本發(fā)明涉及一種液態(tài)淺層循環(huán)的醋酸菌高密度快培裝置及方法。

背景技術：

醋酸菌(Acetic acid bacteria)革蘭氏陰性的嚴格需氧菌，主要生活在含糖、酸或醇的原料中，在顯微鏡下觀察到醋酸菌細胞多為短桿棒狀，單個，大部分成對無芽胞，大小為0.6～1.0μm×1.7～1.9μm。

醋酸菌作為食品工業(yè)中最常使用的微生物之一，它不僅在谷物醋的釀造過程中起關鍵作用，同時被運用于水果醋的釀造、多糖薄膜的制備、同聚纖維素產(chǎn)品的開發(fā)等等多種用途。傳統(tǒng)醋酸菌培養(yǎng)工藝分為固態(tài)培養(yǎng)與液態(tài)培養(yǎng)，其中液態(tài)培養(yǎng)分為：表面靜態(tài)培養(yǎng)、搖床振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)。固態(tài)培養(yǎng)的缺點是營養(yǎng)物質無法充分使用，醋酸菌僅僅利用了表面部分的營養(yǎng)物質，深層的營養(yǎng)物質最終將丟棄，造成浪費，并且在固態(tài)培養(yǎng)的過程中將投入大量的人力物力。液態(tài)培養(yǎng)中表面靜態(tài)培養(yǎng)的缺點是醋酸菌容易形成醋膜，懸浮在液體表面，對氧氣進入液體造成阻礙，使得僅有少量的醋酸菌懸浮在醋液表面的醋膜中，同時部分營養(yǎng)物質被用于形成醋膜而導致額外的浪費?，F(xiàn)有工廠醋酸菌生產(chǎn)中，多以液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)與液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)為主，主要因其技術要求低，并且人力使用低于傳統(tǒng)固態(tài)培養(yǎng)與液態(tài)表面靜置培養(yǎng)。但由于醋酸菌的生存與生長必須依靠氧氣，并且其不耐強酸的特性導致在現(xiàn)有條件下難以大批量地生產(chǎn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服傳統(tǒng)醋酸菌培養(yǎng)存在的營養(yǎng)物質使用不充分與醋酸菌產(chǎn)量低下的問題，提供一種結構簡單，能夠大量、快速、自動化培養(yǎng)醋酸菌的醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置，以及采用該裝置高密度快培醋酸菌的方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案是：生長培養(yǎng)基儲存罐通過管道經(jīng)單向流加泵與培養(yǎng)槽的頂部相聯(lián)通，所述的培養(yǎng)槽由至少4個上表面開口的矩形槽疊放而成，每個矩形槽的底部設置有出液管，相鄰矩形槽上的出液管交錯設置，培養(yǎng)槽底部的出液管通過管道與加熱槽相聯(lián)通，加熱槽下部的一個出口通過管道經(jīng)雙向流加泵與菌懸液回收罐相連通、另一個出口通過管道經(jīng)恒流泵與培養(yǎng)槽的頂部相連通，加熱槽上部的入口通過管道經(jīng)雙向流加泵與補充培養(yǎng)基儲存罐相連通。

上述矩形槽的長為60～160cm、寬為5～25cm、高為1～4cm，優(yōu)選矩形槽的長為100cm、寬為15cm、高為1～4cm。

上述出液管1的直徑優(yōu)選為1.0～2.0cm、高度優(yōu)選為3～6mm。

上述培養(yǎng)槽優(yōu)選由4～12個上表面開口的矩形槽2疊放而成。

采用上述裝置高密度快培醋酸菌的方法由下述步驟組成：

1、醋酸菌菌株的培養(yǎng)

將漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii活化培養(yǎng)后的菌株接種于馴化培養(yǎng)基中30±1℃馴化培養(yǎng)48小時，其中馴化培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入2～6g葡萄糖、0.5～2g酵母提取物、0.5～2g大豆蛋白粉、0.1～0.5g丙氨酸、0.005～0.015g醋酸鈉、0.001～0.01g輔酶Q10、0.001～0.01g葉酸，滅菌后加入1～5mL無水乙醇和0.5～3mL冰乙酸制成；再按上述方法重復馴化培養(yǎng)2～8次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加0.5～3mL，且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸總量不超過10mL；馴化培養(yǎng)完后分離出優(yōu)勢醋酸菌進行一級擴大培養(yǎng)和二級擴大培養(yǎng)。

2、裝置消毒

在密閉條件下，將醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置用質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液熏蒸24小時，同時使用55W紫外滅菌燈輻照2小時，每立方米密閉空間里質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液的使用量為100～200mL。

3、醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)

在無菌條件下，將生長培養(yǎng)基儲存罐內接有步驟1二級擴大培養(yǎng)后的菌懸液的淺層生長培養(yǎng)基通過單向流加泵泵入培養(yǎng)槽最上面一層矩形槽內，待培養(yǎng)液逐級向下充滿矩形槽且從最底部矩形槽的出液管流入加熱槽的培養(yǎng)液高于加熱槽下部的兩個出口后，關閉單向流加泵，開啟加熱槽加熱培養(yǎng)液使其維持在30±2℃，并開啟恒流泵使加熱槽和培養(yǎng)槽內的培養(yǎng)液循環(huán)流動；培養(yǎng)42～54小時后，開啟雙向流加泵，向加熱槽內泵入補充培養(yǎng)基儲存罐中的補充培養(yǎng)基，培養(yǎng)66～78小時后，將雙向流加泵的流速加倍；從加熱槽泵出的菌懸液流入菌懸液回收罐內。

上述的淺層生長培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入4～12g葡萄糖、1～4g酵母提取物、1～5g大豆蛋白粉、0.5～1g丙氨酸、0.001～0.01g輔酶Q10、0.005～0.02g醋酸鈉、0.001～0.01g葉酸，滅菌后再加入1.0～5.5mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和0.5～3mL冰乙酸制成；所述的補充培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入1～5g葡萄糖、0.1～3.0g酵母提取物、0.1～3.0g大豆蛋白粉、1～7g無水碳酸鈉，滅菌后再加入2.0～5.5mL體積分數(shù)為95％的食用酒精制成。

4、制備醋酸菌粉

培養(yǎng)90～102小時后，關閉加熱槽、恒流泵、雙向流加泵，將培養(yǎng)槽內的菌懸液倒入菌懸液回收罐內，然后將食品級脫脂奶粉與菌懸液回收罐內的菌懸液按質量-體積比為0.5～3g:10mL混合，經(jīng)均質、預冷凍、真空冷凍干燥，得到醋酸菌粉成品。

上述步驟1中，優(yōu)選馴化培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3g丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.003g輔酶Q10、0.003g葉酸，滅菌后加入2mL無水乙醇和1mL冰乙酸制成；再重復馴化培養(yǎng)4次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加1mL。

上述步驟3中，優(yōu)選淺層生長培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.005g輔酶Q10、0.005g葉酸，滅菌后再加入2.10mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和1mL冰乙酸制成；優(yōu)選補充培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、5g無水碳酸鈉，滅菌后再加入3.2mL體積分數(shù)為95％的食用酒精制成。

上述步驟3中，進一步優(yōu)選補充培養(yǎng)基的泵入總體積為淺層生長培養(yǎng)基總體積的20％～40％，優(yōu)選恒流泵的流速為60～120L/h、雙向流加泵的流速為10～60mL/h。

本發(fā)明裝置相對于現(xiàn)有工廠醋酸菌生產(chǎn)中使用的大型搖床與液態(tài)發(fā)酵罐，結構簡單、成本低、能耗低，能夠大量、快速、自動化培養(yǎng)醋酸菌。采用本發(fā)明裝置培養(yǎng)醋酸菌，相比于固態(tài)培養(yǎng)，本發(fā)明在人力的投入量上實現(xiàn)了巨大的減少并可實現(xiàn)自動化培養(yǎng)；相對于固體培養(yǎng)時醋酸菌只能使用表面培養(yǎng)物質的情況，本發(fā)明使用循環(huán)培養(yǎng)方式，提高了培養(yǎng)物質的使用率。相比于液態(tài)表面靜態(tài)培養(yǎng)，本發(fā)明大大增加了培養(yǎng)面積，保證了醋酸菌生長過程中所需的正常溶氧量以及菌體生長平面空間，提高了液體培養(yǎng)醋酸菌的濃度，最終實現(xiàn)短時高效節(jié)源的醋酸菌高密度液態(tài)培養(yǎng)，而且對醋酸菌進行高密度培養(yǎng)后可從醋酸菌細胞膜中提取乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、輔酶Q10、輔酶Q9等多種功能性物質，并且能提高各物質的提取效率。相對于現(xiàn)有工廠醋酸菌生產(chǎn)中液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)與液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)方法，本發(fā)明方法簡單易行，可在現(xiàn)有工廠中輕易實現(xiàn)。

附圖說明

圖1是醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置的結構示意圖。

圖2是液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)菌株醋酸菌N-9的掃描電子顯微鏡圖。

圖3是液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)醋酸菌菌株N-9的掃描電子顯微鏡圖。

圖4是液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)醋酸菌菌株N-9的掃描電子顯微鏡圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

如圖1所示，本實施例的醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置由出液管1、矩形槽2、生長培養(yǎng)基儲存罐3、單向流加泵4、恒流泵5、加熱槽6、雙向流加泵7、菌懸液回收罐8、補充培養(yǎng)基儲存罐9組成。

生長培養(yǎng)基儲存罐3通過管道經(jīng)單向流加泵4與培養(yǎng)槽的頂部相聯(lián)通，所述的培養(yǎng)槽由4個上表面開口的矩形槽2疊放而成，矩形槽2的長為100cm、寬為15cm、高為4cm，材質為亞克力板。每個矩形槽2的底部加工有出液管1，且相鄰矩形槽2上的出液管1交錯排列。出液管1的直徑為1.0cm、高度為4mm，通過出液管1的高度可控制液面厚度。培養(yǎng)槽底部的出液管1通過管道與加熱槽6相聯(lián)通，加熱槽6下部的一個出口通過管道經(jīng)雙向流加泵7與菌懸液回收罐8相連通、另一個出口通過管道經(jīng)恒流泵5與培養(yǎng)槽的頂部相連通，加熱槽6上部的入口通過管道經(jīng)雙向流加泵7與補充培養(yǎng)基儲存罐9相連通。

采用上述裝置高密度快培醋酸菌的方法由下述步驟組成：

1、醋酸菌菌株的培養(yǎng)

將漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii(購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號為1.1811)接種于活化培養(yǎng)基中進行平皿固體活化培養(yǎng)，活化培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入10g葡萄糖、1g酵母提取物、2.0g CaCO₃、1.5g瓊脂滅菌后制成，培養(yǎng)時間為48h，培養(yǎng)溫度為30±1℃。將活化培養(yǎng)后的菌株接種于馴化培養(yǎng)基中，在30±1℃下馴化培養(yǎng)48h，其中馴化培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3g丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.003g輔酶Q10、0.003g葉酸，滅菌后加入2mL無水乙醇和1mL冰乙酸制成。再按上述方法重復馴化培養(yǎng)4次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加1mL。馴化培養(yǎng)完后分離出優(yōu)勢醋酸菌，將所得優(yōu)勢醋酸菌菌株接種于含有80mL擴大培養(yǎng)基的250mL三角瓶，并置于搖床上在30±1℃下一級擴大培養(yǎng)24小時；再在無菌條件下，將一級擴大培養(yǎng)的菌懸液直接轉入含有320mL擴大培養(yǎng)基的1000mL三角瓶，并置于搖床上在30±1℃下二級擴大培養(yǎng)24小時，其中一級和二級擴大培養(yǎng)基均是向每100mL蒸餾水中加入10g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉并滅菌后得到。

2、裝置消毒

在密閉條件下，將醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置用質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液熏蒸24小時，同時使用55W紫外滅菌燈輻照2小時，每立方米密閉空間里質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液的使用量為150mL。

3、醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)

在無菌條件下，將生長培養(yǎng)基儲存罐3內接有步驟1二級擴大培養(yǎng)后的菌懸液的淺層生長培養(yǎng)基通過單向流加泵4泵入培養(yǎng)槽最上面一層矩形槽2內，其中淺層生長培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.005g輔酶Q10、0.005g葉酸，滅菌后再加入2.10mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和1mL冰乙酸制成。待培養(yǎng)液逐級向下充滿矩形槽2且從最底部矩形槽2的出液管1流入加熱槽6的培養(yǎng)液高于加熱槽6下部的兩個出口后，關閉單向流加泵4，開啟加熱槽6加熱培養(yǎng)液使其維持在30±1℃，并開啟恒流泵5使加熱槽6和培養(yǎng)槽內的培養(yǎng)液循環(huán)流動，所述恒流泵5的流速為80L/h。培養(yǎng)48小時后，開啟雙向流加泵7，向加熱槽6內泵入補充培養(yǎng)基儲存罐9中的補充培養(yǎng)基，其中雙向流加泵7的流速為14mL/h，補充培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、5g無水碳酸鈉，滅菌后再加入3.2mL體積分數(shù)為95％的食用酒精制成，補充培養(yǎng)基的泵入總體積為淺層生長培養(yǎng)基總體積的37.5％。培養(yǎng)72小時后，將雙向流加泵7的流速增加至28mL/h。開啟雙向流加泵7后，從加熱槽6泵出的菌懸液均流入菌懸液回收罐8內。

4、制備醋酸菌粉

培養(yǎng)96小時后，關閉加熱槽6、恒流泵5、雙向流加泵7，將培養(yǎng)槽內的菌懸液倒入菌懸液回收罐8內，然后將食品級無菌脫脂奶粉與菌懸液回收罐8內的菌懸液按質量-體積比為1g:10mL混合，使用內切式高速分散器在轉速為5000rpm下均質10分鐘，將均質后的混合液在-20±1℃下預冷凍24小時，隨后轉入真空冷凍干燥機中在-40±1℃下使混合液干燥完全，最終得到每克成品中含有不低于0.35g醋酸菌的高密度的醋酸菌粉成品。

實施例2

本實施例中，培養(yǎng)槽由8個上表面開口的矩形槽2疊放而成，矩形槽2的長為60cm、寬為25cm、高為1cm，出液管1的直徑為1.0cm、高度為2mm。其余零部件及零部件的連接關系與實施例1相同。

采用本實施例的裝置高密度快培醋酸菌的方法，在步驟1中，使用的馴化培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入3g葡萄糖、1g酵母提取物、0.5g大豆蛋白粉、0.1g丙氨酸、0.005g醋酸鈉、0.001g輔酶Q10、0.001g葉酸，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸制成。再重復馴化培養(yǎng)5次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加1.5mL；在步驟3中，使用的淺層生長培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸、0.005g醋酸鈉、0.001g輔酶Q10、0.001g葉酸，滅菌后再加入1.0mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和0.5mL冰乙酸制成，培養(yǎng)48小時后，開啟雙向流加泵7，向加熱槽6內泵入補充培養(yǎng)基儲存罐9中的補充培養(yǎng)基，使用的補充培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入1g葡萄糖、0.1g酵母提取物、0.1g大豆蛋白粉、1g無水碳酸鈉，滅菌后再加入2.0mL體積分數(shù)為95％的食用酒精制成，雙向流加泵7的流速為11mL/h，補充培養(yǎng)基的泵入總體積為淺層生長培養(yǎng)基總體積的30％，培養(yǎng)72小時后，將雙向流加泵7的流速增加至22mL/h，該步驟的其他步驟與實施例1相同。其他步驟與實施例1相同。

實施例3

本實施例中，培養(yǎng)槽由12個上表面開口的矩形槽2疊放而成，矩形槽2的長為160cm、寬為5cm、高為3cm，出液管1的直徑為1.0cm、高度為3mm。其余零部件及零部件的連接關系與實施例1相同。

采用本實施例的裝置高密度快培醋酸菌的方法，在步驟1中，使用的馴化培養(yǎng)基是每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.01g輔酶Q10、0.001g葉酸，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸制成。再重復馴化培養(yǎng)2次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加3mL；在步驟3中，使用的淺層生長培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入12g葡萄糖、4g酵母提取物、5g大豆蛋白粉、1g丙氨酸、0.02g醋酸鈉、0.01g輔酶Q10、0.01g葉酸，滅菌后再加入5.5mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和3mL冰乙酸制成，培養(yǎng)48小時后，開啟雙向流加泵7，向加熱槽6內泵入補充培養(yǎng)基儲存罐9中的補充培養(yǎng)基，使用的補充培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入5g葡萄糖、3.0g酵母提取物、3.0g大豆蛋白粉、7g無水碳酸鈉，滅菌后再加入5.5mL體積分數(shù)為95％的食用酒精制成，雙向流加泵7的流速為21mL/h，補充培養(yǎng)基的泵入總體積為淺層生長培養(yǎng)基總體積的20％，培養(yǎng)72小時后，將雙向流加泵7的流速增加至42mL/h，該步驟的其他步驟與實施例1相同。其他步驟與實施例1相同。

為了確定本發(fā)明的最佳工藝條件，發(fā)明人進行了大量的研究試驗，具體試驗情況如下：

1、醋酸菌菌株的篩選

在無菌條件下，分別將巴氏醋桿菌Acetobacter pasteurianus(購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號為1.41)、LB醋酸菌(購于鼎豐科技公司)、漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii(購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號為1.1811)接種于活化培養(yǎng)基中進行平皿固體活化培養(yǎng)，活化培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入10g葡萄糖、1g酵母提取物、2.0g CaCO₃、1.5g瓊脂滅菌后制成，培養(yǎng)時間為48小時，培養(yǎng)溫度為30±1℃。將活化培養(yǎng)后所得優(yōu)勢醋酸菌菌株接種于含有100mL擴大培養(yǎng)基的250mL三角瓶，并置于搖床上振蕩培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入10g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉滅菌后制成，搖床轉速為150rpm，培養(yǎng)時間為3天，培養(yǎng)溫度為30±1℃。

采用氣相色譜法(使用正丁醇(色譜純)作為溶劑，將醋酸菌發(fā)酵液稀釋100倍后進樣測定，氣相色譜儀器參數(shù)為：GC-2010PLUSAF 230V島津氣相色譜儀配FID檢測器及Labsolutions工作站(日本島津)，色譜柱：HP-INNOWAX毛細管柱，色譜柱ID：327817H，長30.0m，內徑0.32mm，膜厚0.25μm。試劑：冰乙酸(色譜純)，無水乙醇(色譜純)，正丁醇(色譜純)。色譜條件：柱溫：平衡溫度60℃，平衡時間3min。起始溫度60℃(保留1min)，以10℃/min速率上升至120℃(保留1min)。檢測器溫度：210℃。氣化溫度：210℃。進樣模式：分流。進樣時間：1min。載氣：高純度氮氣，壓力77.4kPa，流量76.7mL/min，分流比28.0。流量程序：氫氣流量：40mL/min?？諝饬髁浚?00mL/min。尾吹：30mL/min。進樣：1微升。測定方法：外標法)測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表1。

表1 不同菌株產(chǎn)酸能力強弱比較

由表1可知，漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii為3種醋酸菌中產(chǎn)酸能力最強醋酸菌，而且試驗結果表明該菌對碳酸鈣有明顯的消耗作用，形成清晰的透明圈，進一步說明該菌有較強的產(chǎn)酸能力。同時漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii的菌體經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察到為革蘭氏陰性菌，并且菌體為接近橢圓形的短棒形結構。故本發(fā)明選取漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii作為初始菌株。

2.醋酸菌菌株的馴化

在無菌條件下，將漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii接種于活化培養(yǎng)基中進行平皿固體活化培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48h，培養(yǎng)溫度為30±1℃。將活化培養(yǎng)后的菌株接種于馴化培養(yǎng)基中，在30±1℃下馴化培養(yǎng)48小時。將馴化后所得優(yōu)勢醋酸菌菌株接種于含有100mL擴大培養(yǎng)基的250mL三角瓶，并置于搖床上振蕩培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)基是向每100mL蒸餾水中加入10g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉滅菌后制成，搖床轉速為150rpm，培養(yǎng)時間為3天，培養(yǎng)溫度為30±1℃。培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱。

(1)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中碳源的篩選

向每100mL蒸餾水中加入2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉，并分別加入4g葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、4mL無水乙醇(滅菌后加入)、4.2mL 95％Vol食用酒精(滅菌后加入)，滅菌后加1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表2。

表2 不同碳源的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表2可知，馴化培養(yǎng)基中使用葡萄糖與無水乙醇作為碳源時產(chǎn)酸效果較好，故本發(fā)明選取葡萄糖與無水乙醇作為馴化培養(yǎng)基中的混合碳源。

(2)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中混合碳源葡萄糖添加量

向每100mL蒸餾水中加入2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉，并加入葡萄糖與無水乙醇作為混合碳源，其中葡萄糖添加量分別為：2、4、6、8、10、12g，滅菌后加4mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表3。

表3 不同葡萄糖添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表3可知，馴化培養(yǎng)基中使用葡萄糖與無水乙醇作為馴化培養(yǎng)基中的混合碳源時，葡萄糖添加量為4g產(chǎn)酸效果較好。

(3)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中混合碳源無水乙醇添加量

向每100mL蒸餾水中加入2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉，并加入葡萄糖與無水乙醇作為混合碳源，其中加入4g葡萄糖，滅菌后分別加入1、2、3、4、5、6mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表4。

表4 不同無水乙醇添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表4可知，馴化培養(yǎng)基中使用葡萄糖與無水乙醇作為馴化培養(yǎng)基中的混合碳源時，無水乙醇添加量為2mL產(chǎn)酸效果較好。

(4)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中氮源的篩選

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖，并分別加入4g酵母提取物、酵母浸出汁、牛肉膏、酵母粉、大豆蛋白粉、丙氨酸，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacterhansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表5。

表5 不同氮源的的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表5可知，馴化培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為馴化培養(yǎng)基中的氮源時產(chǎn)酸效果較好，故本發(fā)明選取酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為馴化培養(yǎng)基中的混合氮源。

(5)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中混合氮源酵母提取物添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖，并加入酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源，其中分別加入4g大豆蛋白粉、4g丙氨酸，酵母提取物的添加量分別為：0.1、0.5、1、2、3、4g，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表6。

表6 不同酵母提取物添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表6可知，馴化培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為馴化培養(yǎng)基中的混合碳源時，酵母提取物添加量為1g產(chǎn)酸效果較好。

(6)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中混合氮源大豆蛋白粉添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖，并加入酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源，其中分別加入1g酵母提取物、4g丙氨酸，大豆蛋白粉的添加量分別為：0.1、0.5、1、2、3、4g，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表7。

表7 不同大豆蛋白粉添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表7可知，馴化培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為馴化培養(yǎng)基中的混合碳源時，大豆蛋白粉添加量為1g產(chǎn)酸效果較好。

(7)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中混合氮源丙氨酸添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖，并加入酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源，其中分別加入1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉，丙氨酸的添加量分別為：0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.3g，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表8。

表8 不同丙氨酸添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表8可知，馴化培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為馴化培養(yǎng)基中的混合碳源時，丙氨酸添加量為0.3g產(chǎn)酸效果較好。

(8)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中無機鹽及生長因子的篩選

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸，并分別加入0.01g輔酶Q10、醋酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、葉酸，滅菌后加入2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表9。

表9 不同無機鹽及生長因子的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表9可知，馴化培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為馴化培養(yǎng)基中的無機鹽及生長因子時產(chǎn)酸效果較好，故本發(fā)明選取輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為馴化培養(yǎng)基中的無機鹽及生長因子。

(9)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中無機鹽醋酸鈉添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸，并加入輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子，其中分別加入0.01g輔酶Q10、0.01g葉酸，醋酸鈉的添加量分別為：0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04g，滅菌后加入2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表10。

表10 不同醋酸鈉添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表10可知，馴化培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為馴化培養(yǎng)基中的無機鹽及生長因子時，醋酸鈉添加量為0.01g產(chǎn)酸效果較好。

(10)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中生長因子輔酶Q10添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸，并加入輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子，其中分別加入0.01g醋酸鈉、0.01g葉酸，輔酶Q10的添加量分別為：0.001、0.003、0.005、0.010、0.015、0.020g，滅菌后加入2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表11。

表11 不同輔酶Q10添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表11可知，馴化培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為馴化培養(yǎng)基中的無機鹽及生長因子時，輔酶Q10添加量為0.003g產(chǎn)酸效果較好。

(11)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中生長因子葉酸添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸，并加入輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子，其中分別加入0.01g醋酸鈉、0.003g輔酶Q10，葉酸的添加量分別為：0.001、0.003、0.005、0.008、0.010、0.013g，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表12。

表12 不同葉酸添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表12可知，馴化培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為馴化培養(yǎng)基中的無機鹽及生長因子時，葉酸添加量為0.003g產(chǎn)酸效果較好。

(12)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中冰乙酸初始添加量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.003g輔酶Q10、0.003g葉酸，滅菌后加2mL無水乙醇，并且冰乙酸初始添加量分別為：0.1、0.5、1、2、3、4mL，作為馴化培養(yǎng)基。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表13。

表13 不同冰乙酸初始添加量的馴化培養(yǎng)基對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表13可知，馴化培養(yǎng)基中冰乙酸初始添加量為1mL產(chǎn)酸效果較好。

(13)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中馴化次數(shù)

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.003g輔酶Q10、0.003g葉酸，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。再分別重復馴化培養(yǎng)次數(shù)為：2、4、6、8、10、12次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加1mL。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表14。

表14 不同重復馴化培養(yǎng)次數(shù)對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表14可知，馴化培養(yǎng)基中冰乙酸初始添加量為1mL，重復馴化培養(yǎng)次數(shù)為4次時，產(chǎn)酸效果較好。并且試驗表明當每100mL蒸餾水加入的冰乙酸總量超過10mL后，醋酸菌的生長會得到明顯的抑制。故馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸總量不超過10mL。

(14)醋酸菌馴化培養(yǎng)基中冰乙酸逐次梯度提高量

向每100mL蒸餾水中加入4g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、0.3丙氨酸、0.01g醋酸鈉、0.003g輔酶Q10、0.003g葉酸，滅菌后加2mL無水乙醇和1mL冰乙酸作為馴化培養(yǎng)基。再重復馴化培養(yǎng)4次，并且馴化培養(yǎng)基中每100mL蒸餾水加入的冰乙酸逐次等量增加0.1、0.5、1、2、2.5mL。按照試驗2的方法培養(yǎng)漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii，培養(yǎng)結束采用氣相色譜法，測定不同菌株產(chǎn)酸(乙酸)能力強弱，試驗結果見表15。

表15 不同冰乙酸逐次梯度提高量對醋酸菌產(chǎn)酸能力的影響

由表15可知，馴化培養(yǎng)基中冰乙酸初始添加量為1mL，重復馴化培養(yǎng)次數(shù)為4次，冰乙酸逐次梯度提高量為1mL時，產(chǎn)酸效果較好。

上述將漢氏葡萄糖醋桿菌Gluconacetobacter hansenii經(jīng)過連續(xù)馴化培養(yǎng)所得優(yōu)勢醋酸菌菌株命名為N-9醋酸菌菌株，以下均使用該菌株進行試驗。

3、醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置的構建與優(yōu)化

考慮在培養(yǎng)過程中，不同的裝置參數(shù)對培養(yǎng)效果的影響，設定不同單因素試驗進行裝置的優(yōu)化處理。裝置的規(guī)格參數(shù)表現(xiàn)在矩形槽2的長度、矩形槽2寬度、出液管1高度、恒流泵5流速、矩形槽2個數(shù)5個方面。其余零部件及零部件的連接關系與實施例1相同。在密閉條件下，將醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置用質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液熏蒸24小時，同時使用55W紫外滅菌燈輻照2小時，每立方米密閉空間里質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液的使用量為150mL。將二級擴大培養(yǎng)后的N-9醋酸菌菌懸液接入擴大培養(yǎng)基(每100mL蒸餾水中加入10g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉滅菌后制成)中，并將其轉入醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置的淺層生長培養(yǎng)基儲存罐3中，再通過單向流加泵4泵入培養(yǎng)槽最上面一層矩形槽2內，待培養(yǎng)液逐級向下充滿矩形槽2且從最底部矩形槽2的出液管1流入加熱槽6的培養(yǎng)液高于加熱槽6下部的兩個出口后，關閉單向流加泵4，開啟加熱槽6加熱培養(yǎng)液使其維持在30±1℃，并開啟恒流泵5使加熱槽6和培養(yǎng)槽內的培養(yǎng)液循環(huán)流動。培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，具體測定方法為：取4mL菌懸液置于高速離心機中，7000×g條件下離心6min取上清液作為空白對照組，使用紫外-可見分光光度計在波長660nm下測定菌懸液的OD₆₆₀值以表示菌濃度的大小(一個單位的OD₆₆₀值代表醋酸菌干重0.04g)。

(1)矩形槽2長度對醋酸菌菌濃度的影響

不同矩形槽2的長度及培養(yǎng)96小時后菌濃度測定結果如表16所示。

表16 矩形槽2長度對培養(yǎng)效果的影響

由表16可知，在矩形槽2的寬為10cm、矩形槽2的個數(shù)為4、出液管1的高度為3mm、恒流泵5流速為60L/h時，矩形槽2的長度為100cm培養(yǎng)效果較好。將所得到的菌懸液在無菌條件下接種于醋酸菌活化培養(yǎng)基，30±1℃下培養(yǎng)3d，觀察發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生明顯透明圈且無雜菌生長，故該冰醋酸噴灑熏蒸結合紫外照射方法可實現(xiàn)在此密閉空間中的消毒作用。

(2)矩形槽2寬度對醋酸菌菌濃度的影響

不同矩形槽2的寬度及培養(yǎng)96小時后菌濃度測定結果見表17。

表17 矩形槽2寬度對培養(yǎng)效果的影響

由表17可知，在矩形槽2的長為100cm、矩形槽2的個數(shù)為4、出液管1的高度為3mm、恒流泵5流速為60L/h時，矩形槽2的寬度為15cm培養(yǎng)效果較好。

(3)出液管1高度對醋酸菌菌濃度的影響

不同出液管1高度及培養(yǎng)96小時后菌濃度測定結果見表18。

表18 出液管1高度對培養(yǎng)效果的影響

由表18可知，在矩形槽2的長為100cm、寬為15cm，矩形槽2的個數(shù)為4，恒流泵5流速為60L/h時，出液管1的高度為4mm培養(yǎng)效果較好。

(4)恒流泵5流速對醋酸菌菌濃度的影響

不同恒流泵5流速及培養(yǎng)96小時后菌濃度測定結果見表19。

表19 恒流泵5流速對培養(yǎng)效果的影響

由表19可知，在矩形槽2的長為100cm、寬為15cm，矩形槽2的個數(shù)為4，出液管1的高度為4mm時，恒流泵5流速為80L/h培養(yǎng)效果較好。

(5)矩形槽2個數(shù)對醋酸菌菌濃度的影響

不同矩形槽2個數(shù)及培養(yǎng)96小時后菌濃度測定結果見表20。

表20 矩形槽2個數(shù)對培養(yǎng)效果的影響

由表20可知，在矩形槽2的長為100cm、寬為15cm，出液管1的高度為4mm時，恒流泵5流速為80L/h，矩形槽2的個數(shù)為4培養(yǎng)效果較好。

4、醋酸菌淺層生長培養(yǎng)基的優(yōu)化

考慮在培養(yǎng)過程中，不同的生長培養(yǎng)基成分與配比對培養(yǎng)效果的影響，設定不同單因素試驗進行生長培養(yǎng)基成分與配比的優(yōu)化處理。根據(jù)試驗2的結果，本試驗選擇矩形槽2的長為100cm、寬為15cm，出液管1的高度為4mm，恒流泵5流速為80L/h，矩形槽2的個數(shù)為4，其余零部件及零部件的連接關系與實施例1相同。在密閉條件下，將醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置用質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液熏蒸24小時，同時使用55W紫外滅菌燈輻照2小時，每立方米密閉空間里質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液的使用量為150mL。將二級擴大培養(yǎng)后的N-9醋酸菌菌懸液接入淺層生長培養(yǎng)基中，并將其轉入醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置的淺層生長培養(yǎng)基儲存罐3中，再通過單向流加泵4泵入培養(yǎng)槽最上面一層矩形槽2內，待培養(yǎng)液逐級向下充滿矩形槽2且從最底部矩形槽2的出液管1流入加熱槽6的培養(yǎng)液高于加熱槽6下部的兩個出口后，關閉單向流加泵4，開啟加熱槽6加熱培養(yǎng)液使其維持在30±1℃，并開啟恒流泵5使加熱槽6和培養(yǎng)槽內的培養(yǎng)液循環(huán)流動。培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度。

(1)淺層生長培養(yǎng)基中碳源的篩選

向每100mL蒸餾水中加入1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉，并分別加入4g葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、4.2mL 95％Vol食用酒精(滅菌后加入)、4mL冰乙酸(滅菌后加入)，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表21。

表21 不同碳源的淺層生長培養(yǎng)基對培養(yǎng)效果的影響

由表21可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為碳源時培養(yǎng)效果較好，故本發(fā)明選取葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源。

(2)淺層生長培養(yǎng)基中混合碳源葡萄糖添加量

向每100mL蒸餾水中加入1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、并加入葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源，其中葡萄糖添加量分別為：2、4、6、8、10、12g，滅菌后加入4.2mL 95％Vol食用酒精與4mL冰乙酸，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表22。

表22 不同葡萄糖添加量在淺層循環(huán)培養(yǎng)設備中培養(yǎng)效果

由表22可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源時，葡萄糖添加量為6g培養(yǎng)效果較好。

(3)淺層生長培養(yǎng)基中混合碳源95％Vol食用酒精添加量

向每100mL蒸餾水中加入1g酵母提取物，1g大豆蛋白粉，并加入葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源，其中加入6g葡萄糖，滅菌后分別加入0.53、1.05、2.10、3.16、4.21、5.26mL 95％Vol食用酒精與4mL冰乙酸，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表23。

表23 不同95％Vol食用酒精添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表23可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源時，95％Vol食用酒精添加量為2.10mL培養(yǎng)效果較好。

(4)淺層生長培養(yǎng)基中混合碳源冰乙酸添加量

向每100mL蒸餾水中加入1g酵母提取物，1g大豆蛋白粉，并加入葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源，其中加入6g葡萄糖，滅菌后加入4.21mL95％Vol食用酒精，并且冰乙酸的添加量分別為：0.1、0.5、1、2、3、4mL，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表24。

表24 不同冰乙酸添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表24可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用葡萄糖、95％Vol食用酒精與冰乙酸作為混合碳源時，冰乙酸添加量為1mL培養(yǎng)效果較好。

(5)淺層生長培養(yǎng)基中氮源的篩選

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖，并分別加入4g酵母提取物、大豆蛋白粉、牛肉膏、酵母粉、酵母浸出汁、丙氨酸作為氮源，滅菌后加入2.1mL 95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表25。

表25 不同氮源的淺層生長培養(yǎng)基對培養(yǎng)效果的影響

由表25可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為氮源時培養(yǎng)效果較好，本發(fā)明選取酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源。

(6)淺層生長培養(yǎng)基中混合氮源酵母提取物添加量

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖，并加入酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源，其中4g大豆蛋白粉、4g丙氨酸、酵母提取物添加量分別為1、2、3、4、5、6g，滅菌后加入2.1mL 95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表26。

表26 不同酵母提取物添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表26可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源時，酵母提取物添加量為2g培養(yǎng)效果較好。

(7)淺層生長培養(yǎng)基中混合氮源大豆蛋白粉添加量

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖，并加入酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源，其中2g酵母提取物、4g丙氨酸，大豆蛋白粉添加量分別為1、2、3、4、5、6g，滅菌后加入2.1mL95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表27。

表27 不同大豆蛋白粉添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表27可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源時，大豆蛋白粉添加量為2g培養(yǎng)效果較好。

(8)淺層生長培養(yǎng)基中混合氮源丙氨酸添加量

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖，并加入酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源，其中2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉，丙氨酸添加量分別為0.1、0.5、1、2、3、4g，滅菌后加入2.1mL95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表28。

表28 不同丙氨酸添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表28可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用酵母提取物、大豆蛋白粉與丙氨酸作為混合氮源時，丙氨酸添加量為0.5g培養(yǎng)效果較好。

(9)淺層生長培養(yǎng)基中無機鹽及生長因子的篩選

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸，并分別加入0.01g輔酶Q10、醋酸鈉、氯化鈉、氯化鈣、葉酸，滅菌后再加入2.1mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和1mL冰乙酸，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表29。

表29 不同碳源的淺層生長培養(yǎng)基對培養(yǎng)效果的影響

由表29可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子時培養(yǎng)效果較好，故本發(fā)明選取輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子。

(10)淺層生長培養(yǎng)基中生長因子輔酶Q10添加量

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸，并加入輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子，其中0.01g醋酸鈉、0.01g葉酸，輔酶Q10添加量分別為0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03g，滅菌后加入2.1mL 95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表30。

表30 不同輔酶Q10添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表30可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子時，輔酶Q10添加量為0.005g培養(yǎng)效果較好。

(11)淺層生長培養(yǎng)基中無機鹽醋酸鈉添加量

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸，并加入輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子，其中0.005g輔酶Q10、0.01g葉酸，醋酸鈉添加量分別為0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03g，滅菌后加入2.1mL 95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表31。

表31 不同醋酸鈉添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表31可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子時，醋酸鈉添加量為0.01g培養(yǎng)效果較好。

(12)淺層生長培養(yǎng)基中生長因子葉酸添加量

向每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸，并加入輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子，其中0.005g輔酶Q10、0.01g醋酸鈉，葉酸添加量分別為0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03g，滅菌后加入2.1mL 95％Vol食用酒精，作為淺層生長培養(yǎng)基。按照試驗4的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表32。

表32 不同葉酸添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表32可知，淺層生長培養(yǎng)基中使用輔酶Q10、醋酸鈉與葉酸作為無機鹽及生長因子時，葉酸添加量為0.005g培養(yǎng)效果較好。

綜合上述試驗結果，本發(fā)明最佳選擇淺層生長培養(yǎng)基的組成為：每100mL蒸餾水中加入6g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉、0.5g丙氨酸、0.005g輔酶Q10、0.01g醋酸鈉、0.005g葉酸，滅菌后再加入2.10mL體積分數(shù)為95％的食用酒精和1mL冰乙酸。

5、不同培養(yǎng)方法的培養(yǎng)效果

(1)三種醋酸菌培養(yǎng)方法得到菌懸液濃度對比

分別采用現(xiàn)有工廠醋酸菌生產(chǎn)中的液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)與液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)，以及本發(fā)明的液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)對二級擴大培養(yǎng)后的N-9醋酸菌菌懸液進行培養(yǎng)，其中液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)使用臺式水浴恒溫振蕩器(轉速150rpm)與往復式水浴恒溫振蕩器(轉速150rpm)，搖床培養(yǎng)方法同普通搖床培養(yǎng)；液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)使用發(fā)酵罐生物反應器(攪拌轉速200rpm)，發(fā)酵罐培養(yǎng)方法同發(fā)酵罐培養(yǎng)方法；液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)按照試驗4的裝置和方法培養(yǎng)醋酸菌。三種培養(yǎng)方法使用的培養(yǎng)基均為試驗4確定的最佳組成的淺層生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表33。

表33 不同培養(yǎng)裝置得到菌懸液濃度對比

由表33可知，本發(fā)明使用的液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)比現(xiàn)有工廠醋酸菌生產(chǎn)中的液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)與液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)方法更能得到高濃度的醋酸菌菌懸液。數(shù)據(jù)表明，液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)產(chǎn)生的醋酸菌菌懸液濃度為其他兩種方法的3.81～4.87倍。

(2)三種醋酸菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)過程中乙醇、乙酸含量變化情況

按照試驗5中(1)的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)時間為11d，在培養(yǎng)過程中每24h使用氣相色譜儀檢測各培養(yǎng)液的乙醇、乙酸含量(檢測方法與試驗1相同)。結果見表34與表35。

表34 不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)11d培養(yǎng)液中乙醇含量變化

表35 不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)11d培養(yǎng)液中乙酸含量變化

由表34與表35可知，液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)、液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)、液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)分別于第8d、第4d、第11d時培養(yǎng)液中乙醇含量明顯降低乙酸含量明顯升高。液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)中可觀察到培養(yǎng)液乙酸含量于第4d含量明顯升高，隨后出現(xiàn)波動變化，考慮到醋酸菌的生長可進行過氧化作用，即分解醋酸進而維持自身的生長代謝與繁殖，故該現(xiàn)象符合醋酸菌的生理生長變化情況。

綜上上述試驗結果可見，本發(fā)明液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)方法不論從最終菌體的濃度或同等培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質的使用情況上判斷，培養(yǎng)效果均明顯優(yōu)于其他二者。

(3)三種醋酸菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)醋酸菌菌體形態(tài)比較

將試驗5中(1)的3種培養(yǎng)方法所得到的醋酸菌收集后用掃描電子顯微鏡進行形態(tài)觀察對比，確定該菌在不同培養(yǎng)裝置中生長狀態(tài)，以確保菌株是否發(fā)生變異等情況。由圖2～圖4可知，液態(tài)搖床振蕩培養(yǎng)：細胞間連絲情況較明顯。液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)：細胞間連絲情況不明顯，細胞單體成膜結構較為明顯。液態(tài)發(fā)酵罐攪拌培養(yǎng)：除了細胞間有明顯連絲情況，也有少量細胞間成膜結構。經(jīng)革蘭氏染色與掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察可得出本發(fā)明液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)所得到的醋酸菌形態(tài)學觀察正常。

綜上所述，本發(fā)明液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)所得醋酸菌與傳統(tǒng)方法得到的醋酸菌等同，并且本發(fā)明方法能使醋酸菌的生產(chǎn)得到更大化發(fā)展，可實現(xiàn)人力資源使用量的大大減少，并且現(xiàn)有工廠生產(chǎn)中能輕易實現(xiàn)，具有節(jié)約能源、培養(yǎng)效率高、可機械化操作等優(yōu)點。

6、提高同批次產(chǎn)量的方法

考慮在培養(yǎng)過程中，通過補充培養(yǎng)基同時回收菌懸液的方式達到提高同批次產(chǎn)量的目的。并且經(jīng)前期對培養(yǎng)基的回收檢測試驗表明，培養(yǎng)基中損失較大物質為碳源與氮源，故應對培養(yǎng)基中的碳源與氮源進行適當補充。

矩形槽2的規(guī)格為長100cm、寬為15cm，出液管1的高度為4mm，恒流泵5流速為80L/h，矩形槽2的個數(shù)為4。其余零部件及零部件的連接關系與實施例1相同。在密閉條件下，將醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置用質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液熏蒸24小時，同時使用55W紫外滅菌燈輻照2小時，每立方米密閉空間里質量分數(shù)為95％的冰醋酸水溶液的使用量為150mL。將二級擴大培養(yǎng)后的菌懸液接入淺層生長培養(yǎng)基中，并將其轉入醋酸菌液態(tài)淺層循環(huán)培養(yǎng)裝置的淺層生長培養(yǎng)基儲存罐3中，再通過單向流加泵4泵入培養(yǎng)槽最上面一層矩形槽2內，待培養(yǎng)液逐級向下充滿矩形槽2且從最底部矩形槽2的出液管1流入加熱槽6的培養(yǎng)液高于加熱槽6下部的兩個出口后，關閉單向流加泵4，開啟加熱槽6加熱培養(yǎng)液使其維持在30±1℃，并開啟恒流泵5使加熱槽6和培養(yǎng)槽內的培養(yǎng)液循環(huán)流動。培養(yǎng)48小時后，開啟雙向流加泵7，向加熱槽6內泵入補充培養(yǎng)基儲存罐9中的補充培養(yǎng)基，其中雙向流加泵7的流速為14mL/h，補充培養(yǎng)基的泵入總體積為淺層生長培養(yǎng)基總體積的37.5％。培養(yǎng)72小時后，將雙向流加泵7的流速增加至28mL/h。開啟雙向流加泵7后，從加熱槽6泵出的菌懸液均流入菌懸液回收罐8內。培養(yǎng)96小時后通過OD₆₆₀測定菌濃度。

(1)補充培養(yǎng)基中混合碳源葡萄糖添加量

向每100mL蒸餾水中加入2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉，并分別加入1、2、3、4、5、6g葡萄糖，滅菌后加入2.10mL 95％Vol食用酒精，作為補充培養(yǎng)基。按照試驗6的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)72、96h時取樣通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表36。

表36 補充培養(yǎng)基中葡萄糖添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表36可知，補充培養(yǎng)基中使用葡萄糖與95％Vol食用酒精作為混合碳源時，葡萄糖添加量為2g培養(yǎng)效果較好。

(2)補充培養(yǎng)基中混合碳源95％Vol食用酒精添加量

向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、2g酵母提取物、2g大豆蛋白粉，滅菌后分別加入0.53、1.05、2.10、3.16、4.21、5.26mL 95％Vol食用酒精，作為補充培養(yǎng)基。按照試驗6的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)72、96h時取樣通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表37。

表37 補充培養(yǎng)基中95％Vol食用酒精添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表37可知，補充培養(yǎng)基中使用葡萄糖與95％Vol食用酒精作為混合碳源時，95％Vol食用酒精添加量為3.16mL培養(yǎng)效果較好。

(3)補充培養(yǎng)基中混合氮源酵母提取物添加量探究

向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、2g大豆蛋白粉，并分別加入0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0g酵母提取物，滅菌后加入3.16mL 95％Vol食用酒精，作為補充培養(yǎng)基。按照試驗6的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)72、96h時取樣通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表38。

表38 補充培養(yǎng)基中酵母提取物添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表38可知，補充培養(yǎng)基中使用酵母提取物與大豆蛋白粉作為混合氮源時，酵母提取物添加量為1.0g培養(yǎng)效果較好。

(4)補充培養(yǎng)基中混合氮源大豆蛋白粉添加量

向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、1g酵母提取物，并分別加入0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0g大豆蛋白粉，滅菌后加入3.16mL 95％Vol食用酒精，作為補充培養(yǎng)基。按照試驗6的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)72、96h時取樣通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表39。

表39 補充培養(yǎng)基中大豆蛋白粉添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表39可知，補充培養(yǎng)基中使用酵母提取物與大豆蛋白粉作為混合氮源時，大豆蛋白粉添加量為1.0g培養(yǎng)效果較好。

(5)補充培養(yǎng)基中堿性無機鹽的篩選

向每100mL蒸餾水中2g加入葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉，并分別加入4g氫氧化鈉、碳酸鈣、無水碳酸鈉、無水碳酸氫鈉作為唯一堿性無機鹽，滅菌后加入3.16mL 95％Vol食用酒精，作為補充培養(yǎng)基。按照試驗6的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)96h時取樣通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表40。

表40 補充培養(yǎng)基中堿性無機鹽種類對培養(yǎng)效果的影響

由表40可知，使用無水碳酸鈉和無水碳酸氫鈉作為堿性無機鹽時培養(yǎng)效果較好，考慮到碳酸氫銨不易保存且成本較高，故選取無水碳酸鈉作為培養(yǎng)基中的堿性無機鹽。

(6)補充培養(yǎng)基中堿性無機鹽無水碳酸鈉添加量

向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉，并分別加入1、3、5、7、9g無水碳酸鈉，滅菌后加入3.16mL 95％Vol食用酒精，作為補充培養(yǎng)基。按照試驗6的方法培養(yǎng)醋酸菌，培養(yǎng)72、96h時取樣通過OD₆₆₀測定菌濃度，結果見表41。

表41 補充培養(yǎng)基中無水碳酸鈉添加量對培養(yǎng)效果的影響

由表41可知，補充培養(yǎng)基中使用無水碳酸鈉作為堿性無機鹽時，無水碳酸鈉添加量為5g培養(yǎng)效果較好。

綜合上述試驗結果，本發(fā)明最佳選擇補充培養(yǎng)基的組成為：向每100mL蒸餾水中加入2g葡萄糖、1g酵母提取物、1g大豆蛋白粉、5g無水碳酸鈉，滅菌后再加入3.2mL體積分數(shù)為95％的食用酒精。