本發(fā)明涉及一種真核表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)，尤其涉及一種能在真核細(xì)胞中完整表達(dá)的改造的DH5α BirA基因及其構(gòu)建方法，以及改造后的BirAG基因在植物蛋白生物素化中的應(yīng)用和在篩選植物互作蛋白中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大腸桿菌存在著生物素連接酶BirA，它能將靶標(biāo)蛋白生物素化，使其帶上生物素標(biāo)記。BirA主要是利用了biotin-N-hydroxysuccinimide或類似的一些?；?，通過生物素依靠的羧化酶和磷酸戊糖途徑中的脫羧酶(Chapman-Smith et al.,1999)，對(duì)蛋白的氨基酸基團(tuán)進(jìn)行修飾。該酶十分專一，在大腸桿菌中，只能生物素化幾個(gè)特定的蛋白質(zhì)。

研究人員發(fā)現(xiàn)，如果將BirA的第118位的(R)突變成甘氨酸(G)，這種BirA突變體(BirA*)的親和能力會(huì)比野生型的BirA低很多(Kwon et al.,2000)，導(dǎo)致的結(jié)果是BirA*可以生物素化在空間上與之靠近的蛋白，尤其是相互作用的蛋白(Choi-Rhee et al.,2004；Cronan,2005)，可以利用BirA*這一特性來檢測(cè)生物體中蛋白互作的情況。目前該技術(shù)已被成功應(yīng)用于原核生物、哺乳動(dòng)物、人等細(xì)胞中(Gupta GD et al.,2015；Firat-Karalar EN et al.,2015；Batsios P et al.,2016)。

以大腸桿菌DH5α菌種為材料，克隆了DH5α BirA片段，并構(gòu)建了DH5αBirA*片段，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DH5α BirA*在高等生物中的表達(dá)是存在可變剪接現(xiàn)象的，且剪切區(qū)域位于BPL_lipA/B蛋白結(jié)構(gòu)域，這對(duì)DH5α BirA*在細(xì)胞中發(fā)揮作用造成影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，通過基因工程技術(shù)，對(duì)野生的DH5α BirA基因或DH5αBirA*基因進(jìn)行改造，使之能在真核細(xì)胞中完整表達(dá)，并確定改造后的突變體可以在植物中工作，并應(yīng)于互作蛋白的篩選。

為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

首先，提供一種能在植物細(xì)胞中完整表達(dá)的改造的DH5α BirA基因，所述改造的DH5α BirA基因與野生的DH5α BirA基因的差異在于編碼第118位氨基酸的序列以及剪接識(shí)別位點(diǎn)的AG區(qū)域。

優(yōu)選地，所述改造的DH5α BirA基因能在水稻細(xì)胞中完整表達(dá)。

更優(yōu)地，所述改造的DH5α BirA基因序列為SEQ ID No.1所示。

其次，提供一種重組真核表達(dá)載體，其包含如前所述的改造的DH5αBirA基因。

可選擇地，所述真核表達(dá)載體為pCAMBIA1390載體、pUbi載體或pUbi-EGFP載體。

再次，提供一種如前所述的重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：

獲得野生的DH5α BirA基因；

對(duì)所述野生的DH5α BirA基因的可變剪接的剪切位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，以獲得能完整表達(dá)的改造的DH5α BirA基因。

優(yōu)選地，對(duì)所述野生的DH5α BirA基因的可變剪接的剪切位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變之前，對(duì)所述野生的DH5α BirA基因進(jìn)行點(diǎn)突變以獲得突變的DH5αBirA*基因。

具體地，對(duì)所述野生的DH5α BirA基因第352位堿基進(jìn)行點(diǎn)突變使所編碼的蛋白質(zhì)的第118為甘氨酸，以獲得突變的DH5α BirA*基因。

進(jìn)一步地，對(duì)所述野生的DH5α BirA基因進(jìn)行剪切位點(diǎn)的點(diǎn)突變和/或第352位堿基的點(diǎn)突變之后，將已進(jìn)行點(diǎn)突變的片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，與未進(jìn)行點(diǎn)突變的擴(kuò)增片段進(jìn)行連接，以獲得所述改造的DH5α BirA基因。

更進(jìn)一步地，將所述方法改造的BirAG基因與增強(qiáng)啟動(dòng)子的基因序列、待研究的蛋白的基因序列進(jìn)行連接，以形成所述待研究的蛋白質(zhì)的蛋白互作研究載體。

還提供一種植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)互作的檢測(cè)方法，其采用如前所述的能在植物細(xì)胞中完整表達(dá)的改造的DH5α BirA基因，或采用如前所述的重組真核表達(dá)載體。

可選擇地，提供一種植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)互作的檢測(cè)方法，其所采用的重組真核表達(dá)載體采用如前所述的重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法所構(gòu)建。

結(jié)果表明BirAG具有生物素化植物蛋白的能力，并能夠生物素化與BirAG融合的目的蛋白相互作用的蛋白。以上結(jié)果表明所改造的BirAG具有篩選目的蛋白互作蛋白的能力。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明的能在植物細(xì)胞中完整表達(dá)的改造的DH5α BirA基因及其構(gòu)建方法，對(duì)野生的DH5α BirA基因或DH5α BirA*基因的剪切位點(diǎn)進(jìn)行了改造，并對(duì)剪切位點(diǎn)附近的部分密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使之更符合真核生物中的表達(dá)模式，使改造后的BirAG基因可以在植物細(xì)胞中表達(dá)，并具有生物素化一系列植物細(xì)胞內(nèi)源蛋白的能力。

(2)本發(fā)明的能在植物細(xì)胞中完整表達(dá)的改造的BirAG基因及其構(gòu)建方法，將所述改造后的BirAG基因與真核表達(dá)載體進(jìn)行重組，可以在植物細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)，能顯著提高受體細(xì)胞生物素化蛋白數(shù)量，BirAG與目的蛋白融合后，可以生物素化與目的蛋白相互作用的蛋白。因此所改造的BirAG可以用于互作蛋白的篩選。

附圖說明

圖1為野生型DH5α BirA、DH5α BirA*突變體、改造的BirAG突變體的序列的比較。

圖2為p35S::DH5α BirA*和pUbi::DH5α BirA*瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后RT-PCR擴(kuò)增BirA*片段電泳圖。

圖3為擴(kuò)增出的兩個(gè)條帶分別測(cè)序的結(jié)果。

圖4為改造后的p35S::BirAG和pUbi::BirAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后RT-PCR擴(kuò)增BirAG片段電泳圖。

圖5為p35S::BirAG::EGFP和pUbi::BirAG::EGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

圖6為p35S::BirAG和pUbi::BirAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后提取總蛋白，以HRP-Streptavidin為抗體的Western-blot結(jié)果圖。

圖7為WT和pUbi::BirAG::OsFD2瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后鑒定到的生物素化蛋白的比較。

圖8為pUbi::BirAG::OsFD2瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后所鑒定到的蛋白與WT組進(jìn)行比較，隨機(jī)挑選出10個(gè)pUbi::BirAG::OsFD2組中鑒定到的特有的蛋白進(jìn)行BiFC驗(yàn)證的結(jié)果。其中鑒定到的三個(gè)與OsFD2有互作的蛋白的BiFC結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

(一)DH5α BirA*的獲得。

為構(gòu)建DH5α BirA*，我們以大腸桿菌DH5α為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了DH5α BirA片段，并采用重疊延伸法構(gòu)建DH5α BirA*突變體(突變了第352位堿基，C→G)，分別構(gòu)建了兩個(gè)載體，為p35S::DH5α BirA*、pUbi::DH5αBirA*。

具體步驟如下：

(1)從大腸桿菌中獲得DH5α BirA片段

DH5α BirA(SEQ ID No.2)的來源材料為大腸桿菌DH5α。通過PCR的方式，以BirAFw(上游引物，見SEQ ID No.3)和BirARe(下游引物，見SEQ ID No.4)為引物，直接將大腸桿菌菌落加入PCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增，聚合酶Blend Taq由TOYOBO公司提供，具體PCR體系如下：

所得產(chǎn)物與T載體相連接，連接所用緩沖液Solution I由TAKARA公司提供，具體連接體系如下：

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體過程為5μl連接產(chǎn)物加入解凍的大腸桿菌JM109感受態(tài)中，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，立即冰浴5分鐘以上，加入800μl LB培養(yǎng)液后在37℃培養(yǎng)箱以160rpm/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)45～60分鐘，將菌液涂布于含有抗性的(T載體為氨芐抗性)抗性板上，37℃倒置培養(yǎng)12～16小時(shí)。挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR體系與上述PCR體系相同。最后通過測(cè)序的方式獲得正確的帶DH5α BirA片段載體的大腸桿菌。

(2)DH5α BirA*片段的獲得。

對(duì)測(cè)序正確的含DH5α BirA載體的工程菌，采用重疊延伸法構(gòu)建DH5αBirA*片段(突變了第352位堿基，C→G)，具體實(shí)施方法為設(shè)計(jì)兩個(gè)點(diǎn)突變引物BirAMF(上游引物，見SEQ ID No.5)和BirAMR(下游引物，見SEQ ID No.6)，這兩個(gè)引物與BirA的第352位堿基上都為錯(cuò)配。通過擴(kuò)增BirAFw-BirAMR和BirAMF-BirARe兩個(gè)片段(PCR體系與上述PCR體系相同)，利用Axygen公司的膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，后將兩樣品等量混合，稀釋100倍后以BirAFw和BirARe為引物進(jìn)行擴(kuò)增(PCR體系與上述PCR體系相同)，將產(chǎn)物與T載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)并測(cè)序(連接與轉(zhuǎn)化體系與上述體系相同)，獲得正確的帶DH5α BirA*的載體。

(二)DH5α BirA*突變體在真核生物中存在可變剪接。

以水稻原生質(zhì)體為材料，對(duì)DH5α BirA*在細(xì)胞中的表達(dá)模式進(jìn)行了檢測(cè)。將p35S::DH5α BirA*、pUbi::DH5α BirA*載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，提取原生質(zhì)體RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增DH5α BirA*片段，參考圖2，電泳結(jié)果顯示能擴(kuò)增出兩條帶。分別回收這兩條帶進(jìn)行測(cè)序，參考圖3，結(jié)果顯示水稻對(duì)DH5α BirA*片段進(jìn)行了剪接，剪切序列長(zhǎng)165bp，該剪接情況為常見真核生物剪接模式(exon/GU-intron-AG/exon)，所剪切區(qū)域位于BPL_lipA/B蛋白結(jié)構(gòu)域。

(三)改造突變體BirAG在真核生物中能完整表達(dá)。

為防止DH5α BirA*在真核生物中發(fā)生可變剪接，對(duì)所述剪切區(qū)域的位點(diǎn)進(jìn)行了改造，并對(duì)剪切位點(diǎn)附近的部分密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使之更符合真核生物中的表達(dá)模式。由于在可變剪接的剪切位點(diǎn)附近后SphI酶切位點(diǎn)，因此利用了這個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造。

具體實(shí)施方法為利用重疊延伸法將DH5α BirA*改造成BirAG突變體，設(shè)計(jì)BirASphI引物(見SEQ ID No.7)，擴(kuò)增BirAFw-BirASphI片段，同時(shí)利用SphI和BglII酶切DH5α BirA*載體，將BirAFw-BirASphI片段與該載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取單菌落進(jìn)行檢測(cè)并測(cè)序，獲得正確的帶改造的DH5α BirA基因的載體，即帶BirAG基因的重組載體。

進(jìn)一步地，構(gòu)建了四個(gè)載體p35S::BirAG、p35S::BirAG::EGFP、pUbi::BirAG、pUbi::BirAG::EGFP，將p35S::BirAG、pUbi::BirAG載體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增BirAG片段，參考圖4，電泳結(jié)果顯示兩個(gè)樣品只擴(kuò)增出1條帶，表明BirAG在水稻中不發(fā)生剪接。

更進(jìn)一步地，將p35S::BirAG::EGFP、pUbi::BirAG::EGFP載體轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，觀察它們的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，參考圖5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體均能正確表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物定位于整個(gè)細(xì)胞。

參考圖1，右邊的箭頭處為第352位堿基突變位點(diǎn)，突變體DH5α BirA*和BirAG的核酸均為G，矩形框內(nèi)為BirAG改造序列，其中左邊箭頭處為剪切的AG識(shí)別位點(diǎn)，BirAG中為改造為G堿基，另外剪切位點(diǎn)附近的堿基也進(jìn)行了優(yōu)化，使之更適合于真核細(xì)胞中表達(dá)，本實(shí)施例中，針對(duì)水稻細(xì)胞進(jìn)行改造。

(四)真核表達(dá)載體的構(gòu)建

為驗(yàn)證BirAG是否可以在細(xì)胞中發(fā)揮作用，生物素化水稻中的蛋白，以水稻為材料，將p35S::BirAG、pUbi::BirAG載體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，提取蛋白，并以HRP-Streptavidin為抗體，利用western-blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

為確定融合BirAG的待研究蛋白可以生物素化與其空間上靠近的蛋白，我們以水稻FD2蛋白為研究對(duì)象，構(gòu)建了pUbi::BirAG::OsFD2載體，并將其轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，對(duì)照組轉(zhuǎn)入的為ddH₂O。提取原生質(zhì)體蛋白后通過Streptavidin磁珠將生物素化的蛋白進(jìn)行富集，最后利用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白測(cè)序。

具體步驟如下：

(1)將擴(kuò)增出來的DH5α BirA*片段和BirAG片段都與pCAMBIA1390載體相連。由于所述設(shè)計(jì)的BirAFw和BirARe分別帶有BglII和BamHI酶切位點(diǎn)，因此具體實(shí)施方式是將上述構(gòu)建正確的帶DH5α BirA*和BirAG載體均用BglII和BamHI酶切3小時(shí)后并用Axygen膠回收試劑盒進(jìn)行回收目的片段(1000bp左右)，將pCAMBIA1390載體用BamHI酶切3小時(shí)后65℃熱變性處理15分鐘，分別與DH5α BirA*片段和BirAG片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定，測(cè)序。具體方法同上，載體酶切體系如下，酶為TAKARA公司提供：

片段酶切體系如下：

(2)pUbi::BirAG::OsFD2載體的構(gòu)建方法為：從植物總RNA中克隆OsFD2的CDS片段，所用引物為OsFD2Fw(上游引物，見SEQ ID No.8)和OsFD2Re(下游引物，見SEQ ID No.9)，與構(gòu)建好的pUbi::BirAG載體均用BamHI和EcoRI酶切3小時(shí)后，將它們均用65℃熱變性處理15分鐘，最后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、鑒定及測(cè)序，所用體系同上。

(3)pUbi::DH5α BirA*::EGFP和pUbi::BirAG::EGFP載體的構(gòu)建方法為：從植物總RNA中克隆OsFD2的CDS片段，所用引物為OsFD2Fw和OsFD2Re(SEQ ID No.8&No.9)，與構(gòu)建好的pUbi::BirAG載體均用BamHI和EcoRI酶切3小時(shí)后，將它們均用65℃熱變性處理15分鐘，最后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、鑒定及測(cè)序，所用體系同上。

(五)提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄

RNA的提取方法：采用OMEGA Plant RNA Kit試劑盒，提取總RNA。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)取水稻材料100mg，液氮中迅速研磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)完全，將粉末轉(zhuǎn)移到含有500μl Buffer RB/β-巰基乙醇的1.5ml滅菌離心管，劇烈振蕩；

(2)14000×g室溫離心5min；

(3)轉(zhuǎn)移上清至gDNA Filter Column置于2ml離心管中，10000×g離心2min，取濾液。然后加入0.5倍體積的無水乙醇，上下顛倒離心管，混勻；

(4)把步驟3全部溶液轉(zhuǎn)移至HiBind RNA Mini Column置于2ml離心管中，10000×g離心1min，倒掉下清，把柱子放回離心管中。

(5)加入配好的50μl DNaseI反應(yīng)液(39μlRNase-free水+5μl DNaseI buffer+6μl DNaseI)至柱子內(nèi)膜中央。室溫反應(yīng)5min；

(6)加入400μl溶液RWC，室溫再放置10min，10000×g離心1min，棄廢液；

(7)加入500μl溶液RNA Washing BufferII，10000×g離心1min，棄廢液；

(8)重復(fù)步驟七洗滌一次；

(9)小心取出柱子，棄去收集管廢液，將柱子放回同一根柱子中，10000×g離心1min；

(10)小心取出柱子，放入1.5ml的RNase-free離心管中，在柱子內(nèi)膜中央小心加入50μl DEPC水，50℃放置2min；

(11)10000×g室溫離心1min，收集RNA樣品；

(12)取2μl樣品2％瓊脂糖凝膠電泳，120V恒壓5min，紫外燈下觀察。樣品保存于-80℃；

逆轉(zhuǎn)錄及cDNA合成，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)取1μg水稻總RNA，加入1μl的50μM Oligo(dT)18，補(bǔ)RNase-free水至6μl；

(2)70℃保溫10min后迅速放置冰上急冷2min以上；

在上述管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

(4)42℃保溫1h，以隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物時(shí)應(yīng)先進(jìn)行30℃，10min。然后再在42℃保溫1h；

(5)70℃保溫15min后冰上冷卻，cDNA產(chǎn)物-20℃保存。

(六)原生質(zhì)體的制備、轉(zhuǎn)化及亞細(xì)胞定位觀察

獲得原生質(zhì)體所用水稻種子均去殼后進(jìn)行消毒處理，具體消毒方式為75％酒精浸泡10秒，用無菌水清洗1次，用含Tween-20的2.5％NaClO清洗30分鐘，再用無菌水清洗5次以上，最后將每20顆種子播種于1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)8—12天。

原生質(zhì)體制備的方法為：取幼苗30-40株，放在一張干凈的A4白紙上，用刀片切去葉部和根部，保留莖段并切成0.5mm細(xì)絲，迅速轉(zhuǎn)移至20ml0.6M甘露醇中，黑暗放置10分鐘。去掉甘露醇，加入20mL酶解液，置搖床70rpm/min，黑暗中酶解5h。向錐形瓶中加入20ml W5，劇烈晃動(dòng)10秒，將原生質(zhì)體過濾到離心管中，用W5洗3-5次，用1ml MMG緩沖液，懸浮原生質(zhì)體，冰浴30分鐘。

轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法為：將MMG溶液中的原生質(zhì)體調(diào)至終濃度約為2x10⁶個(gè)/mL，將要轉(zhuǎn)化的處理標(biāo)記好2ml離心管，每管加入100μl原生質(zhì)體和5-10μg質(zhì)粒，輕輕混勻，靜置5min。向每管緩慢加入110μl 40％的PEG-Ca²⁺溶液，輕輕混勻，26℃孵育15min，緩慢加入440μl緩沖液W5終止反應(yīng)，輕輕顛倒離心管混勻。1500rpm離心3min，吸去上清，加入500μl緩沖液WI，輕輕混勻后轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板，26℃培養(yǎng)6～16h。

取10μl培養(yǎng)的細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下在激發(fā)光下進(jìn)行觀察。

上述方法所需溶液配方為：

(1)40mM MES：0.853g MES溶于100mL雙蒸水中，KOH調(diào)pH 5.7，過濾除菌。

(2)1M甘露醇：36.44g加熱溶解于200mL雙蒸水中，高壓滅菌。

(3)W5緩沖液

(4)MMG

(5)WI緩沖液

(6)酶解液(現(xiàn)配現(xiàn)用)

(7)40％PEG(現(xiàn)配現(xiàn)用)

(七)總蛋白提取

提取蛋白的方法如下：

(1)在液氮中研磨樣品，加入600ul蛋白提取液，振蕩混勻。

(2)超聲處理2分鐘(超聲2秒，間隙5秒)，功率20％。

(3)加入12ul Triton X-100，4℃放置10分鐘。

(4)加入600ul 50mM Tris-HCl(pH 7.4)，振蕩混勻，超聲處理2分鐘(超聲2秒，間隙5秒)，功率20％。

(5)4℃離心13200rpm 10分鐘，取上清于新的1.5mL離心管，置于-20℃保存。

蛋白提取液配方如下：

(八)SDS-PAGE電泳及western-blot

SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)將玻璃板，樣品梳等用洗滌劑洗凈，用ddH₂0沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干。

(2)參照說明書安裝玻璃板。

(3)按如下體系配置12％的分離膠，按順序依次混勻各成分，加入TEMED后迅速灌至兩塊玻璃板中間的間隙中。

(4)給濃縮膠留出足夠的空間(離玻璃板上沿2cm左右)，在上層加滿水壓平膠面，室溫放置。

(5)聚合完成(約30min)，倒掉上層的水，用吸水紙吸盡邊緣的水。

(6)按如下體系配置4％的濃縮膠，按順序依次混勻各成分，加入TEMED后，將混合液加入分離膠上層，插入梳子，室溫放置30-40min，待膠完全凝固。

(7)將凝膠固定在電泳裝置上，在內(nèi)外槽中加入1×Tris-Gly電泳緩沖液。

(8)將等體積的樣品和2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，95℃水浴加熱5min使蛋白變性，10000rpm離心3min,取20μl上樣；

(9)80V電泳30min，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠，120V繼續(xù)電泳至染料前沿即將跑出凝膠。

轉(zhuǎn)膜步驟如下：

(1)將膠從玻璃板上取下來，在去離子水中漂洗一下，去掉膠的一角作為記號(hào)。

(2)將膠放在轉(zhuǎn)移換成液中浸泡30min。

(3)剪一塊合適大小的PVDF膜，同時(shí)在一個(gè)角上做好標(biāo)記，放入純甲醇中浸泡15s,然后放去轉(zhuǎn)移緩沖液中至少5min。將海綿墊，濾紙等轉(zhuǎn)膜工具也放入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。

(4)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜“三明治”：按照海綿墊-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿墊的順序組裝“三明治”(膜放在靠正極一側(cè)，層與層之間不能留有氣泡)。

(5)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，4度60V轉(zhuǎn)移2h

免疫反應(yīng)步驟如下：

(1)轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜取下來，放入1×TBST中浸泡一下，然后將膜放入TBST+Milk，室溫下?lián)u床上搖動(dòng)封閉處理30min。

(2)倒掉封閉液，用1×TBST將膜洗2-3遍，每遍5-8min，將抗體用TBST+Milk稀釋至適當(dāng)濃度備用。

(3)倒掉TBST，加入抗體溶液室溫孵育1h。

(4)倒掉抗體溶液，用用1×TBST將膜洗2-3遍，每遍5-8min，然后進(jìn)行化學(xué)放光反應(yīng)。

底物顯色步驟如下：

采用的是BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)，BeyoECL Plus工作液的配制：等體積混合適量BeyoECL Plus A液和B液，室溫放置備用。工作液宜在臨檢測(cè)前配制。

(1)用平頭鑷將膜取出，用吸水紙略吸去過多的液體(切勿接觸膜的蛋白面)，然后置于一潔凈保鮮膜上。

(2)根據(jù)膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml BeyoECL Plus工作液的比例，滴加BeyoECL Plus工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1-2分鐘。

(3)取膜，棄BeyoECL Plus工作液，用吸水紙略吸去過多的液體。將膜放在兩片保鮮膜中間，隨后進(jìn)行壓片檢測(cè)。

(4)壓片檢測(cè)：將膜固定于片夾內(nèi)。暗室內(nèi)壓片1分鐘，立即顯影定影，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間。

上述方法所需溶液配方為：

(1)30％Acr/Bis混合溶液(100ml)：稱取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用溫?zé)岬娜ルx子水溶解定容到100ml，過濾，4攝氏度避光保存一個(gè)月。

(2)1.5M Tris-HCl(pH 8.8):稱取18.17g Tris堿，加去離子水充分?jǐn)嚢枞芙?，擁抱過濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，將溶液定容至100ml,高溫高壓滅菌后，室溫保存。

(3)1.0M Tris-HCl(Ph 6.8):稱取12.114g Tris堿，加去離子水充分?jǐn)嚢枞芙猓瑩肀н^濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，將溶液定容至100ml,高溫高壓滅菌后，室溫保存。

(4)10％SDS：稱取10g SDS,用蒸餾水水浴加熱至50℃溶解，定容到100ml,室溫保存。

(5)10％AP:稱取過硫酸銨0.1g,加入1ml去離子水溶解，貯存于4℃(有效期為2周左右)。

(6)5×Tris-Gly電泳緩沖液(室溫保存)

(7)2×SDS凝膠加樣緩沖液：Tris-HCl pH6.8(100mM)；SDS(4％)；溴酚蘭(0.2％)；甘油(20％)；β-巰基乙醇(200mM)，不含硫代試劑的加樣Buffer可在室溫保存。β-巰基乙醇臨用前加入。

(8)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液

(9)蛋白脫色液

(10)膜轉(zhuǎn)移緩沖液：分別稱取Tris堿3.02g,Glycine 14.4g,加入去離子水?dāng)嚢枞芙?，定容?00ml后，加入200ml甲醇。

(11)10×Tris-Buffered saline

(12)1×TBST Buffer

(13)1×TBST Buffer+5％Milk

(九)質(zhì)譜鑒定蛋白

(1)磁珠預(yù)處理：

取600ul鏈霉親和素磁珠(sphero公司,SVM-30-10)于磁力架上，吸出上清，加入600ul緩沖液Q，超聲處理2分鐘(超聲時(shí)間2秒，間隔5秒)，功率20％。再用緩沖液Q清洗磁珠2次。

(2)樣品與磁珠混合：將樣品加入磁珠中，于旋轉(zhuǎn)器上4℃旋轉(zhuǎn)過夜。

(3)將樣品置于磁力架上，吸出上清，磁珠隨后分別用緩沖液W1清洗2次，緩沖液W2清洗1次，W3清洗1次，緩沖液W4清洗2次，50mM NH₄HCO₃(電泳純，pH8.3)清洗6次。加入20ul溶解于電泳純的NH₄HCO₃的0.2ug/ul的TPCK胰蛋白酶，置于37℃16小時(shí)，吸出上清于新的離心管中，真空濃縮儀干燥，干粉進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

上述方法所需溶液配方為：

(1)緩沖液Q

(2)緩沖液W1

(3)緩沖液W2成分

(4)緩沖液W3成分

(5)緩沖液W4成分

參考圖6，WT為不加質(zhì)粒進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，BirAG為加了帶有BirAG片段的質(zhì)粒進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。p35S表示35S啟動(dòng)子，pUbi表示Ubi啟動(dòng)子。p35S::BirAG和pUbi::BirAG樣品的條帶數(shù)均多于野生型。結(jié)果顯示BirAG能明顯提升水稻蛋白生物素化的情況。

參考圖7，WT為不加質(zhì)粒進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，pUbi::BirAG::OsFD2為加了帶有BirAG::OsFD2片段的質(zhì)粒進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，提取培養(yǎng)過夜的原生質(zhì)體的總蛋白，利用鏈霉親和素磁珠吸附被生物素標(biāo)記的蛋白，并通過蛋白質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)pUbi::BirAG::OsFD2組與ddH₂O組相比生物素化蛋白數(shù)目明顯增多，也表明BirAG能顯著提高水稻生物素化蛋白數(shù)量。(十)BiFC鑒定蛋白互作事件

(1)將兩個(gè)待檢測(cè)的蛋白分別與BiFC載體的N端和C端融合，構(gòu)建N端載體和C端載體。酶切和連接的體系同上述。

(2)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子鑒定，測(cè)序，并進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)和質(zhì)粒提取。實(shí)驗(yàn)方法同上述。

(3)制備原生質(zhì)體，并將N端載體和C端載體轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)。制備及轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體方法同上述。

(4)將培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，在共聚焦顯微鏡觀察原生質(zhì)體中的發(fā)光情況。

參考圖8，BF為明場(chǎng)，YFP為黃色熒光通道，Chl為葉綠體自發(fā)熒光，Merge以上三圖的融合。結(jié)果表明，在隨機(jī)挑選的10個(gè)pUbi::BirAG::OsFD2組特有的蛋白中，Q5VMJ3、Q5JMX3、Q0JLX8為鑒定到的與OsFD2有相互作用的蛋白。以上結(jié)果表明BirAG融合目的蛋白后可以應(yīng)用于植物細(xì)胞中，進(jìn)行蛋白互作的鑒定。

綜上所述，本發(fā)明能在植物細(xì)胞中完整表達(dá)的改造的DH5α BirA基因能在植物細(xì)胞中完整表達(dá)，所述改造的BirAG基因及其構(gòu)建方法為檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)實(shí)現(xiàn)條件。此外，本發(fā)明表明改造的DH5α BirA可以在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用，可用于植物中互作蛋白的鑒定，

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但并不僅僅受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。