本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物修復(fù)領(lǐng)域，涉及一種酰胺類除草劑乙草胺降解菌及其菌劑的發(fā)酵生產(chǎn)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙草胺是美國孟山都公司1971年開發(fā)的一種新型酰胺類除草劑，作為該類除草劑早期開發(fā)的品種，乙草胺占酰胺類除草劑當(dāng)前銷售量的最大份額，是目前世界上最重要的除草劑品種之一，也是目前我國使用量僅次于草甘膦的第二大類除草劑。可廣泛用于玉米、水稻、花生、棉花、大豆、煙草、蔬菜等農(nóng)作物的芽前土壤處理。因其具有除草活性高、持效期適中、應(yīng)用范圍大等優(yōu)點(diǎn)，所以應(yīng)用面積不斷擴(kuò)大。

隨著乙草胺的大量使用，其對環(huán)境的危害也日益加大，主要表現(xiàn)為對土壤微生物的影響、對土壤動(dòng)物的毒害、對哺乳動(dòng)物的毒害和對人類健康的影響、對魚類和水生動(dòng)物的毒害以及對植物的毒害。鑒于此，美國環(huán)境保護(hù)局1994年將乙草胺定為B-2類致癌物質(zhì)，但目前，乙草胺在我國旱田化學(xué)除草劑中仍占有著相當(dāng)重要的地位，是我國生產(chǎn)量和使用量最多的三大除草劑之一，2011年，乙草胺在我國的使用量達(dá)7.3萬噸。

由于環(huán)境中殘留的乙草胺會對環(huán)境產(chǎn)生不利影響，因此因而尋求環(huán)境友好、生態(tài)安全的乙草胺殘留消除技術(shù)顯得十分重要，且一直是農(nóng)業(yè)科技工作者的重要努力方向之一。 微生物修復(fù)技術(shù)是一種環(huán)境友好型的污染治理技術(shù)，其原理是利用微生物的新陳代謝活動(dòng)來降解有機(jī)污染物，通過人工接種高效降解性微生物或刺激降解性微生物大量生長，使之能夠在自然條件下將有機(jī)污染物消除。該項(xiàng)技術(shù)起初主要集中在石油污染環(huán)境的生物修復(fù)研究上，現(xiàn)在，已被應(yīng)用到土壤、水體等環(huán)境中的其他污染物處理。相對于物理、化學(xué)修復(fù)方法而言，生物修復(fù)具有成本低、效果好、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因此，該項(xiàng)技術(shù)日益引起人們的研究興趣，在國內(nèi)外，微生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于石油、化工和農(nóng)藥殘留有機(jī)污染的清除。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種對于氯代乙酰胺類除草劑乙草胺具有較好降解效果的降解菌株，以及通過該降解菌生產(chǎn)的菌劑。利用微生物修復(fù)的方法，降解環(huán)境中的化學(xué)農(nóng)藥殘留，消除土壤中的乙草胺殘留有機(jī)污染，實(shí)現(xiàn)綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。一種乙草胺除草劑的降解菌，芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO ：12860。

所述的保藏編號為CGMCC NO ：12860的芽孢桿菌ATC-4菌株在降解氯代乙酰胺類除草劑乙草胺中的應(yīng)用。

所述的保藏編號為CGMCC NO：12860的芽孢桿菌ATC-4菌株在修復(fù)土壤或水體環(huán)境中乙草胺污染的應(yīng)用。

一種用乙草胺除草劑的降解菌生產(chǎn)的菌劑，其活性成分為芽孢桿菌ATC-4，通過試管斜面種-搖瓶種-種子罐-生產(chǎn)罐-產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝流程，所產(chǎn)生的產(chǎn)品包裝劑型為液體菌劑，其生產(chǎn)的具體步驟為：

1）斜面種制備：將芽孢桿菌ATC-4原種在LB固體培養(yǎng)基上活化，驗(yàn)證其降解性能后接種于LB固體試管斜面上備用；

2）搖瓶種制備：將斜面種接種于盛有肉湯培養(yǎng)基的搖瓶中，經(jīng)30℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，準(zhǔn)備接種于種子罐；

3）種子罐培養(yǎng)：在500 L種子罐中加入400 L發(fā)酵培養(yǎng)基，將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)115℃-121℃高壓濕熱滅菌，待罐體冷卻至35℃以下后，將培養(yǎng)好的上述搖瓶種按10%的體積比接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；

4）生產(chǎn)罐培養(yǎng)：在生產(chǎn)罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)115℃-121℃高壓濕熱滅菌，待生產(chǎn)罐罐體冷卻至35℃以下后通入無菌空氣，使罐體保持無菌狀態(tài)，將培養(yǎng)至對數(shù)期的種子液按10%的體積比接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行培養(yǎng)；

5）在所述步驟3）種子罐培養(yǎng)和所述步驟4）生產(chǎn)罐培養(yǎng)的過程中，無菌空氣的通氣量體積比為1:0.6-1.2，攪拌速度為180-240 rpm，培養(yǎng)溫度為30℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為84-96小時(shí)；

6）菌劑產(chǎn)品：生產(chǎn)罐發(fā)酵結(jié)束后ATC-4菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐，直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，完成發(fā)酵菌劑生產(chǎn)。

所述LB固體培養(yǎng)基的成分為：酵母膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH值為7.0，且添加2%的瓊脂粉。

所述肉湯培養(yǎng)基的成分為：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH值為7.0-7.2。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其成分為：葡萄糖0.8%，(NH₄)₂SO₄ 1%，K₂HPO₄ 0.2%，MgSO₄0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，其余成分為水，pH值為7.0-7.3。

所述保藏編號為CGMCC NO ：12860的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4微生物菌劑在降解氯代乙酰胺類除草劑乙草胺中的應(yīng)用。

所述保藏編號為CGMCC NO ：12860的芽孢桿菌ATC-4微生物菌劑在修復(fù)土壤或水體環(huán)境中乙草胺污染中的應(yīng)用。

一種高效降解除草劑乙草胺的細(xì)菌菌株ATC-4，該菌株革蘭氏染色呈陽性，經(jīng)鑒定屬于芽孢桿菌（Bacillus.sp），已于2016年8月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO：12860。本發(fā)明的ATC-4菌體為桿狀，在LB 固體培養(yǎng)基平板上生長2天后，菌落呈淡黃色，圓形，不透明，較干燥，邊緣不規(guī)則。菌株對接觸酶和氧化酶陽性，可以水解淀粉和明膠，VP實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)呈陽性，吲哚實(shí)驗(yàn)陰性。

本發(fā)明提供的降解乙草胺的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4（CGMCC NO：12860），該菌株制備的菌劑可在短時(shí)間內(nèi)，使基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的乙草胺降解85%以上，使土壤中乙草胺的殘留量降低80％以上，具有廣泛的應(yīng)用潛力和價(jià)值。使用該發(fā)明生產(chǎn)的乙草胺殘留降解菌劑可以利用通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)，具有生產(chǎn)使用成本較低、使用方便、去除乙草胺效果優(yōu)良等特點(diǎn)，適合在全國糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地區(qū)大面積推廣使用，治理土壤和水體環(huán)境中乙草胺殘留造成的污染。本發(fā)明對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，降低除草劑對農(nóng)作物藥害，保護(hù)人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明生物材料保藏信息：

本發(fā)明的芽孢桿菌（Bacillus sp.）ATC-4是本發(fā)明的發(fā)明人從安徽長期生產(chǎn)乙草胺的農(nóng)藥廠污泥中篩選獲得的純培養(yǎng)物，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，（CGMCC NO：12860），地址為中國北京，中科院微生物所，保藏編號為CGMCC NO ：12860，保藏日期為2016年8月18日。

實(shí)施例1：乙草胺降解菌株的分離和鑒定：

用來富集乙草胺降解菌株的富集基質(zhì)取自安徽富田農(nóng)化有限公司農(nóng)藥廢水生化處理池的活性污泥，取活性污泥5.0 g 加入100ml 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中（NaCl 1.0 g/L，NH₄NO₃ 1.0 g/L，K₂HPO₄ 1.5 g/L，KH₂PO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，pH7.0，121℃滅菌25 min，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂。），加入100 mg/L 的乙草胺，30℃，180 rpm 培養(yǎng)7天，以5%的接種量轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，梯度稀釋富集液，取10^-5-10^-7 稀釋度的富集液各0.1 mL涂布于加有100 mg/L乙草胺的固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)4天后，挑取長出的單菌落接種于含100 mg/L乙草胺的培養(yǎng)基中，30℃，180 rpm 搖床培養(yǎng)7天，驗(yàn)證其降解效果。

降解效果的驗(yàn)證方法：在培養(yǎng)液中加入等體積的二氯甲烷進(jìn)行全量提取，劇烈振蕩后靜置10 min，待樣品分層后，用尖嘴吸管吸棄上清液，底部有機(jī)相過無水硫酸鈉柱，取1.0 mL置于微量離心管中，室溫下氮?dú)獯蹈?；加? mL色譜純甲醇溶解，經(jīng)孔徑0.22 μm濾器過濾后，采用高效液相色譜（HPLC）測定提取液中乙草胺的含量，液相色譜條件：流動(dòng)相為甲醇：水(80 ：20，V/V)，Zorbax C218 ODSSpherex 反相柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent，USA)，柱溫為室溫，紫外檢測器，測定波長230 nm，進(jìn)樣量20 μL，流速為1 mL/min。外標(biāo)法按峰面積定量。

從富集液中，分離到1 株乙草胺降解菌，命名為ATC-4。菌株ATC-4在固體培養(yǎng)基上生長3天后，菌落呈淡黃色，圓形，不透明，較干燥，邊緣不規(guī)則。G⁺，菌體為短桿狀，大小為0.5-1.0×1.0-1.5 μm。好氧生長，對接觸酶和氧化酶陽性，可以水解淀粉和明膠，VP實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)呈陽性，吲哚實(shí)驗(yàn)陰性。菌株ATC-4 的形態(tài)和生理生化特征和Bergey′ s manual of systematic bacteriology 上對芽孢桿菌菌屬的描述一致。

以菌株ATC-4的基因組DNA 為模板，用細(xì)菌16S rRNA 基因序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1419 bp 的16S rRNA 基因序列（Genbank 登錄號為KX524426.1）。在RDP 數(shù)據(jù)庫(https://rdp.cme.msu.edu/)中進(jìn)行Blast，結(jié)果表明菌株ATC-4與芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株的同源性最近，結(jié)合生理生化特征將該菌鑒定為芽孢桿菌屬。將該菌株送交位于中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC）保藏，保藏編號為CGMCC NO ：12860，保藏日期為2016年8月18日。

降解菌劑的發(fā)酵制備：

將本發(fā)明的乙草胺降解菌ATC-4原種在LB固體培養(yǎng)基（成分如下：酵母膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉）平板上活化，驗(yàn)證其降解性能后接種于LB 固體試管斜面上備用。將斜面種接種于含200 mL肉湯培養(yǎng)基（成分如下：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0-7.2）的1 L搖瓶中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，準(zhǔn)備接種于種子罐。在500 L種子罐中加入400 L發(fā)酵培養(yǎng)基，其成分如下：葡萄糖0.8%，(NH₄)₂SO₄ 1%，K₂HPO₄ 0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，其余成分為水，pH值7.0-7.3。將培養(yǎng)基121℃高壓濕熱滅菌，待罐體冷卻至35℃以下后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶種按10%（體積比）的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為220 rpm，無菌空氣通入量為1:0.8。在生產(chǎn)罐（5噸）中加入4.5噸發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分與種子罐中的培養(yǎng)基一樣，投料后的生產(chǎn)罐121℃高壓濕熱滅菌，待罐體冷卻至至35℃以下后通入無菌空氣，使罐體保持無菌狀態(tài)備用。將培養(yǎng)至對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在30℃，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.6-1.2（體積比），攪拌速度為240 rpm，全流程培養(yǎng)時(shí)間為84-96小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后ATC-4菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。

本發(fā)明的應(yīng)用案例1：

培養(yǎng)基中ATC-4對氯代乙酰胺類除草劑生物降解實(shí)驗(yàn)：

在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（同實(shí)施例1）中加入終濃度為100 mg/L 的乙草胺，3％的接種量接入ATC-4菌液，設(shè)接種滅活的ATC-4對照，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時(shí)取樣檢測菌株對乙草胺的降解情況，結(jié)果見表1。菌株ATC-4在3 天內(nèi)對乙草胺的降解率達(dá)到67.8%，7 天內(nèi)對100 mg/L乙草胺的降解率到85.9％。

表1：菌株ATC-4在培養(yǎng)基中對乙草胺降解效果

本發(fā)明的應(yīng)用案例2：

菌株ATC-4在土壤中對乙草胺的降解試驗(yàn)：

采供試土壤采自菜園土，為從未使用過乙草胺的表層土壤(0~30 cm)，土壤經(jīng)過風(fēng)干過篩(Φ=2 mm)后備用。土壤基本理化性質(zhì)如下：土壤為紅壤，pH 6.5，有機(jī)質(zhì)13.23 g/kg，全氮0.85 g/kg，速效氮72.71 mg/kg，速效磷12.54 mg/kg，速效鉀126.53 mg/kg。取一定量的乙草胺乳油溶于100 mL 甲醇中，然后將其均勻拌入500 g 土壤中，使土壤中乙草胺的終濃度均為100 mg/kg。新鮮的ATC-4培養(yǎng)液10000 rpm 離心5min 后，收集菌體，用無菌去離子水洗滌3 次后再用無菌水重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度約為1.0×10⁹ cfu/mL，以10%的接種量接入到上述土壤中。于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不接菌的作為對照，期間土壤的持水量保持在60%。每隔7天，利用液相色譜測定土壤中乙草胺殘留量。測定結(jié)果如表2。

表2：菌株ATC-4 在土壤中對乙草胺的降解情況

從表2 可以得出，菌株ATC-4在7天內(nèi)對乙草胺的降解率達(dá)到55.8％，28天內(nèi)對乙草胺和的降解率達(dá)到87.9％。

序列表：

<110> 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所

<120> 一種乙草胺除草劑的降解菌及其菌劑的生產(chǎn)和應(yīng)用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<400> 1

aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60

cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120

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gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaa 1419