈；安裝長波紫外線燈，將長波紫外線燈安置在打印平臺上方25cm處，用于打印時完成光聚合反應(yīng)。

進(jìn)一步的，所述步驟d）中生物打印紙設(shè)置為直徑4mm的圓柱形模具，其與打印頭的距離為1-2mm；打印時，保持打印平臺上紫外線的強(qiáng)度為4-8mw/cm²。

進(jìn)一步的，所述步驟e）中3d水凝膠軟骨組織在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為4周；培養(yǎng)溫度均為37℃，培養(yǎng)環(huán)境為5%(v/v)co2的濕潤空氣，培養(yǎng)基每3天更換一次；培養(yǎng)第一周，使用成纖維細(xì)胞生長因子/轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)第2-4周，使用轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述成纖維細(xì)胞生長因子/轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基中成纖維細(xì)胞生長因子/轉(zhuǎn)化生長因子的含量為10ng/ml，所述轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化生長因子的含量為10ng/ml。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明提供的促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法工藝先進(jìn)、操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)，能夠有效降低人軟骨細(xì)胞的使用量，使用量減少可達(dá)50%，同時有效促進(jìn)功能軟骨組織的生長，加速組織生長高達(dá)40%，能夠為軟骨組織工程的科學(xué)研究以及軟骨損傷的臨床治療提供了有益的參考，為生物打印技術(shù)的臨床化提供有效的技術(shù)支撐。

2.本發(fā)明中將制備好的生物墨水裝入打印頭后，用錫箔紙包住，有效地避免生物墨水中的細(xì)胞受到紫外線損傷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一種促進(jìn)軟骨組織生產(chǎn)的方法中由3d水凝膠軟骨組織培養(yǎng)形成關(guān)節(jié)軟骨組織過程中第一、二、三、四周內(nèi)ⅰ型膠原的基因表達(dá)情況。

圖2為本發(fā)明一種促進(jìn)軟骨組織生產(chǎn)的方法中由3d水凝膠軟骨組織培養(yǎng)形成關(guān)節(jié)軟骨組織過程中第一、二、三、四周內(nèi)蛋白聚糖的基因表達(dá)情況。

圖3為本發(fā)明一種促進(jìn)軟骨組織生產(chǎn)的方法中由3d水凝膠軟骨組織培養(yǎng)形成關(guān)節(jié)軟骨組織過程中第一、二、三、四周內(nèi)ⅱ型膠原的基因表達(dá)情況。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。

一種促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法，包括以下步驟：

（1）人軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

關(guān)節(jié)軟骨樣品從死亡時間在72小時內(nèi)的尸體上分離獲得。收集得到軟骨樣品剪碎后置于0.5mg/ml胰蛋白酶中在37℃下消化15分鐘，去除胰蛋白酶后將其再置于含2mg/mlⅳ型梭菌膠原酶、5%（v/v）胎牛血清的dmem中，在37℃下消化12-16h。

用1%（v/v）1×青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺補充的dmem洗滌釋放出的人軟骨細(xì)胞三次，洗滌后細(xì)胞活力大于95%。將分離的軟骨細(xì)胞接種于t175組織培養(yǎng)瓶中進(jìn)行單層擴(kuò)增培養(yǎng)，接種量為每瓶5百萬個細(xì)胞。培養(yǎng)基為含10%(v/v)小牛血清、1%(v/v)1×青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺的dmem。培養(yǎng)條件為37℃、5%(v/v)co2的濕潤空氣，培養(yǎng)基每四天更換一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合度時即可用來制備生物墨水。

（2）制備生物墨水

取適量聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶解于pbs中，溶液終濃度為10%(w/v)，添加光引發(fā)劑2959使溶液濃度為0.5%(w/v)，將培養(yǎng)好的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞懸浮于0.5%(w/v)溶液中，溶液中細(xì)胞密度為8×10⁶cells/ml。

（3）生物打印體外構(gòu)建3d水凝膠軟骨組織

打印前，將生物打印機(jī)置于紫外線下照射至少2小時除菌；將打印筆先用70%(v/v)乙醇沖洗三次再用無菌水沖洗干凈；打印平臺上方25cm處放置一個長波紫外線燈，用于在打印的同時完成光聚合反應(yīng)；打印時保持平臺上的紫外線強(qiáng)度為4-8mw/cm2。將配制好的生物墨水裝入打印筆并用錫箔紙包住，避免細(xì)胞受到紫外線損傷。生物打印紙為直徑4mm的圓柱形模具，其與打印頭的距離為1-2mm。使用adobephotoshop軟件設(shè)計目標(biāo)模型及其尺寸，通過層層打印構(gòu)建3d水凝膠軟骨組織。

（4）關(guān)節(jié)軟骨組織的培養(yǎng)

將打印好的3d水凝膠軟骨組織置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37℃，培養(yǎng)環(huán)境為5%（v/v）co2的濕潤空氣，培養(yǎng)基每3天更換一次,形成軟骨組織。其中，培養(yǎng)第一周使用10ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子/轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基，隨后的第2-4周使用10ng/ml得轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)軟骨形成培養(yǎng)基。成纖維細(xì)胞生長因子/轉(zhuǎn)化生長因子補充的its+培養(yǎng)基是在its+培養(yǎng)基中增加成纖維細(xì)胞成長因子和轉(zhuǎn)化生長因子混合物作為補充。

本發(fā)明提供的促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織生長的方法工藝先進(jìn)、操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)，能夠有效降低人軟骨細(xì)胞的使用量，使用量減少可達(dá)50%，同時有效促進(jìn)功能軟骨組織的生長，加速組織生長高達(dá)40%，能夠為軟骨組織工程的科學(xué)研究以及軟骨損傷的臨床治療提供了有益的參考，為生物打印技術(shù)的臨床化提供有效的技術(shù)支撐。

為了進(jìn)一步了解本發(fā)明方法的效果，對培養(yǎng)出來的軟骨組織進(jìn)行了相應(yīng)的鑒定。

（1）實時定量pcr分析軟骨細(xì)胞基因表達(dá)

在關(guān)節(jié)軟骨組織培養(yǎng)過程的第一、二、三、四周分析水凝膠中細(xì)胞的基因表達(dá)。分析方法為將培養(yǎng)出來的軟骨組織放入液氮中冷凍后破碎，將破碎后的粉末轉(zhuǎn)移到離心管中，向離心管中加入適量rna裂解緩沖液，室溫下消化15分鐘；然后將形成的溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，以12000g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘，在上清液里提取rna進(jìn)行純化。使用型號為nanodropnd-1000的紫外分光光度計測定總rna含量及純度。使用高容量的cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒將分離的總rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cdna，使用taqman基因表達(dá)檢測探針利用rt-pcr檢測人ⅰ型膠原、ⅱ型膠原和蛋白聚糖的基因表達(dá)，如圖1、圖2和圖3所示。

（2）生化檢測

在不同的時間節(jié)點即培養(yǎng)的1、2、3、4周分別取培養(yǎng)出來的軟骨組織，并將其凍干48小時，之后用手術(shù)刀將凍干后的軟骨組織切成薄片并分別置于木瓜酶和胃蛋白酶中消化。每個樣品使用1毫升濃度為125微克/毫升的木瓜酶溶液在60℃下抽提16h得到總糖胺聚糖，每個樣品使用1毫升胃蛋白酶溶液（含100微克/毫升胃蛋白酶）于4℃下消化6天得到ⅱ型膠原酶。每個樣品的總糖胺聚糖、ⅱ型膠原含量與dna含量、干重的比值用以評估植入的人軟骨細(xì)胞的生物合成活性，每個樣品的dna含量與干重的比值用以評估培養(yǎng)過程中的細(xì)胞增殖。

(3)組織學(xué)活檢

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)檢測方法，將培養(yǎng)出來的軟骨組織置于10％(v/v)福爾馬林中固定過夜，然后將其取出轉(zhuǎn)移至pbs中直至包埋入石蠟中，之后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為6微米。最后用番紅o/固綠對上述制備的切片進(jìn)行染色，觀察樣品中的細(xì)胞及蛋白聚糖。

上述實施例只是本發(fā)明的較佳實施例，并不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動即可在上述實施例的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利的權(quán)利保護(hù)范圍內(nèi)。