本發(fā)明涉及膀胱癌診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于敲低與膀胱癌相關(guān)的基因的核苷酸序列及含該序列的試劑盒和藥物。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一類(lèi)本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，它可在多層面上(如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA最初被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是一種“噪音”，不具有生物學(xué)功能。然而，近年來(lái)的研究表面，lncRNA參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，其調(diào)控作用正在被越來(lái)越多的人研究。近年來(lái)研究表明lncRNA有助于腫瘤的早期診斷、預(yù)后的判斷并且可以作為分子靶向治療的目標(biāo)基因，因此具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)可以從時(shí)間上調(diào)控基因的表達(dá)，是基因功能研究的重要工具之一，其中，四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的一種，并且在合成生物學(xué)的發(fā)展歷程中作為一種工具被廣泛應(yīng)用。由于四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)可以從時(shí)間上控制基因的表達(dá)，為膀胱癌的診斷與治療帶來(lái)了新的思路。

TUC338(Gene ID:102157401，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝TUC338)在肝癌、舌癌等癌中起著重要的作用，但是該基因與膀胱癌的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)TUC338基因與膀胱癌相關(guān)，因此本發(fā)明提供一種用于敲低與膀胱癌相關(guān)的基因的核苷酸序列以及試劑盒和藥物。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于敲低與膀胱癌相關(guān)的基因的核苷酸序列，該核苷酸序列是根據(jù)人TUC338基因設(shè)計(jì)的RNA干擾序列。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了TUC338基因與膀胱癌相關(guān)，因此根據(jù)RNA干擾的原理，可以設(shè)計(jì)針對(duì)該基因的RNA干擾序列，用于敲低該基因，以進(jìn)一步用于膀胱癌的治療。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。使用SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列進(jìn)行RNA干擾，能夠顯著地敲低人TUC338基因。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，用于敲低人TUC338基因的核苷酸序列不限于SEQ ID NO:1，然而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列用于敲低人TUC338基因具有顯著優(yōu)異的效果，因此是優(yōu)選的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列是siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA)。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列是shRNA(short hairpin RNA，短發(fā)夾RNA)。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列的載體是四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)質(zhì)粒psi-LVRInU6TGP。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于敲低與膀胱癌相關(guān)的基因的試劑盒，該試劑盒包括核苷酸序列，上述核苷酸序列是根據(jù)人TUC338基因設(shè)計(jì)的RNA干擾序列。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列是siRNA或shRNA。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種用于敲低與膀胱癌相關(guān)的基因的藥物，該藥物包括核苷酸序列，上述核苷酸序列是根據(jù)人TUC338基因設(shè)計(jì)的RNA干擾序列。

進(jìn)一步地，上述核苷酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

經(jīng)研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TUC338基因與膀胱癌相關(guān)，因此針對(duì)TUC338基因，可以設(shè)計(jì)用于RNA干擾TUC338基因的核苷酸序列，例如siRNA或shRNA，進(jìn)行對(duì)TUC338基因的敲低，并且進(jìn)一步地實(shí)現(xiàn)治療膀胱癌的目的。

附圖說(shuō)明

圖1：TUC338在膀胱癌組織中的表達(dá)水平。使用定量PCR方法檢測(cè)膀胱癌組織中TUC338的相對(duì)集中度。

圖2：TUC338在細(xì)胞系中的表達(dá)水平。與SV-HUC-1細(xì)胞系對(duì)比，TUC338在T24(A)及5637(B)均顯著性高表達(dá)(*P<0.01)。

圖3：si-TUC338敲減TUC338的表達(dá)量。與si-NC組對(duì)比，TUC338表達(dá)水平在si-TUC338組中表達(dá)水平顯著性下降(P<0.01)。

圖4：四環(huán)素誘導(dǎo)TUC338 shRNA敲減TUC338的表達(dá)量。加入不同濃度強(qiáng)力霉素(DOX)后四環(huán)素誘導(dǎo)組的TUC338表達(dá)水平下降；1μg/ml強(qiáng)力霉素能夠最大程度的抑制TUC338的表達(dá)水平(P<0.01)。

圖5：CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒抑制細(xì)胞增殖的結(jié)果。與si-NC組對(duì)比，在si-TUC338組中，T24細(xì)胞(圖A)及5637細(xì)胞(圖B)的增殖被顯著性抑制(P<0.01)。

圖6：CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA質(zhì)粒抑制細(xì)胞增殖的結(jié)果。與對(duì)照組相比，在加入1μg/ml強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA組中，T24細(xì)胞(圖A)及5637細(xì)胞(圖B)的增殖被顯著地抑制(P<0.01)。

圖7：ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒后細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果圖。轉(zhuǎn)染si-TUC338后，半胱天冬酶3(Caspase-3)在T24(圖A)及5637(圖B)均顯著性提高(P<0.05)。

圖8：ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染四環(huán)素誘導(dǎo)shRNA質(zhì)粒細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果圖。轉(zhuǎn)染四環(huán)素誘導(dǎo)TUC338shRNA后，半胱天冬酶3在T24(圖A)及5637(圖B)均顯著性提高(P<0.01)。

圖9：四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)質(zhì)粒psi-LVRInU6TGP的圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)驗(yàn)方法：

1.標(biāo)本的收集

膀胱癌及其配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本收集于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行全膀胱手術(shù)切除的膀胱癌患者標(biāo)本。每例患者均簽署知情同意書(shū)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

兩種膀胱癌細(xì)胞系T24和5637以及正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1均購(gòu)自中科院上海生科院。膀胱癌(人)細(xì)胞5637、T24和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1分別培養(yǎng)于1640、DMEM和F-12K培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％青霉素-鏈霉素混合液)，放置于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞在長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化后按比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.四環(huán)素誘導(dǎo)的針對(duì)TUC338的短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒構(gòu)建

四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)質(zhì)粒psi-LVRInU6TGP購(gòu)于廣州富能基因公司(FulenGen，廣州，中國(guó))，其圖譜如圖9所示。將針對(duì)TUC338的shRNA序列插入到四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的下端。

針對(duì)TUC338的shRNA序列是GCCCAATTGTGCAGTGTGAAA(SEQ ID NO:1)；針對(duì)陰性對(duì)照NC shRNA的序列為T(mén)TCTCCGAACGTGTACGTTT(SEQ ID NO:2)。

4.細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

si-TUC338序列為GCCCAATTGTGCAGTGTGAAA(SEQ ID NO:1)；陰性對(duì)照si-NC序列為T(mén)TCTCCGAACGTGTACGTTT(SEQ ID NO:2)。將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法參考轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine^TM 2000說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染6h后，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔再加入新的培養(yǎng)基500μl，減少Lipofectamine 2000對(duì)細(xì)胞的毒性。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用試劑盒 Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，貨號(hào)DRR820A)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s，然后以95℃5s、60℃30s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

定量PCR用的TUC338引物：

上游引物：5’-CCGGATTGACAGCCCTGGAGA-3’(SEQ ID NO:3),

下游引物：5’-CTGAGGCGGAAGGATTGAGTGAGC-3’(SEQ ID NO:4)；

GAPDH上游引物：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQ ID NO:5),

GAPDH下游引物：5’–AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQ ID NO:6)。

6.細(xì)胞增殖檢測(cè)

用含10％胎牛血清的無(wú)抗生素培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔2500個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100μl。使用細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(CCK8試劑盒)(博士德生物，貨號(hào)：AR1160)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72h，取相應(yīng)的孔做檢測(cè)。每孔加CCK8溶液10μl。孵育1h，選擇450nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))測(cè)定各孔吸光值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)。

7.細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用半胱天冬酶3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(caspase3ELISA)測(cè)凋亡指標(biāo)半胱天 冬酶3的活性來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Caspase 3 Assay Kit(Colorimetric)試劑盒購(gòu)于Abcam(貨號(hào)ab39401)。轉(zhuǎn)染前，每孔1×10⁵細(xì)胞種植到12孔板中。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到60％的融合度，按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48小時(shí)后，吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞兩次。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用x±s表示。TUC338在標(biāo)本癌組織及癌旁組織表達(dá)差異情況用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，CCK8細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)用ANOVA，其它數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.TUC338在膀胱癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，同時(shí)與臨床病理特征相關(guān)。

在30對(duì)膀胱癌標(biāo)本中，使用定量PCR方法，檢測(cè)膀胱癌組織及細(xì)胞中TUC338的表達(dá)水平。圖1顯示，膀胱癌組織中TUC338表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中高表達(dá)20例(66.7％)。表1顯示，高表達(dá)的TUC338與膀胱癌的病例分期及TNM分期高度相關(guān)(P<0.01)；但是與性別、年齡、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著性聯(lián)系；相對(duì)于正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)，TUC338在T24(圖2A)及5637(圖2B)細(xì)胞中顯著高表達(dá)(P<0.01)。

表1 TUC338表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系[n(％)]

2.si-TUC338敲低膀胱癌細(xì)胞TUC338表達(dá)

轉(zhuǎn)染si-TUC338 48小時(shí)后使用定量PCR方法檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中TUC338的表達(dá)水平。T24(圖3A)和在5637(圖3B)細(xì)胞系中，與si-NC組比較，在si-TUC338組細(xì)胞TUC338表達(dá)均顯著降低。表明si-TUC338可顯著下調(diào)5637及T24細(xì)胞內(nèi)TUC338的表達(dá)。

3.四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA敲低TUC338的表達(dá)

當(dāng)加入不同濃度的強(qiáng)力霉素后，四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA可以顯著地降低TUC338在T24(圖4A)和5637(圖4B)的表達(dá)(p<0.01)。當(dāng)1μg/ml的強(qiáng)力霉素加入已轉(zhuǎn)入四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA質(zhì)粒后，相對(duì)于對(duì)照組，在T24細(xì)胞中，TUC338表達(dá)水平下降了40％(P<0.01)；在5637細(xì)胞中下降了39％(P<0.01)。這些結(jié)果表明四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA可以降低TUC338的表達(dá)，并與強(qiáng)力霉素呈劑量依賴(lài)性。由于1μg/ml的強(qiáng)力霉素能夠最大程度地抑制TUC338的表達(dá)，后續(xù)研究采用1μg/ml的濃度。

4.si-TUC338抑制膀胱癌細(xì)胞增殖

CCK8結(jié)果顯示si-TUC338可以顯著地降低T24(圖5A)和5637(圖5B)細(xì)胞的增殖(P<0.01)。這些結(jié)果表明si-TUC338抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。

5.四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA抑制細(xì)胞增殖

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)加入了1μg/ml的強(qiáng)力霉素后，相對(duì)于對(duì)照組，四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA能夠顯著地抑制T24(圖6A)和5637(圖6B)的細(xì)胞增殖(P<0.01)。

6.TUC338抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡

ELISA法結(jié)果顯示，相對(duì)對(duì)照組，半胱天冬酶3活性和凋亡率在轉(zhuǎn)染si-TUC338的T24細(xì)胞(圖7A)和5637細(xì)胞(圖7B)中顯著提高(P<0.01)。以上結(jié)果顯示，TUC338可以抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡。

7.四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA促進(jìn)細(xì)胞凋亡

當(dāng)加入了1μg/ml的強(qiáng)力霉素后，ELISA法結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA能夠顯著地提高T24細(xì)胞(圖8A)和5637細(xì)胞(圖8B)中半胱天冬酶3活性(P<0.01)。上述結(jié)果表明與對(duì)照組相比，四環(huán)素誘導(dǎo)的TUC338 shRNA能夠顯著地增加凋亡細(xì)胞總數(shù)量及早期凋亡細(xì)胞。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。