本申請是申請?zhí)枮?01380030602.5的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請pct/us2013/037579的中國國家階段申請。相關申請的交叉引用本申請要求對以下文件的優(yōu)先權：于2012年4月20日提交的美國申請序列號61/636,059；于2012年8月10日提交的美國申請序列號61/681,750；和于2013年3月14日提交的美國申請序列號61/782,838，每個文件都通過引用并入本文。本申請涉及新的治療肥胖的方法，具體地，涉及產(chǎn)熱的mirna調節(jié)劑。
背景技術：
：肥胖已經(jīng)達到了流行病的比例，影響到所有年齡段和社會經(jīng)濟群體。世界衛(wèi)生組織估計，在2008年，有15億20歲及以上的成年人超重，并且有超過2億的男性和超過3億的女性肥胖。據(jù)估計，到2030年，超重和肥胖個體的數(shù)據(jù)將分別增長至21.6億和11.2億。肥胖導致收入損失、活動天數(shù)受到限制、缺勤、工作效率低下(出勤)、生活質量下降、永久性失能、顯著的發(fā)病率和死亡率，以及壽命縮短。事實上，據(jù)估計，2009年美國和加拿大因醫(yī)療費用、過高的死亡率以及失能導致的超重和肥胖的年總經(jīng)濟費用為約3000億美元。國際研究顯示，肥胖癥的經(jīng)濟費用占總醫(yī)療費用的2％至10％。肥胖是由能量攝取與消耗之間的長期失衡造成的。這導致過多的能量儲存在脂肪細胞中，這樣的脂肪細胞通常表現(xiàn)出肥大(細胞體積增大)和增生(細胞數(shù)目或脂肪生成增加)二者。最近，肥胖的惡化源于過度消費含飽和脂肪和糖類的高能量密度食物結合體力活動的減少?，F(xiàn)有的肥胖的癥狀性醫(yī)藥治療不能達到長期治療的目的，這很大程度上是由于有限的藥物效力以及患者很少能堅持生活方式改變和治療所導致的。數(shù)種肥胖藥物已經(jīng)由于安全因素而被移出市場，而一些正在研發(fā)的小分子由于其不理想的短期療效和未知的安全性能(profile)正掙扎于獲取審批。目前，僅限制性肥胖治療(bariatric)手術和吸收不良性肥胖治療手術可實現(xiàn)顯著的長期減重并伴有一些有利的心血管益處。因此，本領域中需要新的治療肥胖的方法。技術實現(xiàn)要素：肥胖是能量攝取與消耗長期失衡的結果，導致過多的能量儲存進白色脂肪細胞中。本公開內容涉及肥胖的新治療方法，其靶向周圍脂肪細胞，包括儲存能量的填充有脂質的白色脂肪細胞(whiteadipocytes，wat)，以及消耗能量的富含線粒體的褐色脂肪細胞(brownadipocyte，bat)。此外，本公開內容提供了通過使用微小rna(mirorna，mirna)試劑來調節(jié)產(chǎn)熱(生物體中的熱產(chǎn)生過程)的方法。本文所描述的方法一般包括使用經(jīng)分離的mirna試劑直接和/或間接地調節(jié)細胞、組織和/或對象中的至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子(regulator)(例如，線粒體解偶聯(lián)劑(uncoupler)，如解偶聯(lián)蛋白1(uncouplingprotein1，ucp1還被稱為產(chǎn)熱素)或解偶聯(lián)蛋白2(ucp2))。ucp使氧化磷酸化與atp合成解偶聯(lián)。在某些情況下，該解偶聯(lián)反應導致能量作為熱消散。這樣的方法是特別有利的，因為它們允許減少對象身體中的脂肪，而無需所述對象必須通過節(jié)食調節(jié)其熱量攝入、改變身體活動或進行肥胖治療手術。因此，本發(fā)明的方法對治療或預防肥胖特別有用。本發(fā)明還提供了可調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子活性的新mirna試劑組合物(例如mirna、agomir和antagomir)。此外，本發(fā)明提供了篩選調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子活性的新mirna試劑的方法。此外，本發(fā)明還提供了提供mirna試劑的細胞/組織特異性遞送的新試劑組合物(例如，適配體(aptamer)-mirna復合物或“aptamir”)。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了調節(jié)細胞中的呼吸鏈解偶聯(lián)的方法，所述方法包括使細胞與調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的表達水平和/或活性的經(jīng)分離的mirna試劑接觸。在一些實施方案中，所述方法還包括選擇需要調節(jié)呼吸鏈解偶聯(lián)的對象(例如，肥胖患者)的步驟。在一個實施方案中，所述mirna試劑提高至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的表達水平和/或活性。在某些實施方案中，所述線粒體解偶聯(lián)劑是ucp1或ucp2。在一些實施方案中，所述方法在體內提高細胞中的呼吸鏈解偶聯(lián)。在另一些實施方案中，所述方法離體提高細胞中的呼吸鏈解偶聯(lián)。在某些實施方案中，所述方法還包括測定線粒體解偶聯(lián)劑的表達水平(mrna或蛋白質)或活性。在某些實施方案中，所述細胞是前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織來源的間充質干細胞、肝細胞、肌細胞或其前體。任選地，脂肪細胞可為白色脂肪細胞或褐色脂肪細胞。在另一個方面，本發(fā)明提供了調節(jié)組織中的產(chǎn)熱的方法，所述方法包括使組織與調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的表達水平和/或活性的經(jīng)分離的mirna試劑接觸。在一些實施方案中，所述方法還包括選擇需要調節(jié)產(chǎn)熱的對象(例如，肥胖患者)的步驟。在一個實施方案中，所述mirna試劑提高至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的表達水平和/或活性。在某些實施方案中，所述線粒體解偶聯(lián)劑是ucp1或ucp2。在某些實施方案中，所述方法包括提高產(chǎn)熱。在某些實施方案中，所述方法還包括測定線粒體解偶聯(lián)劑的表達水平(mrna或蛋白質)或活性。在某些實施方案中，所述組織是褐色脂肪組織、白色脂肪組織、皮下脂肪組織、肝或肌肉。在某些實施方案中，使所述組織與所述mirna試劑離體接觸。在另一個方面，本發(fā)明提供了治療需要此治療的人對象的肥胖的方法，所述方法一般包括向所述人對象施用有效量的調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑活性的mirna試劑。在某些實施方案中，所選擇用于治療的人對象具有肥胖的遺傳素質或表觀遺傳素質。在某些實施方案中，所述線粒體解偶聯(lián)劑是ucp1、ucp2或ucp3。在所有以上方面的某些實施方案中，所述mirna試劑是選自以下的經(jīng)分離的mirna：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、mir-19a-b、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、和hsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a。在所有以上方面的某些實施方案中，所述mirna試劑是與以上列出的mirna序列有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的經(jīng)分離的mirna試劑。在所有以上方面的某些實施方案中，所述mirna試劑是上文列出的mirna的種子序列(seedsequence)。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自表1中記載的536個mirna中的經(jīng)分離的mirna。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑是與表1中列出的mirna序列有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的經(jīng)分離的mirna試劑。在所有以上方面的某些實施方案中，所述mirna試劑是表1中列出的mirna的種子序列。表1.以升序列出的脂肪細胞mirna(mirbase19命名法)：在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自表11、13和14中記載的經(jīng)分離的mirna中的mirna。在所有以上方面的某些實施方案中，所述mirna試劑是與表1、11、13和14中列出的mirna序列有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的經(jīng)分離的mirna。在所有以上方面的某些實施方案中，所述mirna試劑是表11、13和14中列出的mirna的種子序列。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自表1中記載的mirna中的mirna的agomir或antagomir。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自以下的mirna的agomir或antagomir：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、mir-19a-b、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、andhsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自表11中記載的mirna中的mirna的agomir或antagomir。在所有上述方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-19b-2-5p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-130b-5p、hsa-mir-211、hsa-mir-325、hsa-mir-382-3p/5p、hsa-mir-543、hsa-mir-515-3p和hsa-mir-545。在所有上述方面的某些實施方案中，mirna試劑是選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-331-5p、hsa-mir-552、hsa-mir-620和hsa-mir-1179。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑與靶向部分(例如適配體)連接。在一個實施方案中，所述靶向部分將mirna試劑遞送至特定細胞類型或組織。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的mrna或啟動子區(qū)結合。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之mrna的5’utr或編碼序列結合。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之mrna的3’utr結合。在所有以上方面的某些實施方案中，mirna試劑調節(jié)線粒體解偶聯(lián)蛋白的激活蛋白(activator)或阻抑蛋白(repressor)的活性。在一個實施方案中，所述mirna試劑直接與激活蛋白或阻抑蛋白的mrna或啟動子區(qū)結合。在一個實施方案中，mirna試劑直接與激活蛋白或阻抑蛋白之mrna的5’utr或編碼序列結合。在一個實施方案中，mirna試劑直接與激活蛋白或阻抑蛋白之mrna的3’utr結合。在一個實施方案中，激活蛋白或阻抑蛋白選自列于表2中的組。在所有以上方面的某些實施方案中，上調線粒體解偶聯(lián)蛋白的mrna或蛋白質表達。在所有以上方面的某些實施方案中，上調線粒體解偶聯(lián)蛋白的線粒體解偶聯(lián)活性。在另一個方面，本發(fā)明提供了篩選調節(jié)產(chǎn)熱的mirna試劑的方法，所述方法一般包括：提供指示細胞(indicatorcell)；使所述指示細胞與受試mirna試劑接觸；以及在存在及不存在所述mirna試劑的情況下，測定所述指示細胞中的至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子的細胞活性，其中，所述產(chǎn)熱調節(jié)子活性在存在所述受試mirna試劑的情況下的改變將所述受試mirna試劑鑒定為調節(jié)產(chǎn)熱的mirna試劑。所述指示細胞可為哺乳動物細胞。在某些實施方案中，所述指示細胞是包含至少部分人基因組的人細胞。在某些實施方案中，所述細胞是前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織來源的間充質干細胞、肝細胞、肌細胞或其前體。在某些實施方案中，在該方法中測定的產(chǎn)熱調節(jié)子細胞活性是所述產(chǎn)熱調節(jié)子的mrna表達水平、蛋白質表達水平或線粒體解偶聯(lián)活性。在某些實施方案中，與不存在受試mirna試劑的條件下產(chǎn)熱調節(jié)子的活性水平相比，受試mirna試劑提高了產(chǎn)熱調節(jié)子的活性。在某些實施方案中，產(chǎn)熱調節(jié)子是ucp1或ucp2。在另一個方面，本發(fā)明提供了調節(jié)細胞中的至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子活性的agomir或antagomir。在某些實施方案中，agomir或antagomir是選自表11、13和14中所記載mirna的mirna的agomir或antagomir。在某些實施方案中，agomir或antagomir是選自表1中所記載mirna的mirna的agomir或antagomir。在某些實施方案中，agomir或antagomir是選自以下的mirna的agomir或antagomir：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、mir-19a-b、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsr-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、和hsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a。在某些實施方案中，agomir或antagomir是選自以下的mirna的agomir或antagomir：hsa-mir-19b-2-5p、ha-mir-21-5p、hsa-mir-130b-5p、hsa-mir-211、hsa-mir-325、hsa-mir-382-3p/5p、hsa-mir-543、hsa-mir-515-3p和hsa-mir-545。在某些實施方案中，agomir或antagomir是選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-331-5p、hsa-mir-552、hsa-mir-620和hsa-mir-1179。在某些實施方案中，agomir或antagomir與靶向部分連接。在某些實施方案中，靶向部分是適配體。在某些實施方案中，靶向部分將所述agomir或antagomir遞送至特定細胞類型或組織。在某些實施方案中，agomir或antagomir直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的mrna或啟動子區(qū)結合。在某些實施方案中，agomir或antagomir直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之mrna的5’utr或編碼序列結合。在某些實施方案中，agomir或antagomir直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之mrna的3’utr結合。在某些實施方案中，agomir或antagomir調節(jié)線粒體解偶聯(lián)蛋白的激活蛋白或阻抑蛋白的活性。在某些實施方案中，激活蛋白或阻抑蛋白選自列于表2中的組。在某些實施方案中，agomir或antagomir直接與激活蛋白或阻抑蛋白的mrna或啟動子區(qū)結合。在某些實施方案中，agomir或antagomir直接與激活蛋白或阻抑蛋白之mrna的5’utr或編碼序列結合。在另一些實施方案中，agomir或antagomir直接與激活蛋白或阻抑蛋白之mrna的3’utr結合。本公開內容還提供了藥物組合物，其包含選自以下的兩種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。在某些實施方案中，所述藥物組合物還包含可藥用賦形劑。在某些實施方案中，所述兩種或更多種mirna由重組載體表達。所述重組載體可選自dna質粒、病毒載體和dna微環(huán)。本公開內容還提供了誘導前脂肪細胞先分化成白色脂肪細胞并且隨后分化成褐色脂肪細胞的方法，其包括向前體脂肪細胞群施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。所述一種或更多種mirna還可選自hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。在某些實施方案中，使前脂肪細胞分化成脂肪細胞的誘導大于當將前脂肪細胞暴露于100nm羅格列酮兩天隨后暴露于維持培養(yǎng)基中時得到的前脂肪細胞向脂肪細胞的分化。在某些實施方案中，所述脂肪細胞是褐色脂肪細胞。在另一些實施方案中，所述脂肪細胞是白色脂肪細胞。其他分化標準可在下文的實施例中找到。本公開內容還提供了用于降低脂肪細胞的脂質含量的方法，其包括向脂肪細胞群施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。在某些實施方案中，所述脂肪細胞中的脂質含量小于暴露于100nm羅格列酮兩天隨后暴露于維持培養(yǎng)基中的脂肪細胞中的脂質含量，或者小于在培養(yǎng)持續(xù)時間內暴露于100nm羅格列酮的脂肪細胞的脂肪含量。培養(yǎng)持續(xù)時間可為8天至16天、10天至14天或者14天。培養(yǎng)持續(xù)時間還可為8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。脂肪細胞之脂質含量的另外的標準可在下文的實施例中找到。本公開內容還提供了用于在有此需要的對象中提高胰島素敏感性的方法，其包括向所述對象施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。在某些實施方案中，所述對象是哺乳動物。本公開內容還提供了提高細胞中的一種或更多種解偶聯(lián)蛋白之表達或活性的方法，其包括向所述細胞施用選自hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir的一種或更多種、兩種或多于兩種或者三種或多于三種mirna。在某些實施方案中，所述細胞選自褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝細胞或者肌肉細胞。在另一些實施方案中，所述一種或更多種解偶聯(lián)蛋白包括ucp1或者ucp2。在某些實施方案中，所述方法是離體方法。在另一些實施方案中，所述方法是體內方法。在某些實施方案中，所述方法包括選擇需要提高一種或更多種解偶聯(lián)蛋白(例如ucp1、ucp2)之表達水平或活性水平的對象(例如，人)。在一些實施方案中，所述對象患有肥胖或者有發(fā)展成肥胖的風險。在某些實施方案中，所述對象患有糖尿病或者有發(fā)展成糖尿病的風險。在某些實施方案中，所述方法還包括測定一種或更多種解偶聯(lián)蛋白的表達水平(mrna或蛋白質)或活性。本公開內容還提供了引起有此需要之對象中的脂肪消耗的方法，其包括向所述對象施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。在某些實施方案中，所述對象是哺乳動物。在另一些實施方案中，所述哺乳動物是人。附圖說明圖1a和1b是使用string9.0數(shù)據(jù)庫在兩種不同嚴格(stringency)水平上確定的83種產(chǎn)熱調節(jié)子相互作用的示意圖。圖2a是使用ingenuitypathwayanalysissoftware程序確定的83種產(chǎn)熱調節(jié)子相互作用的示意圖。圖2b是使用reactomefunctionalinteractionnetwork程序確定的83種產(chǎn)熱調節(jié)子相互作用的示意圖。圖3是多種mirna預測程序預測的人ucp1基因的5’utr、啟動子區(qū)、編碼序列和3’utr的mirna結合位點的結果的重疊示意圖。圖4是多種mirna預測程序預測的83種產(chǎn)熱調節(jié)子基因的5’utr、啟動子區(qū)、編碼序列和3’utr的mirna結合位點的結果的重疊示意圖。圖5是線粒體中氧化磷酸化的示意圖，描述通過ucp1使氧化磷酸化與atp合成解偶聯(lián)以產(chǎn)生熱。圖6描述了由另一些示例性產(chǎn)熱調節(jié)子對ucp1進行的轉錄控制。圖7描述了ucp1基因轉錄的示例性正性(a)轉錄調節(jié)子和負性(b)轉錄調節(jié)子。圖8a描述了人ucp1基因的15,910個堿基對(bp)序列(ncbi參考序列：gi|237858805|ref|ng_012139.1|人解偶聯(lián)蛋白1(線粒體、質子載體)(ucp1)，4號染色體上的refseqgene)中多種調控元件相對于ucp1轉錄起始位點(第5,001位)的位置。圖8b描述了人ucp2基因的15,174bp序列(ensg00000175567)(包含11號染色體上的5,000bp5’utr和2,000bp3’utr)中多種調控元件相對于轉錄起始位點(第5,001位)的位置。圖9是示出未標記的前脂肪細胞或者經(jīng)dy547-標記的非靶向mirna模擬物或發(fā)夾抑制劑轉染的前脂肪細胞中的相對熒光的條形圖。圖10a是示出經(jīng)sirna對照和gapdhsirna轉染的前脂肪細胞在轉染4天后gapdh基因表達降低的條形圖。圖10b是示出經(jīng)sirna對照和gapdhsirna轉染的前脂肪細胞在轉染12天后gapdh基因表達降低的條形圖。圖11a是單獨在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后的前脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片(micrograph)。圖11b是在胰島素、三-碘甲狀腺原氨酸(tri-iodothyronine)、地塞米松、異丁基-甲基黃嘌呤和羅格列酮的存在下培養(yǎng)兩天隨后在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天的前脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖11c是實驗中始終在胰島素、三-碘甲狀腺原氨酸、地塞米松、異丁基-甲基黃嘌呤和羅格列酮的存在下培養(yǎng)的前脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖11d是在hsa-mir-30b模擬物的存在下培養(yǎng)的前脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖11e是在非靶向mirna模擬物的存在下培養(yǎng)的前脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖11f是在非靶向mirna抑制劑的存在下培養(yǎng)的前脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖12a是示出在羅格列酮的存在下產(chǎn)熱靶標的mrna表達的條形圖。圖12b是示出在hsa-let-7a抑制劑的存在下產(chǎn)熱靶標的mrna表達的條形圖。圖12c是示出在hsa-mir-1模擬物的存在下產(chǎn)熱靶標的mrna表達的條形圖。圖12d是示出在hsa-mir-19b模擬物的存在下產(chǎn)熱靶標的mrna表達的條形圖。圖12e是示出在hsa-mir-30b模擬物的存在下產(chǎn)熱靶標的mrna表達的條形圖。圖12f是示出未經(jīng)處理的前脂肪細胞中產(chǎn)熱靶標的mrna表達的條形圖。圖13是示出x軸上的平均基因表達和y軸上的堿基對之間的對數(shù)級差異的m-a圖(plot)。圖14是示出維恩圖的示意圖，其示出在mirna類似物hsa-let-7a抑制劑、hsa-mir-1模擬物、hsa-mir-19b模擬物和hsa-mir-30b模擬物的存在下，顯著上調的基因數(shù)分別是305、247、255和267。127個基因的組通常被所列的mirna類似物上調。圖15是示出維恩圖的示意圖，其示出在mirna類似物hsa-let-7a抑制劑、hsa-mir-1模擬物、hsa-mir-19b模擬物和hsa-mir-30b模擬物的存在下，顯著下調的基因數(shù)分別是143、177、115和165。60個基因的組通常被所列的mirna類似物下調。圖16是示出未標記的脂肪細胞或者經(jīng)dy547-標記的非靶向miridian模擬物或發(fā)夾抑制劑轉染的脂肪細胞中的相對熒光的條形圖。圖17a是示出經(jīng)sirna對照和gapdhsirna轉染的細胞在轉染4天后gapdh基因表達降低的條形圖。圖17b是示出經(jīng)sirna對照和gapdhsirna轉染的細胞在轉染12天后gapdh基因表達降低的條形圖。圖18a是單獨在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后的成熟脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖18b是在羅格列酮的存在下培養(yǎng)兩周的成熟脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖18c是在非靶向mirna的存在下培養(yǎng)的成熟脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖18d是在hsa-mir-30b模擬物的存在下培養(yǎng)的成熟脂肪細胞用油紅o染色的光學顯微照片。圖19是示出暴露于多種mirna類似物或羅格列酮的成熟脂肪細胞中脂質(尼羅紅(nilered)熒光染料)的量的條形圖。圖20是示出從暴露于多種轉染試劑的成熟脂肪細胞中提取的rna總量的條形圖。圖21是示出使用多種轉染試劑用gapdh特異性的mirna模擬物轉染的成熟脂肪細胞中gapdh基因表達降低的條形圖。圖22示出在單獨的維持培養(yǎng)基(對照)、50nmhsa-let-7a抑制劑、10μmβ腎上腺素能受體激動劑cl316，243、50nmhsa-mir-1模擬物、10nm甲狀腺激素三-碘甲狀腺原氨酸、50nmhsa-mir-19b模擬物、100nm羅格列酮或50nmhsa-mir-30b模擬物中培養(yǎng)兩周的成熟脂肪細胞的明場顯微照片。圖23是用于分離特異性針對人細胞表面獨特靶標的適配體的cell-selex方法的示意圖。圖24描述了評價所選的熒光適配體與人肝細胞和脂肪細胞結合的facs實驗的結果。具體實施方式i.定義除非另有定義，否則本文所用的所有技術術語和科學術語都具有由本發(fā)明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同的含義。在相抵觸的情況下，以本申請(包括定義)為準。本文所用術語“mirna試劑”是指直接或間接調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子(例如線粒體解偶聯(lián)劑或其或激活蛋白或阻抑蛋白)活性的寡核苷酸或寡核苷酸模擬物。mirna試劑可作用于靶基因或靶mirna。本文所用術語“mirna”是指能夠與靶基因(mrna或dna)結合并調節(jié)該基因表達的單鏈rna分子(或其合成衍生物)。在某些實施方案中，mirna天然表達于生物體中。本文所用術語“種子序列”是指mirna5’端的前8個核苷酸(nt)內的6至8個核苷酸至個核苷酸長的子串(substring)(即，種子序列)，其為靶標特異性的重要決定因素。本文所用術語“agomir”是指功能上模擬mirna的合成寡核苷酸或寡核苷酸模擬物(oligonucleotidemimetic)。agomir可為與mirna或mirna的一部分具有相同或相似的核酸序列的寡核苷酸。在某些實施方案中agomir與其所模擬的mirna具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異。此外，與其所模擬的mirna相比，agomir還可具有相同的長度、更長的長度或更短的長度。在某些實施方案中，agomir具有與其所模擬的mirna5’端的6至8個核苷酸相同的序列。在另一些實施方案中，agomir的長度可為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在另一些實施方案中，agomir的長度可為5至10個核苷酸、6至8個核苷酸、10至20個核苷酸、10至15個核苷酸或5至500個核苷酸。在某些實施方案中，agomir包含表1、11、13和14中所示的任意序列。這些經(jīng)化學修飾的合成rna雙鏈包含與目的mirna相同或基本相同的引導鏈，以允許有效地加載進mirisc復合物中，而過客鏈(passengerstrand)經(jīng)化學修飾以防止其加載到mirisc復合物的argonaute蛋白中(thorsensb等，cancerj.，18(3)：275-284(2012)；broderickja等，genether.，18(12)：1104-1110(2011))。本文所用術語“antagomir”是指具有與特定的微小rna互補并且抑制該mirna活性的合成寡核苷酸或寡核苷酸模擬物。在某些實施方案中，antagomir與其所抑制的mirna具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸差異。此外，與其所抑制的mirna相比，antagomir還可具有相同的長度、更長的長度或更短的長度。在某些實施方案中，所述antagomir與其所抑制的mirna5’端的6至8個核苷酸雜交。在另一些實施方案中，antagomir的長度可為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在另一些實施方案中，antagomir的長度可為5至10個核苷酸、6至8個核苷酸、10至20個核苷酸、10至15個核苷酸或5至500個核苷酸。在某些實施方案中，antagomir包含與表1、11、13和14中所示的任意序列互補的核苷酸。antagomir是與特定mirna緊密結合并使其失活的合成的反向互補。使用多種化學修飾以改進核酸酶抗性和結合親和力。最常用的提高效價的修飾包括多種2’糖修飾，例如2’-o-me、2’-o-甲氧基乙基(2’-moe)或2’-氟代(2’-f)。mirna的核酸結構還可修飾成鎖核酸(lna)，其中在2’氧和4’碳之間具有亞甲基橋從而將核糖鎖定為a型核酸構象的3’-內(north)構象(lennoxka等，genether.dec2011；18(12)：1111-1120；baderag等，genether.dec2011；18(12)：1121-1126)。該修飾顯著提高分子的靶特異性和雜交性質二者。本文所用術語“aptamir”是指適配體(與特定靶分子結合的寡核苷酸或肽分子)與如上文定義的agomir或antagomir的組合，其允許mirna試劑的細胞特異性遞送或組織特異性遞送。本文所用術語“干擾rna”是指能夠通過介導rna干擾來抑制或下調基因表達的任何雙鏈rna序列或單鏈rna序列。干擾rna包括但不限于小干擾rna(“sirna”)和小發(fā)夾rna(“shrna”)?！皉na干擾”是指序列匹配(compatible)的信使rna轉錄物的選擇性降解。本文所用術語“小干擾rna”或“sirna”是指能夠通過以序列特異性的方式介導rna干擾來抑制或下調基因表達的任何小rna分子。所述小rna的長度可為例如約16至21個核苷酸。本文所用術語“shrna”(小發(fā)夾rna)是指包含反義區(qū)、環(huán)部分和正義區(qū)的rna分子，其中所述正義區(qū)具有與所述反義區(qū)進行堿基配對的互補核苷酸以形成雙鏈的莖。在轉錄后加工后，小發(fā)夾rna通過由rna酶iii家族成員酶dicer介導的切割事件轉變成小干擾rna(sirna)。本文所用術語“反義寡核苷酸”是指與dna序列或mrna序列(例如mirna)互補的合成寡核苷酸或寡核苷酸模擬物。本文所用術語“mir-掩蔽物(mask)”是指與靶mrna中的mirna結合位點互補并且用于抑制mirna與該mrna結合位點結合的單鏈反義寡核苷酸。參見例如，xiao等，“novelapproachesforgene-specificinterferenceviamanipulatingactionsofmicrornas：examinationonthepacemakerchannelgeneshcn2andhcn4，”journalofcellularphysiology，第212卷，第2期，第285-292頁，2007，其整體并入本文。本文所用術語“mirna海綿”是指包含目的mirna的多個串聯(lián)結合位點并且用于去除(titrateout)內源性目的mirna以抑制目的mirna與其內源靶標結合的合成核酸(例如mrna轉錄物)。參見例如，ebert等，“micrornasponges：competitiveinhibitorsofsmallrnasinmammaliancells，”naturemethods，第4卷，第9期，第721-726頁，2007，其整體并入本文。本文所用術語“呼吸鏈解偶聯(lián)”是指使線粒體的內膜質子梯度消失從而阻止線粒體中通過氧化磷酸化來合成atp。本文所用術語“線粒體解偶聯(lián)劑”是指可使線粒體內膜質子梯度消失從而阻止線粒體中通過氧化磷酸化來合成atp的蛋白質(或編碼核酸)。示例性的線粒體解偶聯(lián)劑包括ucp1和ucp2。本文所用術語線粒體解偶聯(lián)劑的“激活蛋白”或“阻抑蛋白”是指分別用于上調或下調線粒體解偶聯(lián)劑活性的蛋白質。本文所用術語“產(chǎn)熱調節(jié)子”是指直接或間接調控產(chǎn)熱的蛋白質(或編碼核酸)。該術語涵蓋線粒體線粒體解偶聯(lián)劑，以及還涵蓋線粒體解偶聯(lián)劑的激活蛋白和阻抑蛋白。示例性的產(chǎn)熱調節(jié)子記載于本文的表2中。本文所用術語“調節(jié)”是指使參數(shù)提高或降低。例如，調節(jié)蛋白質的活性可為使蛋白質的活性提高或降低。本文所用術語線粒體解偶聯(lián)劑或產(chǎn)熱調節(jié)子的“活性”是指任何可測量的生物學活性，包括但不限于，mrna表達、蛋白質表達或呼吸鏈解偶聯(lián)。mirna試劑組合物的“有效量”是足以在人中有效治療或預防病癥或控制生理學癥狀(condition)的量。在某些實施方案中，該生理學癥狀是肥胖?！皩ο蟆笔羌棺祫游?，包括哺乳綱的任何成員，包括人、家養(yǎng)動物和農場動物、動物園動物、運動場動物或寵物，例如小鼠、兔子、豬、綿羊、山羊、牛和高等靈長類。術語“哺乳動物”是指哺乳綱的任何成員，包括嚙齒類、靈長類、犬、貓、駱駝科動物(camelid)和有蹄類。術語“嚙齒類”是指作為嚙齒目成員的任何種，包括小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠和兔子。術語“靈長類”是指作為靈長目成員的任何種，包括猴子、猿和人。術語“駱駝科動物”是指作為駱駝科家族成員的任何種，包括駱駝和美洲駝(llama)。術語“有蹄類”是指作為有蹄超目成員的任何種，包括牛、馬和駱駝科動物。根據(jù)一些實施方案，哺乳動物是人類。本文所用的“治療”定義為以治療、治愈、緩解、減輕、改變、補救、改善、改良或影響該疾病或病癥、疾病或病癥的癥狀或對疾病的易感性為目的，將治療劑(例如mirna試劑或載體或編碼它們的轉基因)應用或施用于患者，或將治療劑應用或施用于從患有疾病或病癥、疾病或病癥的癥狀或者具有對疾病或病癥的素質的患者分離的組織或細胞系。本文所用的“藥物基因組學”是指基因組學技術例如基因測序、統(tǒng)計遺傳學和基因表達分析在對臨床開發(fā)中和市售的藥物的應用。更具體地，該術語是指患者的基因如何決定他或她對藥物的響應的研究(例如，患者的“藥物響應表型”，或“藥物響應基因型”)。mirna試劑組合物的“有效量”是足以在人中有效治療或預防疾病或控制生理學病癥的量。ii.產(chǎn)熱和肥胖在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于調節(jié)產(chǎn)熱的方法。這些方法一般包括使細胞或組織與調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑(例如ucp1和/或ucp2)活性的mirna試劑接觸。這樣的方法和組合物對治療肥胖特別有用。哺乳動物脂肪細胞可基于其功能性質分為兩大類：1)儲存和釋放能量的填充有脂質的白色脂肪細胞(wat)，以及；2)消耗能量并產(chǎn)生熱的富含線粒體的褐色脂肪細胞(bat)。直至最近，認為bat在幼兒期經(jīng)歷了快速的退化，在成年人中僅留下殘余的量。然而，在人體中用示蹤劑18f-氟脫氧葡萄糖(18f-fdg)進行的正電子發(fā)射斷層成像(pet)研究證實：1)成年對象的頸部、鎖骨上、腋部和椎旁區(qū)域中仍然存在多個bat儲庫；2)成年人的bat可通過暴露于冷溫度而被迅速激活；3)bat的活性與年齡、體重指數(shù)(bmi)、身體脂肪百分比、空腹血漿葡萄糖水平、β-阻滯劑的使用以及室外溫度反相關；并且4)bat的增加(expansion)可驅動與產(chǎn)生兒茶酚胺的嗜鉻細胞瘤相關的重量減輕，但是已經(jīng)將導致受體功能降低的β3-腎上腺素能受體多態(tài)性與體重增加和2型糖尿病的早期發(fā)作聯(lián)系到一起。雖然wat和bat來源于間充質干細胞，但是它們具有不同的譜系，其中myf5(肌源性調節(jié)因子5)(也在骨骼肌祖細胞中表達)、pgc-1α和prdm16(含pr-結構域的16)的表達將褐色脂肪細胞前體與白色脂肪細胞前體區(qū)分開來。除了典型的褐色脂肪細胞外，在wat占優(yōu)勢的組織中還可誘導不同類型的褐色脂肪細胞。創(chuàng)造了術語“白中褐(brite)”(白色中的褐色)脂肪細胞，并且wat儲庫中的褐色樣脂肪細胞的外觀與改進的代謝表型有關。bat質量和/或活性的提高提供了對肥胖一定程度的預防。bat的產(chǎn)熱量為300w/g，相比之下，所有其他組織中的產(chǎn)熱量為1w/g。因為少至50gbat就將占有20％的日常能量消耗，所以對能量平衡產(chǎn)生顯著影響僅需要相對有限量的bat。據(jù)推測，在一個對象的鎖骨上/頸旁的儲庫中發(fā)現(xiàn)的大約63gbat在1年內可消耗掉的能量等于4.1kgwat。線粒體解偶聯(lián)蛋白(ucp)是線粒體陰離子載體蛋白質(macp)家族的成員。ucp使氧化磷酸化與atp合成分開，使能量作為熱散失(也稱為“線粒體質子泄漏”)。ucp促進陰離子從線粒體的內膜向外膜轉移和從線粒體外膜向內膜的返回傳遞，在該過程中產(chǎn)生熱。ucp是負責產(chǎn)熱和熱耗散的主要蛋白質。解偶聯(lián)蛋白1(ucp1)也稱為產(chǎn)熱素，是負責產(chǎn)熱和熱耗散的bat特異性蛋白質。ucp2是同樣在脂肪細胞中表達的另一種解偶聯(lián)蛋白。ucp是產(chǎn)熱調節(jié)蛋白網(wǎng)絡的一部分(參見圖1)。示例性的產(chǎn)熱調節(jié)子記載于表2中。調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子以誘導bat分化和/或線粒體解偶聯(lián)蛋白提供了在對象中誘導產(chǎn)熱從而治療肥胖的方法。然而，化學藥理學方法不能靶向這些分子，因為它們不屬于傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)的“可用藥空間(druggablespace)”占主導地位的典型“靶標類型”(激酶、離子通道、g蛋白偶聯(lián)受體等)。因此，本發(fā)明提供了使用mirna試劑來調節(jié)這些產(chǎn)熱調節(jié)子的新方法和組合物。在某些實施方案中，使用mirna試劑來上調線粒體解偶聯(lián)劑的活性(例如，mrna表達水平、蛋白質表達水平或線粒體解偶聯(lián)活性)。線粒體解偶聯(lián)劑的上調可通過幾種方式實現(xiàn)。在一個實施方案中，mirna試劑直接抑制負責下調線粒體解偶聯(lián)劑之活性(例如，mrna表達水平、蛋白質表達水平)的天然mirna的活性。在另一個實施方案中，mirna試劑上調線粒體解偶聯(lián)劑之激活蛋白的活性(例如，mrna表達水平或蛋白質表達水平)。該上調可例如通過直接抑制負責下調該激活蛋白表達的天然mirna的活性來實現(xiàn)。在另一個實施方案中，mirna試劑下調線粒體解偶聯(lián)劑之阻抑蛋白的活性(例如，mrna表達水平或蛋白質表達水平)。該下調可例如通過使用mirna試劑直接抑制線粒體解偶聯(lián)劑之阻抑蛋白的表達來實現(xiàn)。在某些實施方案中，使用能夠同時調節(jié)多種產(chǎn)熱調節(jié)子活性的mirna試劑(與通用mirna試劑相反的通路特異性mirna試劑)。例如，可使用與多種產(chǎn)熱調節(jié)子結合的單一mirna、agomir或antagomir。該方法是特別有利的，因為其允許使用單一mirna試劑來調節(jié)整個信號通路中的多個成員。在某些實施方案中，使用多種抑制性mirna試劑(例如，antagomir或mir掩蔽物)。這些抑制性mirna試劑可具有相同的mirna靶標或不同的mirna靶標。iii.mirna試劑在某些實施方案中，本發(fā)明使用mirna試劑來調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子(例如，線粒體解偶聯(lián)劑，如ucp1和/或ucp2)。適用于本文所公開方法的mirna試劑包括但不限于：mirna、agomir、antagomir、mir-掩蔽物、mirna-海綿、sirna(單鏈或雙鏈的)、shrna、反義寡核苷酸、核酶或與靶核酸的至少一部分雜交并調節(jié)其功能的其他寡核苷酸模擬物。在某些實施方案中，所述mirna試劑是mirna分子或其合成衍生物(例如agomir)。在一個具體實施方案中，所述mirna試劑是mirna。mirna是存在于包括哺乳動物在內的多種生物體中的一類非編碼的小rna(例如，18至24個核苷酸)，并且其在進化上是保守的。mirna通過由rna酶iii酶drosha和dicer的順序切割來加工來源于初級轉錄物的約70個核苷酸的發(fā)夾前體而得到。許多mirna可在基因間區(qū)編碼，位于前mrna的內含子中或位于ncrna基因內。許多mirna還傾向于成簇分布并轉錄為多順反子，并且經(jīng)常具有相似的時空表達模式。一般而言，mirna是轉錄后調節(jié)子，其與靶基因(mrna或dna)上的互補序列結合，通過例如轉錄抑制或靶向降解來導致基因沉默。一種mirna可同時靶向多個不同基因。用于所公開方法的示例性mirna分子包括但不限于：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-19a-b、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-3658、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、andhsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。在另一些實施方案中，用于所公開方法的示例性mirna分子是本文的表1、11、13和14中所公開的mirna。在一個特定實施方案中，所述mirna試劑是人mir-22或其功能性衍生物。在另一個特定實施方案中，所述mirna試劑是agomir?？墒褂帽疚墓_的篩選方法來鑒定特定mirna的agomir。在一個特定實施方案中，agomir是人mir-22的功能模擬物(davidsonbl等，nat.rev.genet.，12(5)：329-340(2011))。在某些實施方案中，所述mirna試劑是抑制一種或更多種mirna活性的寡核苷酸或寡核苷酸模擬物。這樣的分子實例包括但不限于antagomir、干擾rna、反義寡核苷酸、核酶、mirna海綿和mir-掩蔽物。在一個特定實施方案中，所述mirna試劑是antagomir。一般而言，antagomir是經(jīng)化學修飾的反義寡核苷酸，其與靶mirna結合并通過阻止該mirna與其同源基因靶標結合來抑制mirna的功能。antagomir可包含本領域已知的任何堿基修飾。在一個特定實施方案中，antagomir抑制人mir-22的活性(vanrooije等，circ.res.，110(3)：496-507(2012)；sneadnm等，nucleicacidther.，22(3)：139-146(2012)；czechmp等，nat.rev.endocrinol.，7(8)：473-484(2011))。在某些實施方案中，所述mirna試劑的長度為10至50個核苷酸。本領域普通技術人員應理解，這體現(xiàn)在寡核苷酸具有長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個或其中任意范圍個核苷酸的反義部分。在某些實施方案中，所述mirna試劑是嵌合寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學上不同的區(qū)域，每個區(qū)域由至少一個核苷酸構成。這些寡核苷酸通常包含賦予一種或更多種有益性質(例如，提高核酸酶抗性、提高進入細胞的攝取、提高與靶標的結合親和力)的至少一個經(jīng)修飾的核苷酸區(qū)域，以及作為使酶能夠切割rna：dna或rna：rna雜合體(hybrid)的底物的區(qū)域。本發(fā)明的嵌合抑制性核酸可形成為由上述兩種或更多種寡核苷酸、經(jīng)修飾的寡核苷酸、寡聚核苷(oligonucleoside)和/或寡核苷酸模擬物組成的復合結構。這樣的化合物在本領域也被稱為雜合體或缺口體(gapmer)，教導制備這樣的雜合體結構的代表性美國專利包括但不限于以下美國專利no：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；以及5,700,922，其分別通過引用整體并入本文。在某些實施方案中，所述mirna試劑包含至少一種在糖的2＇位經(jīng)修飾的核苷酸，最優(yōu)選經(jīng)2＇-o-烷基、2＇-o-烷基-o-烷基或2＇-氟代修飾的核苷酸。在另一些優(yōu)選實施方案中，rna修飾包括嘧啶的核糖、堿基殘基或rna3＇端的反向堿基上的2＇-氟代、2＇-氨基以及2＇-o-甲基修飾。寡核苷酸中常規(guī)地并入這樣的修飾，并且這些寡核苷酸比2＇-脫氧寡核苷酸示出了針對指定靶標的更高tm(即，更高的靶向結合親和力)。已經(jīng)示出許多核苷酸和核苷修飾以得到更加抗核酸酶消化的寡核苷酸，從而延長體內半衰期。經(jīng)修飾寡核苷酸的具體實例包括包含含有例如以下之骨架的那些：硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷酸甲酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵(intersugarlinkage)或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵。最優(yōu)選的是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架的寡核苷酸，所述雜原子骨架特別是：ch2-nh-o-ch2、ch2～n(ch3)～o～ch2(稱為亞甲基(甲基亞氨基)或mmi骨架]、ch2-o-n(ch3)-ch2、ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2和o-n(ch3)-ch2-ch2骨架，其中天然的磷酸二酯骨架表示為o-p-o-ch)；酰胺骨架(參見demesmaeker等.ace.chem.res.1995，28：366-374)；嗎啉基骨架結構(參見summerton和weller，美國專利no.5,034,506)；肽核酸(pna)骨架(其中，寡核苷酸的磷酸二酯骨架由聚酰胺骨架替代，核苷酸直接或間接與聚酰胺骨架的氮雜氮原子結合，參見nielsen等，science1991，254，1497)，各自通過引用整體并入本文。含磷連接包括但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3＇亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯在內的甲基膦酸酯或其他烷基膦酸酯、次膦酸酯、包括3＇-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在內的氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硼烷磷酸酯、以及這些物質的具有正常3＇-5＇連接、2＇-5＇連接的類似物，以及具有反轉極性的那些(其中相鄰核苷單元對連接從3＇-5＇變成5＇-3＇或者從2＇-5＇變成5＇-2＇)；參見美國專利no.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，其各自通過引用整體并入本文。基于嗎啉基的寡聚化合物描述在dwainea.braasch和davidr.corey，biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)；genesis，2001年第30卷第3期；heasman，j.，dev.biol.，2002，243，209-214；nasevicius等，nat.genet.，2000，26，216-220；lacerra等，proc.natl.acad.sci.，2000，97，9591-9596；以及1991年7月23日出版的美國專利no.5,034,506中，其各自通過引用整體并入本文。環(huán)己烯基核酸寡核苷酸模擬物描述在wang等，j.am.chem.soc.，2000，122，8595-8602中，其內容通過引用整體并入本文。其中不包含磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷酸間連接、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷酸間連接或者一種或更多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷酸間連接形成的骨架。這些包含具有以下結構的那些：嗎啉基連接(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫醚、亞砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙?；羌?；亞甲基甲酰乙?；蛠喖谆虼柞Ｒ阴；羌?；含烯烴骨架；氨基磺酸酯骨架、亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及混合了n、o、s和ch2組成部分的其他骨架；參見美國專利no.5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437以及5,677,439,其各自通過引用整體并入本文。在某些實施方案中，mirna試劑包含一種或更多種經(jīng)取代的糖部分，例如在2＇位置的以下的一種：oh、sh、sch3、f、ocn、och3och3、och3o(ch2)nch3、o(ch2)nnh2或o(ch2)nch3，其中n為1至約10；ci至cio低級烷基、烷氧基烷氧基、經(jīng)取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；ci；br；cn；cf3；ocf3；o-烷基、s-烷基或n-烷基；o-烯基、s-烯基或n-烯基；soch3；so2ch3；ono2；no2；n3；nh2；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷基芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；經(jīng)取代的甲硅烷基；rna切割基團；報告子基團；嵌入子(intercalator)基團；用于改進寡核苷酸藥代動力學性質的基團；或者用于改進寡核苷酸的藥代動力學/藥效學性質的基團以及具有類似性質的其他取代基。優(yōu)選的修飾包括2＇-甲氧基乙氧基[2＇-o-ch2ch2och3，也稱為2＇-o-(2-甲氧基乙基)](martin等，helv.chim.acta，1995，78，486)。其他優(yōu)選的修飾包括2＇-甲氧基(2＇-o-ch3)、2＇-丙氧基(2＇-och2ch2ch3)和2＇-氟代(2＇-f)。類似的修飾還可在寡核苷酸的另一些位置上發(fā)生，特別是3＇端核苷酸上糖的3＇位置和5＇端核苷酸的5＇位置。寡核苷酸還可含有糖模擬物，例如環(huán)丁基替代戊呋喃基。在某些實施方案中，mirna試劑包含一種或更多種堿基修飾和/或替換。本文所用的“未經(jīng)修飾的”或“天然的”堿基包括腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。經(jīng)修飾的堿基包括但不限于天然核酸中發(fā)現(xiàn)的僅稀有的或瞬變的堿基，例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-me嘧啶，特別是5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2＇脫氧胞嘧啶，并且在本領域經(jīng)常稱為5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶(hmc)、糖基hmc和龍膽二糖基(gentobiosyl)hmc；以及合成堿基，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他雜原子取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、n6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。(kornberg，a.，dnareplication，w.h.freeman&co.，sanfrancisco，1980，第75-77頁；gebeyehu，g.等，nucl.acidsres.1987，15：4513)。還可包括本領域已知的“通用”堿基，例如肌苷。還可包括5-me-c替換。已顯示，這些修飾和/或替換使核酸雙鏈的穩(wěn)定性提高了0.6oc至1.2oc。(sanghvi，y.s.，crooke，s.t和lebleu，b.編寫，antisenseresearchandapplications，crcpress，bocaraton，1993，第276-278頁)。另一些合適的經(jīng)修飾的堿基在美國專利no.3,687,808，以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692中有描述，其各自通過引用并入本文。不需要在指定的寡核苷酸中的所有位置進行統(tǒng)一修飾，并且事實上，在單一的寡核苷酸中可并入多于一種前述修飾，甚至在寡核苷酸內的單一核苷酸上并入多于一種前述修飾。在某些實施方案中，核苷酸單元的糖和核苷間連接(即，骨架)兩者都被新基團替換。堿基單元維持與合適的核酸靶標化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，已示出具有優(yōu)異雜交性質的寡核苷酸模擬物，被稱為肽核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架例如氨基乙基甘氨酸骨架替代。核堿基(nucleobase)被保留，并直接或間接與骨架酰胺部分的氮雜氮原子結合。教導pna化合物之制備的代表性的美國專利包括但不限于美國專利no.5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，其各自通過引用并入本文。pna化合物的另一些教導還可見于nielsen等，science，1991，254，1497-1500中。在某些實施方案中，mirna試劑(共價或非共價地)與一種或更多種增強寡核苷酸活性、細胞分布或細胞攝取的部分或綴合物連接。這樣的部分包括但不限于，脂質部分，例如膽固醇部分(letsinger等，proc.natl.acad.sci.usa，1989，86，6553-6556)、膽酸(manoharan等，bioorg.med.chem.let.，1994，4，1053-1060)；硫醚，例如己基-s-三苯甲基硫醇(manoharan等，ann.n.y.acad.sci.，1992，660，306-309；manoharan等，bioorg.med.chem.let.，1993，3，2765-2770)；巰基膽固醇(oberhauser等，nucl.acidsres.，1992，20，533-538)；脂肪族鏈，例如十二烷基二醇或十一烷基殘基(kabanov等，febslett.，1990，259，327-330；svinarchuk等，biochimie，1993，75，49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙銨1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油基-3-h-膦酸酯(manoharan等，tetrahedronlett.，1995，36，3651-3654；shea等，nucl.acidsres.，1990，18，3777-3783)；聚胺鏈或聚乙二醇鏈(mancharan等，nucleosides&nucleotides，1995，14，969-973)；或金剛烷乙酸(manoharan等，tetrahedronlett.，1995，36，3651-3654)；棕櫚基部分(mishra等，biochim.biophys.acta，1995，1264，229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基-叔氧膽固醇部分(crooke等，j.pharmacol.exp.ther.，1996，277，923-937)，其各自通過引用整體并入本文。還參見美國專利no.4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，其各自通過引用整體并入本文。在一個特定實施方案中，mirna試劑(共價或非共價地)與核酸適配體連接。適配體是與特定靶分子結合的合成的寡核苷酸分子或肽分子。適于與本文提供的mirna試劑一起使用的適配體在2012年8月31日提交的美國臨時專利申請no.61/695,477中有描述，其通過引用整體并入本文。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了脂肪細胞特異性的mirna調節(jié)劑(modulator)組合物，其包含：i)與人脂肪靶細胞上的細胞表面標記選擇性結合的靶向部分，以及ii)產(chǎn)熱的mirna調節(jié)劑部分，其中所述靶向部分促進所述靶細胞對所述mirna調節(jié)部分的攝取以使所述mirna能夠靶向產(chǎn)熱通路并上調所述靶細胞中的產(chǎn)熱。在一個實施方案中，所述組合物包含含有作為靶向部分之適配體的agomir。在某些實施方案中，與本文公開的mirna一起使用的適配體與脂肪組織間充質干細胞(atmsc)、白色脂肪組織(wat)脂肪細胞以及褐色脂肪組織(bat)脂肪細胞上的細胞表面標記蛋白特異性結合。atmsc的細胞表面標記包括：cd9、cd10、cd13、cd29、cd36、cd44、cd49d、cd54、cd55、cd59、cd73、cd90、cd91、cd105、cd137、cd146、cd166和hla-abc。wat脂肪細胞的細胞表面標記包括：脂聯(lián)蛋白、窖蛋白-1、窖蛋白-2、cd36(fat)、clh-22(網(wǎng)格蛋白重鏈chr22)、fabp4(脂肪細胞蛋白2，ap2)、slc27a1(fatp1)、slc27a2(fatp2)、glut4(葡萄糖轉運子4)、圍脂滴蛋白2或抵抗素。所有脂肪細胞的細胞表面標記包括中性溶酶(cd10)、fat(cd36)、thy-1(cd90)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(lrp1或cd91)、窖蛋白-1、窖蛋白-2、脂肪酸結合蛋白4(fabp4)、細胞表面糖蛋白muc18(cd146)、激活的白細胞細胞粘合分子(cd166)和利尿鈉肽受體a(npr1)。根據(jù)另一些實施方案，與本文公開的mirna一起使用的適配體還可與包括以下的脂肪組織標記特異性結合：脂聯(lián)蛋白、瘦素、抵抗素、fgf17、fgf19、bmp7、pyy、metap2、rbp4、內皮抑制素和制管張素。在某些實施方案中，通過使用整個活細胞作為靶標的cell-selex技術來選擇適配體，借此，通過重復擴增和與活細胞結合來選擇識別完整細胞表面上的天然環(huán)境中處于其天然構象的特定分子的適配體。在該基于細胞的選擇中，可在其天然環(huán)境中直接靶向特定的細胞表面分子或甚至未知的膜受體，從而允許對細胞特異性適配體的直接富集。在某些示例性實施方案中，所述mirna調節(jié)劑與適配體組合，產(chǎn)生“aptamir”組合物。有許多方法來將適配體和mirna類似物組合成產(chǎn)生aptamir。它們包括例如，適配體-mirna類似物嵌合體、適配體-剪接-轉換寡核苷酸嵌合體以及與含mirna類似物的納米顆粒或脂質體綴合的適配體?！白o送適配體(escortaptamer)”可插入至可攜帶多種mirna類似物的功能性聚合物、脂質體和納米顆粒的表面。例如，硫代適配體綴合的脂質體的大小為約120nm。納米顆粒方法有幾個功能優(yōu)點，包括例如，細胞攝取、跨膜能力以及經(jīng)觸發(fā)的納米顆粒解體。在一個實施方案中，aptamir組合物包含直接與mirna調節(jié)劑連接或融合的適配體。這樣的aptamir完全是化學合成的，這為綴合物的組合物提供了更多的控制。例如，化學計量學(mirna類似物/適配體的比率)和附著位點可如前文所定義。綴合物的連接部分存在充當適配體和mirna類似物之反應附著點的多個(兩個或多于兩個)親核部分和/或親電部分。此外，所述aptamir還可包含處于所述適配體和所述mirna類似物之間的接頭。在一些實施方案中，所述接頭是聚亞烷基二醇，特別是聚乙二醇。在另一些實施方案中，所述接頭是脂質體、外來體、樹狀聚體或梳形聚合物(combpolymer)。另一些接頭可介導適配體與mirna類似物之間的綴合，包括生物素鏈霉素橋或核糖核酸。示例性的非共價接頭包括由mirna部分的單鏈部分或突出端(overhang)與適配體部分的互補性單鏈部分或突出端堿基配對形成的接頭。在另一個特定實施方案中，適配體與mirna類似物組合形成基于脂質體的aptamir。脂質體是由脂質雙層形成的可加載有藥物例如mirna的球形納米結構。此外，脂質體表面可加載有不同物質，例如，聚乙二醇(延長其系統(tǒng)半衰期)或分子識別部分如與靶細胞特異性結合的適配體。例如，已開發(fā)出經(jīng)適配體修飾的脂質體，其中每個脂質體展示與其表面結合的約250個適配體，以促進靶向結合。在一個優(yōu)選實施方案中，制造了脂質體來包封mirna類似物并在其表面展示以高親和力和特異性與在脂肪細胞和atmsc表面高表達的分子(例如脂質轉運蛋白)特異性結合的適配體。所述脂質體與靶細胞的融合導致mirna類似物釋放至細胞質中，然后其改變特定的細胞內通路?；蛘撸稍谥|體表面插入穩(wěn)定的硫代適配體，以引導脂質體mirna類似物遞送并加載至靶向的atmsc和脂肪細胞中。在另一個特定實施方案中，適配體與mirna類似物組合組合形成基于載體的aptamir。示例性的載體包括納米顆粒、脂質體或外來體。這樣的基于載體之a(chǎn)ptamir組合物具有在單一的載體中將多種mirna調節(jié)劑貨物遞送至靶細胞的能力。為了完成靶向和積累，將所述載體配制成在其外表面存在靶向部分以使其可與所選的靶脂肪細胞上的細胞表面抗原或受體反應/結合。例如，可將載體制造為包封mirna調節(jié)劑同時在其表面展示以高親和力和特異性與在脂肪細胞和atmsc表面高表達的分子(例如脂質轉運蛋白)特異性結合的適配體。內化的外來體在細胞的細胞質中釋放其mirna類似物負載，這改變了特定的細胞內通路。在一個實施方案中，所述載體是外來體。外來體起源于晚期內體，是天然的特異性加載蛋白質、mrna或mirna的納米顆粒，其由細胞進行內源性分泌。外來體從宿主細胞釋放，不具有毒性，并且可基于其組分和外來體中/上的物質向特定細胞傳遞信息。因為外來體是直徑為約20nm至100nm的顆粒，所以，外來體避過了單核巨噬細胞系統(tǒng)(其清除大?。?00nm的循環(huán)顆粒)的清除，并且被非常有效地遞送至靶組織。此外，相比于其他載體，合成的外來體可提供數(shù)個優(yōu)點。例如，它們直接將其貨物遞送至細胞溶膠中，同時，其惰性避過了細胞外環(huán)境的攻擊和清除。外來體的結構組分可包括負責例如信號轉導、膜轉運、抗原呈遞、靶向/附著等過程的小分子。所述mirna試劑必須充分地與靶mrna互補，即，充分雜交并且具有足夠的特異性，以得到期望的效果?！盎パa”是指兩條包含天然或非天然堿基或其類似物的序列之間通過氫鍵進行配對的能力。例如，如果mirna試劑的一個位置上的堿基能夠與靶核苷酸序列的相應位置上的堿基進行氫鍵結合，則認為在該位置上的堿基是彼此互補的。在某些實施方案中，不要求100％的互補性。在另一些實施方案中，要求100％的互補性。用于本文公開的方法的mirna試劑可使用常規(guī)方法設計。雖然本文記載了某些示例性靶核酸序列和mirna試劑的具體序列，但是本領域技術人員應意識到，這些序列僅用于舉例說明和描述在本發(fā)明范圍內的具體實施方案。從本公開內容的角度來看，另外的靶區(qū)段對于本領域普通技術人員來說是容易鑒定的。包含在種子序列中或與其緊鄰的至少五個(5)連續(xù)核苷酸延伸的長度為5、6、7、8、9、10或更多個核苷酸的靶區(qū)段被認為適于靶向基因。在一些實施方案中，靶區(qū)段可包括包含來自種子序列之一的5′端的至少5個連續(xù)核苷酸的序列(其余核苷酸為同一rna從種子序列5′端上游緊接著開始延伸并且延續(xù)直至mirna試劑包含約5至約30個核苷酸)。在一些實施方案中，靶區(qū)段可由包含來自種子序列之一的3′端的至少5個連續(xù)核苷酸的rna序列來代表(其余核苷酸為同一rna從靶區(qū)段3′端下游緊接著開始延伸并且延續(xù)直至mirna試劑包含約5至約30個核苷酸)。通過掌握本文提供的序列，本領域技術人員將能夠在不進行過度實驗的情況下即可鑒定其他優(yōu)選區(qū)域以靶向使用mirna試劑。當鑒定了一個或更多個靶標區(qū)域、區(qū)段或位點后，選擇與靶標充分互補——即，充分雜交并且具有足夠的特異性(即，基本不與其他非靶核酸序列結合)——的抑制性核酸化合物以得到期望的效果。在某些實施方案中，由重組載體表達用于實施本發(fā)明的mirna試劑。合適的重組載體包括但不限于dna質粒、病毒載體或dna微環(huán)?？墒褂帽绢I域公知的任何合適的基因工程技術來完成載體構建體的生成，包括但不限于pcr標準技術、寡核苷酸合成、限制核酸內切酶消化、連接、轉化、質粒純化和dna測序，例如，如sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual.(1989)，coffin等(retroviruses.(1997)，以及“rnaviruses：apracticalapproach”(alanj.cann編寫，oxforduniversity出版社(2000))中所述。如對本領域普通技術人員顯而易見的，用于將本發(fā)明的核酸轉運至細胞中的多種合適的載體是可得到的。遞送核酸的合適載體的選擇以及將選擇的表達載體插入至細胞中的條件優(yōu)化在本領域普通技術人員能力范圍內，無需進行過度實驗。病毒載體包含具有用于在包封細胞中生產(chǎn)重組病毒之序列的核苷酸序列。表達本發(fā)明核酸的病毒載體可基于包括但不局限于以下的病毒骨架來構建：逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、天花病毒或甲病毒?？扇绫疚乃枋龅膩磉f送重組載體，并且其可存在于靶細胞(例如穩(wěn)定的轉化體)中。在某些實施方案中，使用化學合成技術在體外合成用于實施本發(fā)明的mirna試劑，如在例如以下文獻中所述，adams(1983)j.am.chem.soc.105：661；belousov(1997)nucleicacidsres.25：3440-3444；frenkel(1995)freeradic.biol.med.19：373-380；blommers(1994)biochemistry33：7886-7896；narang(1979)meth.enzymol.68：90；brown(1979)meth.enzymol.68：109；beaucage(1981)tetra.lett.22：1859；美國專利no.4,458,066，其各自通過引用整體并入本文。iv.治療方法在一個方面，本發(fā)明提供了治療人對象的肥胖的方法。所述方法一般包括向人對象施用有效量的調節(jié)至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子(例如線粒體解偶聯(lián)劑，如ucp1和/或ucp2)活性的mirna試劑。這樣的治療方法可基于從藥物基因組領域得到的知識來具體調整和修改。因此，本發(fā)明的另一個方面提供了使用本發(fā)明的靶基因分子或根據(jù)個體的藥物響應基因型的靶基因調節(jié)劑來調整個體預防性或治療性治療的方法。藥物基因組學使得臨床醫(yī)生或醫(yī)師能夠將預防性或治療性治療靶向從治療中受到最大益處的患者，并避免治療將經(jīng)歷藥物相關毒性副作用的患者。可在合適的動物模型例如肥胖模型(包括ob/ob小鼠(lindstromp.，scientificworldjournal，7：666-685(2007)和db/db小鼠(sharmak等，amjphysiolrenalphysiol.，284(6)：f1138-1144(2003))中測試mirna試劑。例如，可將本文所述的mirna試劑(或編碼所述mirna試劑的表達載體或轉基因)用于動物模型中，以確定使用所述試劑治療的效力、毒性或副作用。或者，可將治療劑用于動物模型中以確定這樣的試劑的作用機制。例如，可將mirna試劑用于動物模型中，以確定使用此試劑治療的效力、毒性或副作用。或者，可將試劑用于動物模型中以確定此試劑的作用機制。本公開內容還提供了誘導前脂肪細胞分化成白色脂肪細胞和將白色脂肪細胞分化成褐色脂肪細胞的方法，其包括向前體脂肪細胞群施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。在某些實施方案中，使前脂肪細胞分化成脂肪細胞的誘導大于當將前脂肪細胞暴露于100nm羅格列酮兩天隨后暴露于維持培養(yǎng)基中時得到的前脂肪細胞向脂肪細胞的分化。在某些實施方案中，所述脂肪細胞是褐色脂肪細胞。在另一些實施方案中，所述脂肪細胞是白色脂肪細胞。本公開內容還提供了用于在有此需要的對象中提高胰島素敏感性的方法，其包括向所述對象施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。在某些實施方案中，所述對象是哺乳動物。本公開內容還提供了引起有此需要的對象中脂肪消耗的方法，其包括向所述對象施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。在某些實施方案中，所述對象是哺乳動物。在另一些實施方案中，所述哺乳動物是人。經(jīng)修飾以增強進入細胞(例如，脂肪細胞)之攝取的mirna試劑可以單位劑量施用，所述單位劑量低于約每kg體重15mg，或低于每kg體重10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg，并且低于每kg體重200納摩爾mirna試劑(例如約4.4×1016個拷貝)，或低于每kg體重1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015納摩爾rna沉默試劑。單位劑量例如可通過注射(例如靜脈內或肌內)、吸入劑量或局部施用來施用。特別優(yōu)選的劑量為低于2、1或0.1mg/kg體重?？梢源蠹s0.00001mg至約3mg每器官/組織，或優(yōu)選約0.0001mg至0.001mg每器官/組織，約0.03mg至3.0mg每器官/組織，約0.1mg至3.0mg每器官/組織或約0.3mg至3.0mg每器官/組織的劑量直接向器官或組織(例如，直接向脂肪組織)遞送mirna試劑。所述劑量可為對治療或預防肥胖或提高胰島素敏感性有效的量。在一個實施方案中，以低于一天一次的頻率來施用單位劑量，例如低于每2天、4天、8天或30天一次。在另一個實施方案中，不以一定頻率的方式來施用單位劑量(例如，不以規(guī)律的頻率)。例如，可一次施用單位劑量。在一個實施方案中，以另一些傳統(tǒng)治療形式來施用有效劑量。在某些實施方案中，向對象施用mirna試劑的初始劑量，以及一次或更多次維持劑量。維持劑量一般低于初始劑量，例如，是初始劑量的一半。維持方案可包括用每天0.01mg/kg體重至1.4mg/kg體重的劑量來治療對象，例如，每天10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg體重。維持劑量優(yōu)選施用不多于每5天、10天或30天一次。此外，治療方案的持續(xù)時間根據(jù)具體疾病的性質、其嚴重性以及的總體狀況(condition)而不同。在一些優(yōu)選實施方案中，劑量可以不高于每天一次遞送，例如不高于每24小時、36小時、48小時或更多個小時一次，例如不高于每5天或8天一次。治療后，可監(jiān)測患者的狀況改變，例如體脂肪百分比的改變。在患者對現(xiàn)有劑量水平不顯著響應的情況下可增加所述化合物的劑量，或者如果觀察到體脂肪降低或觀察到不期望的副作用，則可降低劑量。如在具體情況下適當期望或考慮，有效劑量可以單次給藥(dose)或以兩次或或更多次給藥來施用。如果期望有助于反復輸注或頻繁輸注，可建議植入遞送裝置，例如泵、半永久支架(例如，皮下、靜脈內、腹膜內、腦池內(intracisternal)或囊內)，或儲庫。在一個實施方案中，藥物組合物包含多個mirna試劑種類。在另一個實施方案中，相對于天然靶序列，mirna試劑種類具有與另一個試劑種類不重疊或不相鄰的序列。在另一個實施方案中，多個mirna試劑種類對不同的天然靶基因具有特異性。在另一個實施方案中，所述mirna試劑是等位基因特異性的。在另一個實施方案中，多個mirna試劑種類靶向兩種或更多種snp等位基因(例如，兩個、三個、四個、五個、六個或更多個snp等位基因)。在成功的治療后，可期望使患者經(jīng)歷維持治療以預防疾病狀態(tài)的復發(fā)，其中，以0.01mg/kg至100mg/kg體重的維持劑量來施用本發(fā)明的化合物(參見美國專利no.6,107,094)。所施用的mirna試劑的濃度或量將取決于為試劑和施用方法(例如經(jīng)鼻、經(jīng)口腔或經(jīng)肺)所確定的參數(shù)。例如，經(jīng)鼻制劑傾向于需要一些組分的濃度低得多以避免刺激或灼傷鼻通道。有時期望將經(jīng)口制劑稀釋多達10至100倍，以提供合適的經(jīng)鼻制劑。某些因素可影響有效治療對象所需要的劑量，這些因素包括但不限于，疾病或病癥的嚴重程度、先前的治療、對象的一般健康和/或年齡，以及存在的其他疾病。此外，用治療有效量的mirna試劑給對象治療可包括單次治療，或者優(yōu)選可包括系列治療。還應理解，在具體的療程中用于治療的mirna試劑的有效劑量可提高或降低。劑量的改變可從本文描述的診斷測定結果得出并變得顯而易見。例如，可在施用mirna試劑組合物后監(jiān)測對象?；诒O(jiān)測信息，可施用額外量的mirna試劑組合物。給藥取決于待治療疾病病狀的嚴重性和響應性，治療療程持續(xù)數(shù)天到數(shù)個月或直至實現(xiàn)治愈，或實現(xiàn)疾病狀態(tài)的緩解?？赏ㄟ^藥物在患者體內的藥物積累測量值來計算優(yōu)化的給藥方案。本領域技術人員可容易地確定最佳劑量、給藥方法學和重復速率。最佳劑量可根據(jù)單種化合物的相對效力而變化，并且可一般基于在動物模型體外和體內發(fā)現(xiàn)的有效的ec50來估計。在一些實施方案中，所述動物模型包括表達人基因(例如產(chǎn)生靶mrna的基因(例如產(chǎn)熱調節(jié)子))的轉基因動物。所述轉基因動物可為相應內源mrna缺陷的。在另一個實施方案中，用于測試的組合物包含至少在一個內部區(qū)域與在所述動物模型的核酸序列和人靶核酸序列之間保守的序列互補的mirna試劑。一些研究已經(jīng)報道了使用mirna試劑對哺乳動物進行的成功給藥。例如，esauc，等，cellmetabolism，3(2)：87-98(2006)報道了用mir-122反義寡核苷酸的腹膜內劑量對正常小鼠進行給藥，12.5mg/kg至75mg/kg，每周兩次，持續(xù)四周。小鼠在治療結束時表現(xiàn)健康并且正常，未出現(xiàn)體重損失或攝食減少。除了75mg/kg劑量mir-122aso顯示非常輕微的alt和ast水平增加以外，所有劑量的血漿轉氨酶水平處于正常范圍內(ast3/445，alt3/435)。這可推斷，50mg/kg是有效的無毒性的劑量。由krutzfeldtj.，等，nature，438，685-689(2005)進行的另一個研究采用每kg體重80mg、160mg或240mg的總劑量將antagomir注射至小鼠中以沉默mir-122。最高劑量導致完全失去mir-122信號。在另一個研究中，成功地將鎖核酸(“l(fā)na”)施用至靈長類動物中以沉默mir-122。(elmenj.，等，(2008)nature452，896-899報道，通過三次10mg/kglna-antimir的給藥實現(xiàn)了在靈長類動物中有效沉默mir-122，導致總血漿膽固醇長時間并且可逆地降低，并且研究動物不顯示任何lna相關的毒性或組織病理學改變。在某些實施方案中，通過從重組載體表達來施用用于實施本發(fā)明的mirna試劑。合適的重組載體包括但不限于dna質粒、病毒載體或dna微環(huán)?？墒褂帽绢I域公知的任何合適的基因工程技術來完成載體構建體的產(chǎn)生，包括但不限于pcr標準技術、寡核苷酸合成、限制核酸內切酶消化、連接、轉化、質粒純化和dna測序，例如，如sambrook等.molecularcloning：alaboratorymanual.(1989)，coffin等(retroviruses.(1997)，以及“rnaviruses：apracticalapproach”(alanj.caun，ed.，oxforduniversitypress(2000))中所述。如對本領域技術人員顯而易見的，用于將本發(fā)明的核酸轉運至細胞中的多種合適的載體是可用的。遞送核酸的合適載體的選擇以及將選擇的表達載體插入至細胞中的條件優(yōu)化在本領域技術普通人員的能力范圍內，無需進行過度實驗。病毒載體包含具有用于在包封細胞中產(chǎn)生重組病毒之序列的核苷酸序列。表達本發(fā)明核酸的病毒載體可基于包括但不限于以下的病毒骨架來構建：逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、天花病毒或甲病毒。重組載體可如本文所描述的來遞送，并且其可存在于靶細胞(例如穩(wěn)定的轉化體)中。mirna試劑可直接引入細胞(例如脂肪細胞)中；或以細胞外的方式引入腔、間隙(interstitial)空間中，引入生物體的循環(huán)中，經(jīng)口引入，或者可通過將細胞或生物體浴在含有核酸的溶液中來引入。血管或血管外循環(huán)、血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)以及腦脊液都是可引入核酸的位點?？墒褂帽绢I域已知的遞送方法來引入本發(fā)明的mirna試劑，所述方法包括：注射含核酸的溶液，用被核酸覆蓋的顆粒進行轟擊，將細胞或生物體浸漬于核酸溶液中，或在核酸的存在下對細胞膜進行電穿孔?？墒褂帽绢I域已知的另外的方法來將核酸引入細胞中，例如脂質介導的載體轉運、化學介導的轉運和陽離子脂質體轉染例如磷酸鈣等。mirna試劑可與另一些組分(例如增強細胞攝取mirna試劑的化合物)一起引入。在某些實施方案中，本文描述的方法包括將mirna試劑與另一些藥劑或藥物(例如用于調節(jié)產(chǎn)熱的組合物、用于治療糖尿病的組合物、用于治療肥胖的組合物)共施用。用于調節(jié)產(chǎn)熱的組合物包括β-3腎上腺素能受體激動劑、甲狀腺激素、pparg激動劑、瘦素、脂聯(lián)蛋白和食欲肽。v.篩選方法在另一個方面，本發(fā)明提供了篩選調節(jié)產(chǎn)熱、減少肥胖或提高胰島素敏感性的mirna試劑的方法。所述方法一般包括以下步驟：提供指示細胞；使所述指示細胞與受試mirna試劑接觸；以及在存在和不存在所述mirna試劑的情況下，測定所述指示細胞中的至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子的表達水平和/或細胞活性，其中，所述產(chǎn)熱調節(jié)子活性在存在所述受試mirna試劑的情況下的改變將所述受試mirna試劑鑒定為調節(jié)產(chǎn)熱、減少肥胖或提高胰島素敏感性的mirna試劑。在某些實施方案中，所述方法包括測定產(chǎn)熱調節(jié)子(例如ucp1、ucp2)的表達水平和/或活性的提高。所述指示細胞可為哺乳動物細胞。在某些實施方案中，所述哺乳動物細胞是包含至少部分人基因組的人細胞。在本文公開的方法中可測定任何產(chǎn)熱調節(jié)子。示例性的產(chǎn)熱調節(jié)子記載于表2中。在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)熱調節(jié)子是線粒體解偶聯(lián)蛋白，例如ucp1和/或ucp2。其中可測量產(chǎn)熱調節(jié)子之活性的任何細胞都適用于本文公開的方法。示例性的細胞包括前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織來源的間充質干細胞、肝細胞、肌細胞或其前體。可測定產(chǎn)熱調節(jié)子的任何活性，包括但不限于，產(chǎn)熱調節(jié)子的mrna表達水平、蛋白質表達水平或線粒體解偶聯(lián)活性。用于測定這些活性的方法是本領域公知的?？珊Y選任何mirna試劑，包括但不限于：mirna、agomir、antagomir、aptamir、mir-掩蔽物、mirna-海綿、sirna(單鏈或雙鏈的)、shrna、反義寡核苷酸、核酶或與至少靶核酸的一部分雜交并調節(jié)其功能的另外的寡核苷酸模擬物。vi.藥物組合物在一個方面，本文公開的方法可包括施用包含能夠調節(jié)至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子活性的mirna試劑的藥物組合物和制劑。在某些實施方案中，用可藥用載劑來配制所述組合物。所述藥物組合物和制劑可經(jīng)腸胃外施用、經(jīng)局部施用、直接施用至胃腸道(例如，經(jīng)口或經(jīng)直腸)，或局部施用例如經(jīng)氣霧劑或經(jīng)皮。所述藥物組合物可以任何方式配制，并且可以多種單位劑型來施用，這取決于癥狀或疾病以及疾病的程度、每個患者的一般用藥情況、產(chǎn)生優(yōu)選結果的施用方法等。藥物的配制和施用技術上的細節(jié)在科學文獻和專利文獻中有很好的描述，參見例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，2005。mirna試劑可單獨施用，或作為藥物制劑(組合物)的組分來施用。所述化合物可以任何方便用于人醫(yī)藥或獸醫(yī)藥施用的方式進行配制。所述組合物中還可存在潤濕劑、乳化劑和潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、涂層劑、甜味劑、調味劑和香味劑、防腐劑和抗氧化劑。本發(fā)明的組合物制劑包括適于皮內施用、吸入施用、經(jīng)口/經(jīng)鼻施用、經(jīng)局部施用、經(jīng)腸胃外施用、經(jīng)直腸施用和/或經(jīng)陰道內施用的那些。所述制劑可適宜地以單位劑型存在，并且可通過任何藥學領域公知的方法來制備?？膳c載劑材料組合以生產(chǎn)單一劑型的活性成分(例如本發(fā)明的核酸序列)的量可根據(jù)待治療的宿主、具體的施用方式例如皮內或吸入而不同?？膳c載劑材料組合以生產(chǎn)單一劑型的活性成分的量一般為產(chǎn)生治療效果例如抗原特定t細胞應答或體液應答的化合物的量。本發(fā)明的藥物制劑可根據(jù)本領域已知的制造藥物的任何方法來制備。這樣的藥物可包含甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。制劑可與適合于制造的無毒可藥用賦形劑摻合。制劑可包含一種或更多種稀釋劑、乳化劑、防腐劑、緩沖劑、賦形劑等，并且可以這樣的形式來提供：液體劑、散劑、乳劑、凍干散劑、噴霧劑、霜劑、洗劑、受控釋放的制劑、片劑、丸劑、凝膠劑、貼劑、植入物等。用于經(jīng)口施用的藥物制劑可使用本領域公知的可藥用載劑以適當和合適的劑量來配制。這樣的載劑使藥物能夠配制成適于患者攝取的以下單位劑型：片劑、丸劑、散劑、糖衣劑、膠囊劑、液體劑、錠劑、凝膠劑、糖漿劑、漿料劑、混懸劑等。用于經(jīng)口使用的藥物制備物可配制成固體賦形劑，任選經(jīng)研磨得到混合物，并加工成混合物顆粒，在按需要添加合適的額外化合物后得到片劑或糖衣劑芯。合適的固體賦形劑是碳水化合物或蛋白質填料，包括例如：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其他植物的淀粉；纖維素例如甲基纖維素、羥丙甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；以及樹膠，包括阿拉伯膠和西黃蓍膠；以及蛋白質，例如明膠和骨膠原?？商砑颖澜鈩┗蛟鋈軇?，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。適于推送(push-fit)的膠囊劑可包含混合有填料或粘合劑(例如乳糖或淀粉)，潤滑劑(例如滑石或硬脂酸鎂)，以及任選地，穩(wěn)定劑。在軟膠囊劑中，活性劑可溶解于或懸浮于含有或不含穩(wěn)定劑的合適液體中，例如，脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。水性混懸劑可包含混合有適于制造水性混懸劑(例如水性皮內注射劑)的活性劑(例如，本發(fā)明的核酸序列)。這樣的賦形劑包括懸浮試劑，例如羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠，以及分散劑或潤濕劑，例如天然磷脂(例如卵磷脂)、氧化烯與脂肪酸的縮合物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、氧化乙烯與長鏈脂肪族醇的縮合物(例如，十七乙烯氧基十六醇)、氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合物(例如，聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)，或氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合物(例如，聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。所述水性混懸劑還可包含一種或更多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或對基苯甲酸正丙酯；一種或更多種著色劑；一種或更多種調味劑和一種或更多種甜味劑，例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可調節(jié)制劑的摩爾滲透壓濃度。在某些實施方案中，使用基于油的藥物來施用mirna試劑?？赏ㄟ^將活性劑混懸于以下物質中來配制基于油的混懸劑：植物油，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油；或礦物油，例如液體石蠟；或這些物質的混合物。參見例如，美國專利no.5,716,928描述了使用精油或精油組分來提高生物利用度并降低經(jīng)口施用的疏水性藥物化合物的個體間差異和個體內差異(另參見美國專利no.5,858,401)。油混懸劑可包含增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或十六醇?？商砑犹鹞秳┮蕴峁┻m口的經(jīng)口制劑，例如甘油、山梨醇或蔗糖。這些制劑可通過添加抗氧化劑例如抗壞血酸來保存?？勺⑸溆洼d劑的實例參見minto(1997)j.pharmacol.exp.ther.281：93-102。在某些實施方案中，所述藥物組合物和制劑是水包油乳劑的形式。油相可為上文描述的植物油或礦物油，或其混合物。合適的乳化劑包括天然樹膠，例如阿拉伯膠和西黃蓍膠；天然磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯或偏酯，例如脫水山梨糖醇單油酸酯；以及這些偏酯與氧化乙烯的縮合物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。所述乳劑還可包含甜味劑和調味劑，如在糖漿劑和酏劑制劑中。這樣的制劑還可包含緩和劑(demulcent)、防腐劑或著色劑。在一些替代實施方案中，本發(fā)明的這些可注射水包油乳劑包含石蠟油、脫水山梨糖醇單油酸酯、乙氧基化脫水山梨糖醇單油酸酯和/或乙氧基化山梨糖醇三油酸酯。在某些實施方案中，藥物組合物和制劑通過以鼻內、眼內和陰道內的途徑來施用，包括栓劑、吹入劑、散劑和氣霧劑制劑(類固醇吸入劑例如參見rohatagi(1995)j.clin.pharmacol.35：1187-1193；tjwa(1995)ann.allergyasthmaimmunol.75：107-111)。栓劑制劑可通過將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合來制備，所述非刺激性賦形劑在常溫下為固體但是在體溫下為液體，因而將在體內熔化以釋放藥物。這樣的材料為可可油和聚乙二醇。在某些實施方案中，通過局部途徑經(jīng)皮遞送的藥物組合物和制劑配制為涂敷棒(applicatorstick)、溶液劑、混懸劑、乳劑、凝膠劑、霜劑、軟膏劑、糊劑、膠凝劑(jully)、涂劑(paint)、散劑和噴霧劑。在某些實施方案中，所述藥物組合物和制劑作為微球遞送，以在體內緩慢釋放。例如，微球可經(jīng)藥物的皮內注射來施用，所述藥物緩慢地經(jīng)皮下釋放；參見rao(1995)j.biomatersci.polym.ed.7：623-645；作為生物可降解和可注射凝膠制劑，參見例如，gao(1995)pharm.res.12：857-863(1995)；或者作為經(jīng)口施用的微球，參見例如，eyles(1997)j.pharm.pharmacol.49：669-674。在某些實施方案中，所述藥物組合物和制劑經(jīng)腸胃外施用，例如通過靜脈內(iv)施用，或施用至體腔或器官的管腔中。這些制劑可包括溶解于可藥用載劑中的活性劑溶液?？墒褂玫目山邮艿妮d劑和溶劑有水和作為等滲氯化鈉的林格液(ringer’ssolution)。此外，可使用無菌的固定油作為溶劑或混懸培養(yǎng)基。為此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的甘油單酯和甘油二酯。此外，還可在可注射劑的制備中使用脂肪酸，例如油酸。這些溶液是無菌的，并且一般不含不期望的物質。這些制劑可通過常規(guī)的公知的滅菌技術來滅菌。所述制劑可按需要包含可藥用輔料物質以接近生理學狀態(tài)，例如ph調節(jié)劑(adiusting)和緩沖劑，毒性調節(jié)劑，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中活性劑的濃度可大范圍地不等，并且將根據(jù)所選的具體施用方式和患者的需要，主要基于流體體積、粘度、體重等來選擇。對于iv施用，所述制劑可為無菌的可注射制備物，例如無菌的可注射水性混懸劑或油性混懸劑。該混懸劑可使用那些合適的分散劑或潤濕劑或助懸劑來配制。所述無菌的可注射制備物還可為在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的混懸劑，例如1，3-丁二醇溶液。所述施用可為推注輸注(bolusinfusion)或連續(xù)輸注(例如，在指定時間段內基本無打斷地引入血管中)。在某些實施方案中，凍干所述藥物化合物和制劑。包含抑制性核酸的穩(wěn)定凍干制劑可通過凍干包含本發(fā)明藥物和填充劑例如甘露醇、海藻糖、棉籽糖和蔗糖或其混合物的溶液來得到。用于制備穩(wěn)定的凍干制劑的方法可包括凍干這樣的溶液，其含有約2.5mg/ml核酸、約15mg/ml蔗糖、約19mg/mlnacl和ph大于5.5但小于6.5的檸檬酸鈉緩沖劑。參見例如美國20040028670。在某些實施方案中，所述藥物組合物和制劑通過使用脂質體來遞送。通過使用脂質體，特別是其中脂質體表面攜帶對靶細胞具有特異性之配體的脂質體，或以其他方式優(yōu)選指向特定器官的脂質體，我們可以著重于在體內將活性劑遞送至靶細胞中。參見例如，美國專利no.6,063,400；6,007,839；al-muhammed(1996)j.microencapsul.13：293-306；chonn(1995)curr.opin.biotechnol.6：698-708；ostro(1989)am.j.hosp.pharm.46：1576-1587?？墒┯帽景l(fā)明制劑用于預防性和/或治療性治療。在某些實施方案中，對于治療應用，可以足以治愈、緩解或部分阻止病癥或其并發(fā)癥的臨床表現(xiàn)的量將組合物施用至需要降低甘油三酯水平的對象，或有罹患本文所描述的病癥風險或患有所述病癥的對象；該量可稱為治療有效量。例如，在某些實施方案中，以足以治療對象的肥胖的量來施用本發(fā)明的藥物組合物。足以實現(xiàn)該效果的藥物組合物的量是治療有效劑量。對該應用有效的給藥時間表和量(即，給藥方案)將取決于多種因素，包括疾病或癥狀的階段、疾病或癥狀的嚴重程度、患者健康的一般狀態(tài)(state)、患者的身體狀態(tài)、年齡等。在為患者計算給藥方案的過程中，還將施用方式納入考慮。給藥方案將本領域公知的藥代動力學參數(shù)納入考慮，即，活性劑的吸收速率、生物利用度、代謝、清除率等(參見例如，hidalgo-aragones(1996)j.steroidbiochem.mol.biol.58：611-617；groning(1996)pharmazie51：337-341；fotherby(1996)contraception54：59-69；johnson(1995)j.pharm.sci.84：1144-1146；rohatagi(1995)pharmazie50：610-613；brophy(1983)eur.j.clin.pharmacol.24：103-108；remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，2005)。本領域現(xiàn)有技術使臨床醫(yī)生能夠為每位個體患者、活性劑和被治療的疾病或病癥來確定給藥方案。為用作藥物的相似組合物提供的原則可用作指導來確定施用的給藥方案(即給藥時間表和劑量水平)實施本發(fā)明之方法是正確的并且是適當?shù)摹Ｖ苿┑膯为毷┯没蚨嘀厥褂每筛鶕?jù)例如以下來給定：所需要的劑量和頻率，以及患者的耐受，每次施用后所生成的膽固醇穩(wěn)態(tài)的程度和量等。制劑應當提供足夠量的活性劑以有效治療、預防或緩解病癥、疾病或癥狀，例如治療肥胖。在某些實施方案中，用于經(jīng)口施用的藥物制劑的每日量為每千克體重約1mg至100mg每天。與經(jīng)口施用相比，可使用更低的劑量施用至血流、體腔或器官的管腔中?？墒褂贸浞指叩膭┝坑糜诮?jīng)局部施用或經(jīng)口施用或通過散劑、噴霧劑或吸入劑來施用。用于制備能夠經(jīng)腸胃外或經(jīng)非腸胃外施用的制劑的實際方法對本領域技術人員是已知或是顯而易見的，并且這些方法在出版物例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，2005中有著更詳細的描述。vii.例證進一步通過以下實施例對本發(fā)明進行舉例說明，這些實施例不應當解讀為進一步的限制。貫穿于本申請中的序列表內容、附圖以及引用的所有文獻、專利和已公開的專利申請都通過引用清楚地并入本文。此外，根據(jù)本發(fā)明，可采用本領域范圍內的常規(guī)分子生物學、微生物學和重組dna技術。這些技術在文獻中有充分的解釋。參見例如，sambrook，fritsch&maniatis，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版(1989)coldspringharborlaboratory出版社coldspringharbor，newyork(本文中寫為“sambrook等，1989”)；dnacloning：apracticalapproach，i卷和ii卷(d.n.glover編寫，1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait編寫，1984)；nucleicacidhybridization[b.d.hames和s.j.higgins編寫(1985)]；transcriptionandtranslation[b.d.hames和s.j.higgins編寫(1984)]；animalcellculture[r.i.freshney編寫(1986)]；immobilizedcellsandenzymes[irl出版社，(1986)]；b.perbal，apracticalguidetomolecularcloning(1984)；f.m.ausubel等(編寫)，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，inc.(1994)。實施例1.產(chǎn)熱調節(jié)子的計算機分析基于對有效的科學信息和我們自己的實驗數(shù)據(jù)的重要評估和回顧，選擇了八十三種在產(chǎn)熱調控中涉及到的蛋白質。基于其功能，將這些蛋白質劃分為產(chǎn)熱的激活蛋白或阻抑蛋白。這些產(chǎn)熱調節(jié)蛋白記載于表2中。表2.產(chǎn)熱調節(jié)蛋白：使用已知的string9.0數(shù)據(jù)庫和預測的蛋白質相互作用(string-db.org/)來測試這83個候選分子。該相互作用包括直接(物理的)締合和間接(功能性的)締合；它們來自四個來源：基因組背景；高通量實驗；共表達；以及現(xiàn)有知識。string定量地整合了來自這些來源的大量生物體中的相互作用數(shù)據(jù)，在可適用的情況下在這些生物體之間轉移信息。所述數(shù)據(jù)庫目前覆蓋了來自1，133種生物體中的5，214，234個蛋白質。例如，83種產(chǎn)熱調節(jié)子分子之間的關系以ucp1為中心，與ucp1具有直接聯(lián)系或間接聯(lián)系的分子可通過使用最高為0.90的置信度分數(shù)來鑒別。該關系記載于圖1a的示意圖中。根據(jù)該分析發(fā)現(xiàn)，九個分子(cebpb、cidea、kdm3a、nrip1、prdm16、pparg、ppargc1a、ppkaa2和ucp2)直接與ucp1關聯(lián)，而更多分子在第二級或更高程度的級上與ucp1關聯(lián)。當置信度設置在0.70分時，發(fā)現(xiàn)另外八個蛋白質直接與ucp1關聯(lián)(azgp1、dio2、klf11、klf15、nr1h3、ppara、ppard和ppargc1b)，圖1b。類似地，使用其他軟件程序獨立地評估這83種產(chǎn)熱調控分子之間的相互作用。由ingenuitypathwayanalysis(ipa)software程序(www.ingenuity.com)預測的相互作用在圖2a中示出(ucp1為黃色，激活蛋白為綠色并且阻抑蛋白為紫色)。由reactomefunctionalinteraction(reactomeif)software程序(http：//wiki.reactome.org)預測的相互作用在圖2b中示出(ucp1為黃色，激活蛋白為綠色并且阻抑蛋白為紫色)。ipa和reactomeif網(wǎng)絡與圖1a和1b中記載的使用string程序得到的網(wǎng)絡不同。這些算法的結果不同并不令人意外，因為它們基于不同的預設參數(shù)、信息來源和選擇標準。實施例2.相關mirna靶標的計算機選擇為了選擇適合作為mirna試劑靶標的產(chǎn)熱調節(jié)子，采用了數(shù)種基于互聯(lián)網(wǎng)的資源來使mirna與其靶標匹配(“micronome”)。示例性的工具記載于表3中。表3.用于選擇mirna及其靶標的示例性生物信息學工具：具體而言，這些工具用于進行：1)整合的數(shù)據(jù)挖掘(8個工具)；2)mirna挖掘和繪圖(6個工具)；3)mirna靶向的靶標和表達(21個工具)；4)整合的mirna靶標和表達(13個工具))5)mirna二級結構的預測和比較(5個工具)；6)網(wǎng)絡搜索和分析(8個工具)；7)分子顯示(4個工具)；以及8)信息整合以及開發(fā)(1個工具)。單個基因靶標可被幾種mirna來控制，然而單個mirna可控制數(shù)個基因靶標。已經(jīng)開發(fā)了龐雜的生物信息學資源來選擇與靶疾病最相關的mirna(gallagherij等，genomemedicine.2010；fujikik等，bmcbiol.2009；okaday，等，jandrol.2010；haot，等，molbiosyst.2012；haot，等，molbiosyst.2012)。然而這些算法的結果嚴重依賴于預設參數(shù)，并且這些算法之間的會聚程度十分有限。因此，需要開發(fā)出更好的對鑒定mirna/靶標關系具有改進的靈敏性、特異性和選擇性的進行生物信息學分析的工具。mirna與其靶標之間的相互作用超出了作為轉錄后調節(jié)子的mirna的初始描述，所述轉錄后調節(jié)子的驅動鏈(driverstrand)的種子區(qū)域(5′堿基2位至7位)與靶mrna的3′utr區(qū)的互補序列結合，通常導致翻譯抑制、靶標降解和基因沉默。所述相互作用還可包含mirna的驅動鏈或過客鏈的多個區(qū)域以及mrna的5′utr、啟動子和編碼區(qū)。根據(jù)對可用數(shù)據(jù)的分析，決定選擇靶向一個離散的信號通路中多個基因的通路特異性mirna，而不是在許多信號通路、功能或過程中涉及到的通用mirna。通過使用34種可公開獲取的互聯(lián)網(wǎng)工具預測mirna靶標，檢索可潛在地調節(jié)實施例1中所選的83個產(chǎn)熱調控分子(其中包括36個轉錄因子)中的數(shù)個靶標的特異性人mirna?？紤]的數(shù)個范例：a)一種微小rna-多種mrna通路特異性的范例a1.一種小rna-多種rna通路特異性的范例的第一個實施例組蛋白的甲基化狀態(tài)可通過組蛋白甲基化轉移酶和去甲基化酶來動態(tài)調控。人賴氨酸(k)特異性去甲基化酶3a(kdm3a)在代謝基因的表達調控中是至關重要的。其功能的缺失導致小鼠的肥胖和高脂血癥。與ucp1基因的ppar應答元件(ppre)結合的kdm3a的β-腎上腺素能刺激不僅降低在ppre的h3k9me2(對組蛋白h3的第9位賴氨酸進行二甲基化)水平，而且還促使pparg和rxra以及其共激活蛋白ppargc1a、crebbp和ncoa1募集至ppre。targetscanhuman數(shù)據(jù)庫(release6.0)的查詢顯示，人kdm3a3′utr的29位至35位區(qū)域是hsa-mir-22的保守靶標。數(shù)種其他mirna靶標數(shù)據(jù)庫也確認了hsa-mir-22與kdm3a之間的該匹配。因此，通過hsa-mir-22antagomir使去甲基化酶kdm3a的產(chǎn)量提高將導致ucp1基因啟動子區(qū)的去甲基化，從而促進數(shù)種調控元件的結合，并提高ucp1的產(chǎn)量。此外，我們使用了34種mirna靶標和表達工具(表4)來鑒定指定mirna的mrna靶標。表4.用于選擇mirna及其靶標的生物信息學工具：通過應用上述計算機策略發(fā)現(xiàn)，hsa-mir-22-3p和hsa-mir-22-5p分別與所選83種產(chǎn)熱靶標中的總共42種和8種相互作用。該數(shù)據(jù)記載于表5中。表5.鑒定為hsa-mir-22的預測靶標和/或已證實靶標的產(chǎn)熱調節(jié)子：a2.一種微小rna-多mrna通路特異性的范例的另一些實施例我們還利用34種mirna靶標和表達工具(表4)來尋找脂肪細胞的536種mirna(表1)中的任意一種與83種產(chǎn)熱靶標(表2)之間的潛在關系。顯示許多脂肪細胞mirna與所述83種產(chǎn)熱靶標中的至少一種相互作用(預測和/或證實)。例如mir-17-3p和hsa-mir-17-5p分別與所選83種產(chǎn)熱靶標中的總共23種和65種相互作用。該數(shù)據(jù)記載于表6中。表6.鑒定為hsa-mir-17的預測和/或已證實的靶標的產(chǎn)熱調節(jié)子：當制作出目的mirna及其mrna靶標的清單后，使用以下過濾條件來提煉結果：參數(shù)1目的組織/細胞中mirna的表達2預測指定基因或基因組的一種mirna的算法數(shù)量3來自算法的評分/百分比4由一種mirna靶向的優(yōu)選基因數(shù)量5靶基因中一種mirna的結合位點數(shù)量6靶基因中數(shù)種mirna的結合位點數(shù)量7靶基因中一種mirna種子互補序列的過呈現(xiàn)(over-representation)(mirvestigator)8經(jīng)證實的mirna-mrna靶標對9mirna結合位點的基因位置(5’utr-啟動子-cds-3’utr)10mirna的內含子位置11mirna的聚類12在目的特異性組織/細胞中mirna的豐度使用以上參數(shù)發(fā)現(xiàn)，229種mirna滿足這些標準中的至少兩種。該數(shù)據(jù)記載于表7中。表7.根據(jù)選擇標準數(shù)目減少的mirna排序：b)多種微小rna-一種mrna范例.b1.包括ucp1的一個示例性的多種mirna-一種mrna范例。在脂肪細胞中，最關鍵的產(chǎn)熱調節(jié)子是ucp1(也稱為產(chǎn)熱素)，并且因此，所有產(chǎn)熱調節(jié)子必須最終影響ucp1活性。ucp1是產(chǎn)生質子跨線粒體內膜泄漏從而使氧化磷酸化與atp合成解偶聯(lián)的線粒體轉運蛋白。因此，能量以熱的形式散失(適應性產(chǎn)熱)(參見圖5)lowell等，nature(2000)；friedman等，bioinformatics(2010)；hsu等，nucleicacidsresearch(2011)；rieger等，frontiersingenetics(2011))。ucp1生物合成主要受到轉錄水平的控制。圖6描述了由其他示例性產(chǎn)熱調節(jié)子對ucp1的轉錄調控。ucp1基因的啟動子區(qū)包含許多不同的調控位點，允許多種蛋白質正性(參見圖7a)和負性(參見圖7b)地影響其轉錄。孟德爾隨機化是一種在非實驗研究中使用已知功能基因中測量的變化來檢查可變的暴露對疾病的因果效應。孟德爾隨機化可視為“天然的”隨機化臨床試驗。據(jù)報道，ucp1基因的遺傳多態(tài)性(例如ucp1的外顯子2的啟動子中-3826a/g單核苷酸多態(tài)性)與mrna的表達降低及肥胖有關?；蛐蜑間/g的健康兒童對高脂肪膳食和急性冷暴露具有較低的產(chǎn)熱能力。年輕女性中，相同的-3826a/gucp1遺傳多態(tài)性降低靜息能力消耗，并降低熱調控交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性。在367位韓國女性的研究中，在優(yōu)勢模型(dominantmodel)中-3826a＞g的g等位基因和-412a＞c的c等位基因與大面積的腹部皮下脂肪顯著相關(分別為，p＜0.001和p＜0.0004)；它們組合到一起(ht2[gc])提高了該顯著性(p＜0.00005)。針對100名重度肥胖(bmi＞40kg/m2)的成年人和100名正常體重的對照對象(bmi范圍＝19kg/m2至24.9kg/m2)的研究鑒定了ucp1基因啟動子區(qū)的7個突變、內含子區(qū)的4個突變和外顯子區(qū)的4個突變。這些突變可促進肥胖的產(chǎn)生，具體而言，g.-451c＞t，g.940g＞a，以及g.ivs4-208t＞g可表示促進能量儲存的“節(jié)約(thrifty)”因子。最后，位于ucp1基因上游啟動子區(qū)的兩種多態(tài)性(a-3826g和c-3740a)影響基因表達，并且與人類的長壽相關。所有前述信息都支持將靶向ucp1的表達和活性作為改變適應性產(chǎn)熱并從而治療人類肥胖的有意義的方法。可實施許多策略來達到實現(xiàn)該目的，但是，本發(fā)明方法采用的一種策略中使用mirna試劑來同時調節(jié)產(chǎn)熱通路中的數(shù)個元件以提高ucp1的合成和活性。mirna與ucp1基因之間的直接相互作用和間接相互作用都被考慮。直接相互作用意為，mirna與ucp1基因的多個區(qū)域直接結合，導致ucp1mrna的轉錄、翻譯、穩(wěn)定性和/或降解發(fā)生改變。間接相互作用意為，mirna改變產(chǎn)熱mrna的轉錄、翻譯、穩(wěn)定性和/或降解，所述產(chǎn)熱mrna表達的蛋白質改變ucp1基因的轉錄。另外，間接相互作用意為，mirna改變修飾ucp1基因轉錄的其他mirna的轉錄、翻譯、穩(wěn)定性和/或降解。人ucp1基因(gi|237858805|ref|ng_012139.1|人解偶聯(lián)蛋白1(線粒體，質子載體)(ucp1)，4號染色體上的refseqgene)的啟動子區(qū)特別富含調控元件基序(表8)。表8.ucp1基因調控元件：表8a描述了人ucp1基因的15,910堿基對(bp)(fasta登錄號：＞gi|237858805|ref|ng_012139.1|人解偶聯(lián)蛋白1(線粒體、質子載體)(ucp1)，4號染色體上的refseqgene；ncbi參考序列：ng_012139.1)中這些多種調控元件相對于第5,001位核酸的ucp1轉錄起始位點的位置。由mirna直接或間接激活或抑制這些調控元件將導致ucp1基因表達和活性的改變。在正常條件下，ucp1基因表達和活性受到豐富的調控元件網(wǎng)絡抑制，以避免能量浪費。在脅迫條件下，例如暴露于冷環(huán)境，ucp1基因表達通過處于數(shù)種mirna調控下的多種激活蛋白和阻抑蛋白上調。用數(shù)種程序(包括microrna.org)進行的靶向人ucp13’utr之mirna的初始調查是陰性的。然而，另一些程序，包括microcosmtargets，使用ucp1ensembl的1,462堿基對的轉錄物enst00000262999作為靶標揭示出在ucp13’utr中的28個位置上的27種mirna的結合位點，其在表9中示出。表9.使用microcosmtargets確定的ucp1(ncbi參考序列ng_012139.1)的3’utr中mirna的結合位點：另一些程序，例如mirwalk、mirgen、mirgator-miranda和dianamicrot，使用ucp1ensembl的1,462堿基對轉錄物(enst00000262999)、ucp1ensembl的9,371堿基對基因序列(ensg00000109424)或所述15,910堿基對ucp1序列(ncbi引用序列：ng_012139.1)作為靶標揭示出在ucp13’utr的69個位置上總共50種mirna的結合位點，其在表10中示出。表10.根據(jù)數(shù)種程序的ucp1(ncbi引用序列ng_012139.1)的3’utr中mirna的結合位點：將人ucp1基因與數(shù)種mirna序列的序列比對得到在ucp1基因的5’utr、啟動子區(qū)和編碼區(qū)中的匹配。集成可公開獲取的互聯(lián)網(wǎng)工具預測靶向ucp1基因多個區(qū)域之mirna誘發(fā)的數(shù)個命中(hit)。出乎意料的是，這些預測工具之間的重疊為零，如圖3所示。然而，使用比對程序geneious篩選mirna數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)了總共191個人微小rna，其在ucp1基因序列中具有450個互補結合位點(表11)。匹配的長度為7個堿基至12個堿基(例如，hsa-mir-24-2-5p和hsa-mir-192-5p)。每個mirna的命中數(shù)為1至若干個不等(例如，hsa-mir-19b2有9個(豐富的脂肪細胞mirna)，hsa-mir-26a-2-3p有14個，hsa-mir-181c有11個，并且hsa-mir-620有12個)。表11.在ucp1基因序列(ncbi參考序列：ng_012139.1)中具有預測的結合位點的mirna：b2.包括ucp2的另一個示例性的多種mirna-一種mrna范例。ucp2是在wat、骨骼肌、胰島和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達的線粒體轉運蛋白。與ucp1一樣，其制造跨線粒體內膜的質子泄漏，從而使氧化磷酸化與atp合成解偶聯(lián)(適應性產(chǎn)熱，參見圖5)(lowell等，nature(2000))。兩個最近的元-分析報道了ucp2啟動子區(qū)的多態(tài)性與肥胖之間的關聯(lián)(liu等，gene(2013)；andersen等，int.j.obes.(2013))。第一個元-分析包括14個研究(7,647個案例和11,322個對照)，并得出以下結論，在ucp2-866g/a多態(tài)性的a等位基因與肥胖風險的降低之間有顯著的關聯(lián)，特別是在歐洲人群中。在第二個元-分析中包括12,984位對象，常見的ucp2-866g等位基因與肥胖有關。在17,636位丹麥對象中，同樣的ucp2-866g等位基因與胰島素敏感性的降低有關。在一個研究中，在具有gg表型的對象中，內臟脂肪中ucp2的mrna水平降低(esterbauer等，nat.genet.(2001))。在另一個研究中發(fā)現(xiàn)了皮下脂肪細胞ucp2mrna與體脂肪百分比之間的負相關趨勢(wang等，americanjournalofphysiol.(2004))。該信息支持將靶向ucp2的表達和活性作為改變適應性產(chǎn)熱并從而治療人肥胖的有意義的方法?？蓪嵤┰S多策略來達到實現(xiàn)該目的，但是，本發(fā)明方法采用的一種策略中使用mirna試劑來同時調節(jié)產(chǎn)熱通路中的數(shù)個元件以提高ucp2的合成和活性?？紤]mirna與ucp2基因之間的直接相互作用和間接相互作用二者。直接相互作用意為，mirna與ucp2基因的多個區(qū)域直接結合，導致ucp1mrna的轉錄、翻譯、穩(wěn)定性和/或降解發(fā)生改變。間接相互作用意為，mirna改變產(chǎn)熱mrna的轉錄、翻譯、穩(wěn)定性和/或降解，所述產(chǎn)熱mrna表達的蛋白質改變ucp2基因的轉錄。此外，間接相互作用意為，mirna改變修飾ucp2基因之轉錄的其他mirna轉錄、翻譯、穩(wěn)定性和/或降解。人ucp2基因(ensg00000175567，人解偶聯(lián)蛋白2(線粒體，質子載體)(ucp2)，11號染色體上的refseqgene)的啟動子區(qū)富含調控元件基序(表12)。表12.ucp2基因調控元件：表8b描述了人ucp2基因的15,174堿基對(bp)中這些多種調控元件相對于第5,001位核酸的ucp2轉錄起始位點的位置。由mirna直接或間接激活或抑制這些調控元件將導致ucp2基因表達和活性的改變。用數(shù)個預測程序使用ucp2ensembl2,113堿基對轉錄物enst00000310473作為靶標進行的mirna靶向人ucp23’utr的調查顯示了161個mirnas的結合位點，其在表13中示出。表13.ucp2轉錄物序列3’utr中具有預測的結合位點的mirna：此外，用數(shù)個預測程序使用包含5,000bp5’utr的人ucp2基因(ensg00000175567，15,174堿基對(bp))作為靶標進行的mirna靶向人ucp25’utr的調查揭示了在ucp2的5’utr中的54個mirna結合位點，其在表14中示出。表14.在ucp2基因序列之5’utr中具有預測的結合位點的mirna：c)多種微小rna-多種mrna范例。在從表2中選擇的83種產(chǎn)熱調控分子中篩選高嚴謹性的多種mirna-多種mrna關聯(lián)。用7種主要的預測工具進行的這些分析的結果在圖4中示出。這7種工具的聯(lián)合產(chǎn)生了4439個mirna-基因對。隨著工具數(shù)量的增加，這些工具之間的重疊降低，當考慮7種工具時，達到僅15個mirna-基因對。d)共調控的mrna靶標范例中的一個微小rna種子序列基序的過呈現(xiàn)?？墒褂脭?shù)種方法來鑒定通路特異性的mirna。例如，檢索推定為共調控基因的3’-utr的來自mirna種子區(qū)的過呈現(xiàn)序列可鑒定共有的調控mirna。為了確定特定的mirna種子序列是否在所選擇的83種產(chǎn)熱靶標的3’utr中過呈現(xiàn)，使用mirvestigator網(wǎng)絡應用(mirvestigator.systemsbiology.net/)。使用以下參數(shù)(基序大小為8bp，默認weeder模式，種子模式為8聚體，100％的互補同源性，以及允許0.25的擺動堿基配對)，其確定，如在表15中所示，由hsa-mir-19a/19b識別的基序5’-uuuguaca-3’在83種產(chǎn)熱靶標的15種中過呈現(xiàn)，互補性p值為1.7×10-04。應注意，據(jù)報道，hsa-mir-19是豐富的人脂肪細胞mirna。表15.共有基序uuuguaca與hsa-mir-19a/19b之間的互補性：通過mirvestigator鑒定，hsa-mir-19mrna/mirna雙鏈的最小自由能水平十分低，傾向于緊密結合。因此，使用較低的互補性嚴謹水平來重復mirvestigator分析。該分析還鑒定了與hsa-mir-19基序具有95％相似度至一致的10種另外的靶標(cebpd、prkaa1、twist1、irs1、ncoa1、ncoa2、ncoa3、klf5、rps6kb1、nrip1)。有趣的是，hsa-mir-19是脂肪組織組織中最豐富的mirna之一。鑒定為包含hsa-mir-19種子區(qū)域的互補序列的基因記載于表16中。表16.鑒定為hsa-mir-19之靶標的產(chǎn)熱調節(jié)子：因此，以更低的互補性嚴謹水平(基序大小為8bp，默認weeder模式，種子模式為8聚體，95％的互補同源性，以及允許0.25的擺動堿基配對)來重復mirvestigator分析。該分析還鑒定了與hsa-mir-19基序具有95％相似度至一致的10至12種另外的靶標(cebpd、creb1、prkaa1、twist1、insr、irs1、ncoa1、ncoa2、ncoa3、klf5、rps6kb1、nrip1)。有趣的是，hsa-mir-19是脂肪組織組織中最豐富的mirna之一。鑒定為包含hsa-mir-19種子區(qū)域之互補序列的基因記載于表17中。表17.鑒定為hsa-mir-19a/b的靶標，與共有基序有95％至100％相似度的產(chǎn)熱調節(jié)子：在沒有擺動的情況下，相同的基序5’-uuuguaca-3’在hsa-mir-1283的靶標中過呈現(xiàn)，互補性p值為1.4×104。此外，hsa-mir-1283與和遺傳性的人類肥胖有關的另一些目的mrna如abca1(膽固醇轉運蛋白)、脂聯(lián)素受體以及轉錄因子tcf7l2結合。類似地，對在脂肪細胞中表達的mirna鑒定了過呈現(xiàn)種子序列的另一些mirna。它們包括通用hsa-let-7家族(序列cuauacaa，p值＝7.5e-04)，以及脂肪細胞中富含的hsa-mir-30家族(序列uguaaaca，p值＝1.9×10-3)等。相對于根據(jù)string軟件包與ucp1直接相連的prdm16、cidea、nrip1、kdm3a、ceppb、pparg、ppargc1a和ppkaa2，似乎它們都和數(shù)個mirna共享(基序大小8bp，默認weeder模式，晶種模式8聚體，95％的互補同源性，以及0.25的擺動堿基配對允許)一個共有序列，所述mirna包括hsa-mir-3658(p值＝1.9e-003)和hsa-mir30家族(p值＝6.3e-003)，如下所示：hsa-mir-3658：hsa-mir-30a/b/c/d/e：e)內含子mirna-多種mrna通路特異性的范例。許多哺乳動物mirna位于蛋白編碼基因的內含子中，而不是其本身的特有的轉錄單元中。內含子mirna通常與它們所處在的前體mrna一起表達和加工。雖然可對內含子mirna和它們的宿主基因進行獨立調控，但內含子mirna可通過靶向宿主基因的utr來下調其本身的宿主蛋白質編碼基因。通過選擇作為mirna靶向的轉錄因子或通過內含子mirna宿主基因產(chǎn)物與mirna靶基因產(chǎn)品之間的蛋白質-蛋白質相互作用可實現(xiàn)宿主蛋白編碼基因的反饋調控。例如，mir-33與srebp宿主基因配合作用以控制膽固醇穩(wěn)態(tài)，并且mir-33a和mir-33b的藥物抑制是提高血漿hdl和低級vldl甘油三酯水平以治療血脂異常的有前景的治療策略。83種產(chǎn)熱靶基因的檢驗揭示出兩種內含子mirna：位于ppargc1b基因中的mir-378，和位于prdm16基因中的mir-4251。預測mirna靶標的互聯(lián)網(wǎng)工具的挖掘顯示，mir-378靶標包括bmp2、ppara、ppargc1a、prdm16、stat5和wnt10a，以及adipoq和igfr1；并且mir-4251靶標包括bmp2、ctbp1、ctbp2、mapk14、ncoa3、plac8、ppara、ppard、trpm8以及abca5、abca13、adipoqr2、kdm5b、klf-12、klf-14和tcf7l2。實施例3.高內涵細胞表型篩選使用高內涵篩選方法來篩選調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子(例如ucp1和ucp2)活性的新mirna試劑。高內涵篩選是使用活細胞圖像以輔助分子發(fā)現(xiàn)的藥物發(fā)現(xiàn)方法。這樣的基于自動成像的篩選方法特別適用于鑒定改變細胞表型的試劑。wat細胞包含大脂滴，而相反地，bat細胞包含許多較小的滴和較多數(shù)目的線粒體，所述線粒體包含鐵并使其呈現(xiàn)棕色。與wat相比，bat中的大量線粒體導致氧消耗的增加。因此，可基于其細胞表型來視覺地區(qū)分bat細胞和wat細胞。因此，高內涵篩選方法用于篩選調節(jié)產(chǎn)熱調節(jié)子活性的新mirna。具體地，通過經(jīng)培養(yǎng)的細胞的相差顯微術、測量細胞脂質含量(使用油紅o染色或尼羅紅熒光染色)；線粒體含量(例如，使用lifetechnologiesmito-trackerredfm)，和/或體外氧消耗(例如，使用seahorsebioscienceextra-cellularfluxinstrument)來評估在存在或不存在mirna激動劑或拮抗劑的情況下生長的經(jīng)培養(yǎng)的人脂肪細胞和來源于間充質干細胞的脂肪組織，持續(xù)兩周。通過靶向的q-rt-pcr、nanostring和通用rna測序來測量mrna表達。由通過靶向的western印跡和通用蛋白質組學分析(proteomicprofiling)來測量蛋白質表達。a.人前脂肪細胞分化成脂肪細胞。1.分化方案。為了評估m(xù)irna類似物對人前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞的影響，在第0天將人皮下的前脂肪細胞(來自8名女性供體的superlot0048，zenbio，nc)平板接種于96孔板上，并使其在前脂肪細胞培養(yǎng)基(dmem/ham’sf-12(1∶1，v/v)、hepes緩沖劑、胎牛血清和抗生素)中附著過夜。次日(第1天)，去除該培養(yǎng)基，并用分化培養(yǎng)基(dmem/ham’sf-12(1∶1，v/v)，100μm抗壞血酸，0.85μm胰島素，20nm亞硒酸鈉，0.2nm三-碘甲狀腺原氨酸，1μm地塞米松，100μm異丁基-甲基黃嘌呤，100nm羅格列酮和抗生素)更換。將細胞于37℃，5％co2中孵育2天。兩天后(第3天)，去除該培養(yǎng)基，并用新鮮維持培養(yǎng)基(dmem/ham’sf-12(1∶1，v/v)，100μm抗壞血酸，0.85μm胰島素，20nm亞硒酸鈉，0.2nm三-碘甲狀腺原氨酸和抗生素)更換。在第3天，用mirna類似物(dharmacon特異性miridian模擬物和發(fā)夾抑制劑)，使用轉染試劑dharmafect1轉染細胞。所有處理為一式三份。在轉染后，陰性對照為僅維持培養(yǎng)基，并且陽性對照為具有100nmpparg激動劑羅格列酮的維持培養(yǎng)基。2天后，去除培養(yǎng)基，并用新鮮的維持培養(yǎng)基替換。然后，每兩天更換維持培養(yǎng)基，直至處理時間結束(第15天)。在處理結束時(總共培養(yǎng)15天)，將細胞加工用于表型篩選和基因型篩選。2.前脂肪細胞的轉染.使用轉染試劑促進mirna類似物滲透進靶細胞中。例如，本文中描述了我們用轉染試劑dharmafect1(dharmacon，co)在前脂肪細胞中實現(xiàn)的轉染效率的范圍。通過兩種方式來評估轉染效率：a.用熒光mirna類似物轉染后測量細胞的表面熒光。在第15天測量第3天用dy547標記的非靶向miridian模擬物和發(fā)夾抑制劑(100nm)轉染的細胞中的熒光(540激發(fā)/590發(fā)射)。如圖9所示，用熒光mirna類似物轉染的細胞具有顯著更強的熒光，甚至在轉染后第12天亦如此：b.對照基因表達的降低。為了確認前脂肪細胞的成功轉染，在用gapdh特異性sirna轉染前脂肪細胞后4天(第7天)(圖10a)和12天(第15天)(圖10b)測量對照基因gapdh(“管家基因”)的表達降低。得到細胞裂解物，并使用通過細胞-至-ct試劑得到的純rna來進行rt-pcr。在轉染后第4天和第12天觀察到gapdhmrna表達的91％和86％敲除，這兩者都是高度顯著的，如圖10a和10b所示。3.在人前脂肪細胞分化成脂肪細胞過程中的表型變化.在處理結束時(培養(yǎng)的第15天)，用油紅o對細胞進行染色來評估脂質含量。如圖11a至11f所示，在不含羅格列酮的培養(yǎng)基存在的情況下，前脂肪細胞顯示基本沒有分化成加載有脂質的成熟脂肪細胞。在含有100nm羅格列酮的分化培養(yǎng)基的存在下保持兩天，隨后在維持培養(yǎng)基中保持12天(陰性對照)，觀察到一些分化成加載有脂質的成熟脂肪細胞。在整個實驗中100nm羅格列酮都存在的情況下(陽性對照)，大多數(shù)細胞變成加載有脂質的成熟脂肪細胞。例如，在25nmhsa-mir-30b模擬物存在的情況下，約一半的細胞變成加載有脂質的成熟脂肪細胞。非靶向mirna模擬物和抑制劑示出與陰性對照相似的模式。4.在人前脂肪細胞分化成脂肪細胞過程中的基因型變化.通過rna-seq技術來進行在人前脂肪細胞由羅格列酮或mirna類似物誘導分化成成熟脂肪細胞期間發(fā)生的mrna變化的作圖。小rna測序(rna-seq)是一種高通量的新一代測序平臺，其現(xiàn)在允許在不需要在先的序列或二級結構信息的情況下對所有小rna(已知或未知)進行轉錄組寬度的作圖。從前脂肪細胞(前脂肪細胞陰性對照)和在100nm羅格列酮(分化陽性對照)或25nmmirna模擬物或抑制劑的存在下培養(yǎng)12天的前脂肪細胞中提取rna樣品。使用illuminahi-seq2000設備進行rna測序。將結果針對人基因組19進行作圖(http：//genome.ucsc.edu/)。似乎在mirna類似物的存在下，相對于前脂肪細胞，313至449個mrna存在顯著差異的表達。相對于羅格列酮，顯著差異表達的基因數(shù)減少111至216個，從而提示mirna和pparg類似物之間激活脂肪細胞分化的共同通路。關于我們的83種產(chǎn)熱激活蛋白和抑制劑，其中73種的表達在羅格列酮或mirna類似物的存在下改變。在羅格列酮的存在下(圖12a)，或在mirna類似物hsa-let-7a抑制劑、hsa-mir-1模擬物、hsa-mir-19b模擬物、hsa-mir-30b模擬物或對照脂肪細胞的存在下，產(chǎn)熱靶標mrna表達的改變分別在圖12b至12f中示出。在羅格列酮或mirna類似物的存在下，還測量了ucp1、ucp2和ucp3的mrna表達的改變，如下文表18所示。表18.產(chǎn)熱mrna表達的變化：這三種解偶聯(lián)蛋白的表達水平在前脂肪細胞中低。在隔天隨培養(yǎng)基更換的100nm羅格列酮的存在下，ucp1的表達顯著升高。隨mirna類似物的ucp1mrna的升高幅度低于羅格列酮，但是我們必須記住所使用的mirna類似物濃度(25nm)，以及僅在rna提取12天前進行了一次轉染的事實。主要發(fā)現(xiàn)的是，在羅格列酮以及mirna類似物的存在下ucp2表達大幅升高。ucp3的表達在任何條件下都沒有變化，如所預期的，其是主要在肌細胞中表達的基因。ucp1和ucp2表達的該升高說明，施用這些mirna使得細胞分化成具有更大產(chǎn)熱潛力的脂肪細胞，因此這些mirna很可能是用于治療肥胖和另一些代謝疾病或病癥的有效藥物。此外，我們觀察了在mirna類似物的存在下前脂肪細胞培養(yǎng)期間差異表達的基因。例如在圖13中所示，作了m-a圖以顯示在維持培養(yǎng)基中生長的前脂肪細胞和在hsa-mir-19b模擬物的存在下生長的前脂肪細胞之間mrna表達的差異。x軸是平均基因表達，并且y軸是成對之間在對數(shù)級上的差值。紅點是差異表達的基因(上調大于0并且下調小于0)?；尹c是對照和hsa-mir-19b模擬物之間沒有差異表達的基因(上調大于0并且下調小于0)。例如在圖14中所示，相對于在僅維持培養(yǎng)基培養(yǎng)的前脂肪細胞，在mirna類似物hsa-let-7a抑制劑、hsa-mir-1模擬物、hsa-mir-19b模擬物和hsa-mir-30b模擬物的存在下顯著差異表達的基因數(shù)目分別是406、382、370和433。127個基因的組被這4種mirna類似物共同上調(維恩圖，圖14)。它們不僅包括我們的83種產(chǎn)熱靶標中的一些如aldh1a1、azgp1、cebpa、ppargc1a、ucp1和ucp2，還包括脂類代謝和脂肪細胞分化中涉及的許多基因(表19)。表19.被4種mirna類似物共同上調的127個基因的組：60個基因的組被這4種mirna類似物共同下調(維恩圖，圖15)。它們包括許多趨化因子基因以及細胞增殖中涉及的基因(表20)。表20.被4種mirna類似物共同下調的60個基因的組：actc1cenpfid1krtap2-1anlnckap2lid3mallarsicxcl1ier3mmp3atoh8cxcl2il13ra2ncaphaurkbcxcl3il6phlda1blmcxcl5il8plk1brca2cxcl6inhbappapdc1abub1e2f7iqgap3ptgs2bub1besco2kiaa1244relncasc5fam83dkif11shcbp1ccl26gabbr2kif14slc17a9cdc6grem2kif18bslc6a17cdca5gtse1kif2cthbdcdca8has1kifc1tmsl3cdh15hjurpkrt34top2ab.人白色脂肪細胞分化成褐色脂肪細胞。1.分化方案。為了評估m(xù)irna類似物對人白色脂肪細胞分化成褐色脂肪細胞的影響，在第0天將人皮下的前脂肪細胞(來自8名女性供體的superlot0048，zenbio，nc)平板接種于96孔板上，并使其在前脂肪細胞培養(yǎng)基(dmem/ham’sf-12(1∶1，v/v)、hepes緩沖劑、胎牛血清和抗生素)中附著過夜。在下一天(第1天)，去除該培養(yǎng)基，并用分化培養(yǎng)基-2(dmem/ham’sf-12(1∶1，v/v)、hepes緩沖劑、胎牛血清、生物素、泛酸鹽/酯、人胰島素、地塞米松、異丁基-甲基黃嘌呤、專利的pparg激動劑和抗生素)更換。使細胞于37℃，5％co2中孵育7天。7天后(第7天)，用am-1脂肪細胞維持培養(yǎng)基(dmem/ham’sf-12(1∶1，v/v)、hepes緩沖劑、胎牛血清、生物素、泛酸鹽/酯、人胰島素、地塞米松和抗生素)更換部分培養(yǎng)基。使細胞于37℃，5％co2中再孵育7天。在第17天，用mirna類似物(dharmacon特異性miridian模擬物和抑制劑)，使用轉染試劑dharmafect3轉染細胞。所有處理一式三份進行。在轉染后，陰性對照為僅維持培養(yǎng)基，并且陽性對照為具有100nmpparg激動劑羅格列酮的維持培養(yǎng)基。2天后，去除培養(yǎng)基，并用新鮮的維持培養(yǎng)基替換。然后，每2至3天更換維持培養(yǎng)基，直至處理持續(xù)時間結束(第30天)。在處理結束時(總共培養(yǎng)30天)，將細胞加工用于表型篩選和基因型篩選。2.脂肪細胞的轉染。使用轉染試劑以促進mirna類似物滲透進靶細胞中。例如，本文中描述了我們用轉染試劑dharmafect3(dharmacon，co)在脂肪細胞中實現(xiàn)的轉染效率的范圍。通過兩種方式來評估轉染效率：a.用熒光mirna類似物轉染后測量細胞表面熒光。在第30天測量第17天用dy547標記的非靶向miridian模擬物和發(fā)夾抑制劑(100nm)轉染的細胞中的熒光(540激發(fā)/590發(fā)射)。如圖16所示，用熒光mirna類似物轉染的細胞具有顯著更強的熒光，甚至在轉染后第12天亦如此。b.對照基因表達的降低。為了確認脂肪細胞的成功轉染，在用gapdh特異性sirna進行的dharmafect3(dharmacon，co)介導的脂肪細胞轉染后4天(第22天)和12天(第30天)測量對照基因gapdh(“管家基因”)的表達降低。得到細胞裂解物，并使用通過細胞-至-ct試劑得到的純rna來進行rt-pcr。用轉染試劑dharmafect3實現(xiàn)了對成熟脂肪細胞(已知難以進行轉染的細胞類型)的有效轉染，在轉染后第4天和第12天觀察到gapdhmrna表達的54％和71％敲除，這兩者都是高度顯著的，如圖17所示。3.將人脂肪細胞維持在培養(yǎng)物中30天的過程中表型的變化。在處理結束時(總培養(yǎng)30天)，用油紅o對細胞進行染色來評估脂質含量(圖18)。在第16天至第30天僅維持培養(yǎng)基的存在下(對照)，脂肪細胞表現(xiàn)出加載有大脂滴。在100nm羅格列酮整個實驗過程中都存在的情況下(陽性對照)，紅色染色的強度似乎降低了，并且脂滴看起來更小。例如，在25nmhsa-mir-30b模擬物存在的情況下，紅色染色似乎也降低了，并且脂滴看起來更小。在非靶向mirna類似物存在的情況下，未觀察到這樣的變化。用熒光尼羅紅染料測量第30天存在于成熟脂肪細胞中的脂質的量。如圖19所示，在第15天至第30天不暴露于羅格列酮的脂肪細胞中觀察到最高熒光。在用非靶向mirna模擬物和抑制劑轉染的細胞中觀察到相似的熒光水平。當將細胞暴露于羅格列酮兩天時，熒光顯著下降，并且在第15天至第30天存在羅格列酮的情況下，熒光進一步降低?？雌饋碓谑茉嚨膍irna抑制劑存在的情況下，熒光水平處于用羅格列酮2天至貫穿實驗所觀察到的范圍內。在mirna模擬物存在的情況下，熒光水平看起來更低，指示更低的脂質含量。4.人成熟脂肪細胞轉染的優(yōu)化。已知成熟脂肪細胞有效轉染是難以實現(xiàn)的，我們測試了11種不同轉染試劑，并且評估了對照基因gapdh的mrna表達的降低程度。將人皮下前脂肪細胞平板接種于6孔板中，并根據(jù)上文描述的方案分化兩周。然后，根據(jù)其制造商的操作方案使用轉染試劑將靶向gapdh的mirna模擬物(50nm)引入分化的脂肪細胞。將經(jīng)轉染的細胞用試劑和mirna模擬物孵育72小時，然后轉移至維持培養(yǎng)基。轉染14天后，使用gapdhrneasymini試劑盒分離rna，并且在使用每孔100ngcdna一式三份對對照基因gapdh和參考基因18s進行rt-pcr反應。除了在實驗條件下可產(chǎn)生潛在細胞毒性的轉染試劑transittko和transitsiquest外，每個孔提取的rna的量非常相似(圖20)。用dharmafect1和siportneofx轉染的細胞具有顯著降低的18s表達水平，并且從rt-pcr實驗分析中排除。在余下的7種轉染試劑分析中，經(jīng)常使用的轉染試劑lipofectaminernaimax導致在轉染后的第14天gapdh表達降低66％，dharmafect3和dharmafect4分別導致gapdh表達降低60％和75％(圖21)。5.在mirna類似物或已知的脂肪生成和/或產(chǎn)熱之激活蛋白的存在下培養(yǎng)兩周的人成熟脂肪細胞的表型變化。如上文所述，將人皮下脂肪細胞以每孔391,000個細胞的密度平板接種于6孔板中。使用dharmafect4，在第14天用以下物質轉染這些脂肪細胞：1.以下mirna類似物中的一種(50nm)：-hsa-let-7a抑制劑(hsa-let-7a是報道的調節(jié)脂肪生成的通用mirna)-hsa-mir-1模擬物(據(jù)報道hsa-mir-1調節(jié)prdm16和ucp1)-hsa-mir-19b模擬物(hsa-mir-19b是豐富的脂肪細胞mirna，根據(jù)我們的計算機分析，預測其與我們的83種靶標中的許多相互作用)或者-hsa-mir-30b模擬物(根據(jù)我們的計算機分析，預測hsa-mir-30b與我們的83種靶標中的許多相互作用)2.陰性對照(模擬轉染)3.三種陽性對照(已知改變脂肪生成和/或適應性產(chǎn)熱的pparg激動劑羅格列酮(100nm)，β3腎上腺素能受體激動劑cl316,243(10μm)或甲狀腺激素三-碘甲狀腺原氨酸(10nm))。在第17天，將細胞轉移到維持培養(yǎng)基中，然后每2至3天更換培養(yǎng)基，直至第28天，拍攝細胞的明場顯微鏡圖片。如圖22所示，并對比于對照條件，在陽性對照cl316,243和羅格列酮的存在下，以及在hsa-let-7a抑制劑、has-mir-19b和hsa-mir-30b模擬物的存在下，細胞密度增加，并且外觀“變褐”。不同試劑對細胞密度、脂質含量、脂滴數(shù)量和大小的影響總結于表21中。表21.實施例4.通過熒光素酶活性和qrt-pcr進行的高通量mirna靶標篩選使用熒光素酶報告子測定構建體的高通量篩選用于鑒定產(chǎn)熱中涉及的新mirna靶標。熒光素酶通常用作報告子，以評估用包含在目的啟動子控制下的熒光素酶基因的基因構建體轉染的細胞中的轉錄活性。switchgeargenomics已經(jīng)建立了全基因組文庫，將超過18,000種人啟動子和12,000種人3’utr區(qū)克隆至包含switchgear’srensp報告子盒(goclonetm)作為lightswitchtm熒光素酶測定系統(tǒng)組分的優(yōu)化的熒光素酶報告基因載體系統(tǒng)中。該熒光素酶的改進形式極大地促進了詳細的動力學研究，特別是那些聚焦于抑制上的研究，否則這樣的抑制可能被報告蛋白積累而掩蓋。用switchgeargenomicgoclone系統(tǒng)，使用ucp1作為單一的產(chǎn)熱靶基因測試了多種微小rnas-一種mrna范例。為了探索多種人mirna與hela細胞和hepg2細胞中的人ucp1基因的3’utr區(qū)、5’utr區(qū)和啟動子/增強子區(qū)的可能相互作用，制備了三種報告基因構建體：1.人ucp13’utr構建體，其包含被強組成型啟動子(rpl10-prom)驅動的報告基因以及克隆于報告基因3’utr區(qū)中的人ucp1序列2,218bp3’utr片段。將特異性mirna模擬物、抑制劑或非靶向對照對該報告基因之活性的影響與由空的3’utr和肌動蛋白β-3’utr的那些進行對比，以鑒定對假定的ucp13’utr構建體具有特異性的影響。2.人ucp1啟動子構建體，其包含由人ucp1序列的4,147bp5’utr片段驅動的報告基因，所述人ucp1序列跨越轉錄起始位點和覆蓋人ucp1基因序列之甲基化區(qū)和增強子區(qū)的上游區(qū)域。將特異性mirna模擬物、抑制劑或非靶向對照對該報告基因之活性的影響與肌動蛋白β啟動子的那些進行對比，以鑒定對假定的ucp15’utr構建體具有特異性的影響。3.人ucp1增強子區(qū)構建體，其包含由來自hsv-tk基因座的短的最小啟動子驅動的報告基因以及跨越人ucp1基因序列之增強子區(qū)的人ucp1序列的601bp5’utr片段的。將特異性mirna模擬物、抑制劑或非靶向對照對該報告基因活性的影響與由空的5’增強子區(qū)的那些進行對比，以鑒定對假定的ucp15’增強子構建體具有特異性的影響。此外，制備了mirnaxxx_3’utr構建體。它們包含由與克隆于報告基因3’utr區(qū)的mirnaxxx靶序列完全匹配之強啟動子(rpl10_prom)驅動的報告基因。將mirna模擬物、抑制劑或非靶向對照對該報告基因活性的影響與empty_3’utr和肌動蛋白b_3’utr進行對比，以確定mirna模擬物或抑制劑的活性是否可以在實驗細胞類型中進行被合理地檢測到。如果該細胞類型沒有目的mirna的內源性表達，則模擬物的添加應敲低了該報告子的活性，并且抑制劑的添加應沒有顯著效果。如果該細胞類型具有目的mirna的內源性高表達，則添加抑制劑應提高該報告基因的活性，并且添加模擬物沒有顯著效果。在hela和hepg2細胞類型中，內源mirna的表達是寬范圍的，因此，合成靶標活性的變化很可能影響可變性。對于每種mirna候選物(總共38種)，測試以下條件：-hela細胞中的mirna模擬物(特異性)＊8種報告基因構建體-hepg2細胞中的mirna模擬物(特異性)＊8種報告基因構建體-hela細胞中的mirna模擬物非靶向對照＊8種報告基因構建體-hepg2細胞中的mirna模擬物非靶向對照＊8報告基因構建體-hela細胞中的mirna抑制劑(特異性)＊8種報告基因構建體-hepg2細胞中的mirna抑制劑(特異性)＊8種報告基因構建體-hela細胞中的mirna抑制劑非靶向對照＊8種報告基因構建體-hepg2細胞中的mirna抑制劑非靶向對照＊8種報告基因構建體對可以與ucp1序列結合的龐大的mirna列表施加10種過濾條件(除了需要與ucp13’utr區(qū)結合之外的)，以減少待測試mirna候選物的數(shù)量。這些過濾條件是，結合位點長度、結合位點數(shù)目、與5’utr區(qū)的結合、具有其他mirna的染色體群、內含子位置、擺動、跨物種表達、與增強子區(qū)的結合、與甲基化區(qū)的結合以及證明與ucp1有關的實驗證據(jù)。對滿足這些標準中至少3個的38種mirna中進行測試(表22)。表22.在ucp1基因序列中具有假定的結合位點的mirna：在這些熒光素酶報告基因測定實驗中，如果滿足特定mirna抑制劑使熒光素酶信號升高以及特定mirna模擬物使熒光素酶信號降低二者，并且抑制劑/模擬物比率≥1.5和或/p值＜0.05，則mirna候選物視為與ucp1相互作用。這些選擇標準鑒定出9種mirna(hsa-mir-19b-2-5p、ha-mir-21-5p、hsa-mir-130b-5p、hsa-mir-211、hsa-mir-325、hsa-mir-382-3p/5p、hsa-mir-543、hsa-mir-515-3p和hsa-mir-545)(表23)。還有一些勉強符合這些選擇標準；它們是hsa-mir-331-5p、hsa-mir-552、hsa-mir-620和hsa-mir-1179。表23.通過hela和/或hepg2細胞中的熒光素酶測定鑒定為ucp1基因表達調節(jié)子的mirna：細胞系mirnahelahsa-mir-130b-5phela+hepg2hsa-mir-19b-2-5phepg2hsa-mir-382-3p/5phelahsa-mir-515-3phelahsa-mir-543hepg2hsa-mir-545hela+hepg2hsa-mir-21-5phelahsa-mir-211-5phela+hepg2hsa-mir-325這9種選擇的mirna中，3種呈現(xiàn)與被研究的ucp1的3個區(qū)域結合(hsa-mir-21-5p、hsa-mir-211和hsa-mir-515-3p)；3種呈現(xiàn)與ucp1的2個區(qū)域結合(hsa-mir-19b-2-5p、hsa-mir-130b-5p和hsa-mir-325)，并且3種與ucp1的單個區(qū)域結合(hsa-mir-331-5p、hsa-mir-543和hsa-mir-545)。除hsa-mir-331-5p以外的所有mirna都顯示與ucp1的3’utr區(qū)結合(表24)。表24.通過熒光素酶測定鑒定為ucp1基因表達調節(jié)子的mirna：mirnaucp13′utrucp1增強子ucp1啟動子1hsa-mir-21-5pxxx2hsa-mir-211xxx3hsa-mir-515-3pxxx4hsa-mir-19b-2-5pxx5hsa-mir-130b-5pxx6hsa-mir-325xx7hsa-mir-331-5px8hsa-mir-543x9hsa-mir-545x通過以下來進行進一步篩選：將啟動子/3′utr文庫轉染至細胞培養(yǎng)物中的人脂肪細胞或脂肪來源的間充質干細胞中，然后向細胞培養(yǎng)物中添加mirna試劑(例如agomir或antagomir)。在轉染并添加了mirna試劑24小時后進行熒光素酶活性測量和mrna鑒定。為了在更長的時間框架中驗證上文記載的轉染實驗結果，使用包含目的目的mirna試劑(來自在允許copgfp熒光標記表達的pmirna1sbi載體中表達的mirna前體的systembiosciences(sbi)收集物)的慢病毒載體進行慢病毒轉導實驗。具體地，根據(jù)供應商的使用說明，用慢病毒顆粒以1∶10的moi轉導包含啟動子/3′utr文庫的細胞，并且通過facs分選gfp陽性細胞。在幾個時間點(0小時、3小時和6小時；1天、4天和7天)通過taqman實時定量pcr評估對照細胞(hek293細胞)、人脂肪來源的間充質干細胞、人皮下前脂肪細胞和人增殖皮下脂肪細胞中成熟的mirna以及它們靶向的mrna的表達水平。匯集來自轉導后5個不同時間點的rna，任選地用于降低基于qrt-pcr的篩選方法的復雜性，同時保持檢測靈敏性。實施例5.蛋白質組學分析還使用蛋白質組學分析來鑒定產(chǎn)熱涉及的新的mirna靶標。鳥槍法蛋白質組學是使用高效液相色譜(hplc)聯(lián)合質譜(ms)在復雜混合物中鑒定蛋白質的方法。收獲經(jīng)mirna試劑和啟動子/3′utr文庫轉染和轉導的細胞(如實施例4中所描述)，并使其裂解以產(chǎn)生粗制的可溶(胞質)級分和不溶(核)級分。然后通過hplc從這些級分中分離肽，并使用納電噴霧-離子化串聯(lián)ms使用同位素標記技術silac進行分析，以對蛋白質豐度進行定量。針對ensembl公開的(release)54種人蛋白質編碼序列數(shù)據(jù)庫，使用sequest(bioworks版本3.3.1，thermoscientific)來檢索譜。為了避免錯過低豐度蛋白質，還使用了靶向蛋白質組學方法以對作為已知的脂肪生成、脂肪細胞分化和bat功能之調節(jié)子的一系列蛋白質進行精確定量。一些實例包括ucp1、kdm3a、prdm16、ppara、ppargc1a、cebpb、cidea、bmp7、cox7a1、sirt1、sirt3、dio2、fabp4和adipoq。經(jīng)基于elisa或基于luminex的免疫測定使用市售抗體來分析這些蛋白質。任選地，在蛋白質組學平臺上使用多反應監(jiān)測-質譜來分析蛋白質級分，借此使用lc-ms-ms精確定量產(chǎn)熱通路的僅一種蛋白質(例如ucp1)。實施例6.特異性靶向人脂肪細胞的克隆dna適配體的開發(fā)和表征我們使用了cell-selex技術來開發(fā)和表征特異性識別成熟的人皮下脂肪細胞的dna適配體。使用cell-selex，通過重復擴增和與活細胞結合來選擇識別完整細胞表面上的天然環(huán)境中處于其天然構象的特定分子的適配體。在圖23描述的基于細胞的選擇中，可在其天然環(huán)境中直接靶向特定的已知或未知的細胞表面標志物或膜受體，從而允許對細胞特異性適配體的直接富集。cell-selex由靶細胞的正選擇和非靶標細胞的負選擇的組合組成。在本發(fā)明的情況下，用新鮮分離的人肝細胞進行負選擇，用人皮下脂肪細胞的初級培養(yǎng)物來進行正選擇。完成了從32聚體文庫中的兩輪負選擇和五輪正選擇。對分離的適配體進行測序、合成并用6-熒光素酰胺(fam)標記，用于結合研究。用飽和濃度(1μm)的fam綴合的適配體在室溫標記人肝細胞(陰性細胞)和脂肪細胞(陽性細胞)15分鐘，并通過熒光活化細胞分選(facs)來分析。如圖24所示，一些適配體(例如，適配體974)既不與脂肪細胞結合也不與肝細胞結合，一些適配體(例如，適配體975與脂肪細胞和肝細胞二者都結合，比率：2.69)，并且另一些適配體優(yōu)選與脂肪細胞結合(例如aptamers972和973，比率分別為：4.76和5.40)。這些脂肪細胞特異性的適配體的進一步表征還在進行中。實施例7.表型、基因型和蛋白質組學數(shù)據(jù)集的統(tǒng)一(reconciliation)在此處將實施例3至5記載的體外實驗結果進行統(tǒng)一。具體地，為了將微小rna、mrna和靶蛋白質以及通路的初始集合進一步精選為相關的但是可管理的靶標數(shù)目，用網(wǎng)絡檢索和分析壓縮包(david，ingenuitysystemsipa和ariadnepathwaystudio)整合實驗數(shù)據(jù)。本文中，用businessintelligence工具tibcospotfire來對實施例3至5中記載的體外實驗結果進行全局性分析。這使得能夠使mirna試劑和靶基因之間的關系可視化。實施例8.肥胖動物模型已經(jīng)開發(fā)并驗證了數(shù)種肥胖動物模型(kanasakik等，j.biomed.biotechnol.，2011：197636(2011)；speakmanj等，obesityreviews：anofficialjournaloftheinternationalassociationforthestudyofobesity，8suppl1：55-61(2007))。最常用的是瘦素信號缺陷的lepob/ob小鼠模型和leprdb/db小鼠模型，以及c57bl/6j小鼠中的高脂肪膳食模型(wangcy等，methodsinmolecularbiology，821：421-433(2012))。這種膳食誘導的肥胖(diet-inducedobesity，dio)模式近似地模仿了現(xiàn)代社會中的高脂肪/高密度食物的提高的可獲得性。dio小鼠模型用于體內驗證本文描述的mirna類似物在提高產(chǎn)熱和/或治療肥胖和另一些代謝疾病的有效性(yinh等，cellmetab.，17(2)：210-224(2013))。向dio小鼠施用以下的一種或更多種：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir中。使用羅格列酮作為陽性對照。在處理前和處理后測量小鼠的食物攝取、血液代謝參數(shù)、身體組成(體重、體脂肪、骨礦物質和瘦體重(leanmass)、體脂分布、體溫、o2消耗和co2產(chǎn)生、運動誘導的產(chǎn)熱、冷誘導的產(chǎn)熱和靜息產(chǎn)熱。體重或體脂肪的降低或者體溫升高或者任何類型的產(chǎn)熱都指示所使用組合物的體內有效性。實施例9.人ucp1和ucp2基因的核酸序列和轉錄物表25.人ucp1基因的1,462堿基對(bp)轉錄物enst00000262999的核酸序列(六個外顯子以大寫字母示出)：表26.人ucp1基因(ensg00000109424)的9,371堿基對(bp)核酸序列(外顯子以黑體字示出)：＞染色體：grch37：4：141479988：141490559：-1表27.人ucp1基因的15,910堿基對(bp)核酸序列(ncbi參考序列：ng_012139.1，4號染色體上的refseqgene)：(seqidno：637)表28.人ucp2基因的2,113堿基對(bp)轉錄物enst00000310473的核酸序列(八個編碼外顯子以大寫字母示出)：表29.人ucp2基因的15,174堿基對(bp)核酸序列(ensg00000175567)，包括5,000bp5’utr和2,000bp3’utr(八個外顯子突出顯示)：以下內容對應于母案申請中的原始權利要求書，現(xiàn)作為說明書的一部分并入此處：1.一種調節(jié)細胞中的呼吸鏈解偶聯(lián)的方法，所述方法包括使所述細胞與調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之活性的mirna試劑接觸。2.根據(jù)項1所述的方法，其中所述細胞是前脂肪細胞、脂肪細胞、脂肪組織來源的間充質干細胞、肝細胞、肌細胞或其前體。3.一種調節(jié)組織中的產(chǎn)熱的方法，所述方法包括使所述組織與調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之活性的mirna試劑接觸。4.根據(jù)項3所述的方法，其中所述組織是褐色脂肪、白色脂肪、皮下脂肪組織、肝或肌肉。5.根據(jù)項4所述的方法，其中使所述組織與所述mirna試劑離體接觸。6.一種治療有此治療需要的人對象之肥胖的方法，所述方法包括向所述人對象施用有效量的調節(jié)至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之活性或表達的mirna試劑。7.根據(jù)項6所述的方法，其中所選進行治療的所述人對象具有肥胖的遺傳素質或表觀遺傳素質。8.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述線粒體解偶聯(lián)劑是ucp1或ucp2。9.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑是選自以下的mirna：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、mir-19a-b、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556和hsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。10.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑是選自表1、11、13和14中記載的mirna中的mirna。11.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑是選自以下的mirna的agomir或antagomir：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、mir-19a-b、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556、和hsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96以及hsa-mir-99a。12.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑是選自表1、11、13和14中記載的mirna的agomir或antagomir。13.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑是選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-19b-2-5p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-130b-5p、hsa-mir-211、hsa-mir-325、hsa-mir-382-3p/5p、hsa-mir-543、hsa-mir-515-3p和hsa-mir-545。14.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑是選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-331-5p、hsa-mir-552、hsa-mir-620和hsa-mir-1179。15.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑與靶向部分連接。16.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述靶向部分是適配體。17.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述靶向部分將所述mirna試劑遞送至特定細胞類型或組織。18.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的mrna或啟動子區(qū)結合。19.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之mrna的5’utr或編碼序列結合。20.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述mirna試劑調節(jié)線粒體解偶聯(lián)蛋白的激活蛋白或阻抑蛋白的活性。21.根據(jù)項18所述的方法，其中所述激活蛋白或阻抑蛋白選自表2中記載的激活蛋白或阻抑蛋白。22.根據(jù)項20或21所述的方法，其中所述mirna試劑直接與所述激活蛋白或阻抑蛋白的mrna或啟動子區(qū)結合。23.根據(jù)項20或21所述的方法，其中所述mirna試劑直接與所述激活蛋白或阻抑蛋白之mrna的5’utr或編碼序列結合。24.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中上調所述線粒體解偶聯(lián)蛋白的mrna或蛋白質表達。25.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中上調所述線粒體解偶聯(lián)蛋白的線粒體解偶聯(lián)活性。26.一種篩選調節(jié)產(chǎn)熱的mirna試劑的方法，所述方法包括：a)提供包含人基因組的指示細胞；b)使所述指示細胞與受試mirna試劑接觸；以及c)在存在和不存在所述mirna試劑的情況下，測定所述指示細胞中的至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子的細胞活性，其中，在存在所述受試mirna試劑的情況下所述產(chǎn)熱調節(jié)子活性的改變將所述受試mirna試劑鑒定為調節(jié)產(chǎn)熱的mirna試劑。27.根據(jù)項26所述的方法，其中所述細胞是脂肪細胞、脂肪組織來源的間充質干細胞、肝細胞、肌細胞或其前體。28.根據(jù)項26所述的方法，其中在步驟(c)中測定的所述產(chǎn)熱調節(jié)子的細胞活性是所述產(chǎn)熱調節(jié)子的mrna表達水平、蛋白質表達水平或線粒體解偶聯(lián)活性。29.根據(jù)前述項中任一項所述的方法，其中所述產(chǎn)熱調節(jié)子是ucp1。30.一種調節(jié)細胞中至少一種產(chǎn)熱調節(jié)子之活性的agomir或antagomir。31.根據(jù)項30所述的agomir或antagomir，其為選自表1、11、13和14中記載的mirna中的mirna的agomir或antagomir。32.根據(jù)項30所述的agomir或antagomir，其為選自以下的mirna的agomir或antagomir：hsa-mir-1-1、hsa-mir-1-2、mir-19a-b、hsa-mir-105、hsa-mir-1283、hsa-mir-129、hsa-mir-133a-1、hsa-mir-133a-2、hsa-mir-143、hsa-mir-143-5p、hsa-mir-147、hsa-mir-149、hsa-mir-199a、hsa-mir-199b、hsa-mir-200c、hsa-mir-204、hsa-mir-205、hsa-mir-206、hsa-mir-21、hsa-mir-211、hsa-mir-218、hsa-mir-218-1、hsa-mir-218-2、hsa-mir-219-2、hsa-mir-219-2-3p、hsa-mir-22、hsa-mir-22-3p、hsa-mir-22-5p、hsa-mir-24-2、hsa-mir-30a-e、hsa-mir-3177-5p、hsa-mir-325、hsa-mir-331、hsa-mir-331-5p、hsa-mir-3613-3p、hsa-mir-362、hsa-mir-362-5p、hsa-mir-3658、hsa-mir-367、hsa-mir-371、hsa-mir-371-5p、hsa-mir-377、hsa-mir-378、hsa-mir-378a-5p、hsa-mir-382、hsa-mir-383、hsa-mir-422a、hsa-mir-425、hsa-mir-455-3p、hsa-mir-455-5p、hsa-mir-491、hsa-mir-508、hsa-mir-508-5p、hsa-mir-512-1、hsa-mir-512-2、hsa-mir-515-3p、hsa-mir-519e、hsa-mir-520a、hsa-mir-543、hsa-mir-545、hsa-mir-549、hsa-mir-556和hsa-mir-568、hsa-mir-620、hsa-mir-643、hsa-mir-654-3p、hsa-mir-7a-g、hsa-mir-765、hsa-mir-871、hsa-mir-888、hsa-mir-888-3p、hsa-mir-92b、hsa-mir-93、hsa-mir-96和hsa-mir-99a。33.根據(jù)項30所述的agomir或antagomir，其為選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-19b-2-5p、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-130b-5p、hsa-mir-211、hsa-mir-325、hsa-mir-382-3p/5p、hsa-mir-543、hsa-mir-515-3p和hsa-mir-545。34.根據(jù)項30所述的agomir或antagomir，其為選自以下的mirna的antagomir：hsa-mir-331-5p、hsa-mir-552、hsa-mir-620和hsa-mir-1179。35.根據(jù)項30至34中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir與靶向部分連接。36.根據(jù)項35所述的agomir或antagomir，其中所述靶向部分是適配體。37.根據(jù)項35或36所述的agomir或antagomir，其中所述靶向部分將所述agomir或antagomir遞送至特定細胞類型或組織。38.根據(jù)項28至33中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑的mrna或啟動子區(qū)結合。39.根據(jù)項30至37中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接與至少一種線粒體解偶聯(lián)劑之mrna的5’utr或編碼序列結合。40.根據(jù)項30至37中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir調節(jié)線粒體解偶聯(lián)蛋白的激活蛋白或阻抑蛋白的活性。41.根據(jù)項30至37中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述激活蛋白或阻抑蛋白選自表2中記載的激活蛋白或阻抑蛋白。42.根據(jù)項30至37中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接與所述激活蛋白或阻抑蛋白的mrna或啟動子區(qū)結合。43.根據(jù)項30至37中任一項所述的agomir或antagomir，其中所述agomir或antagomir直接與所述激活蛋白或阻抑蛋白之mrna的5’utr或編碼序列結合。44.一種藥物組合物，其包含選自以下的兩種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。45.根據(jù)項44所述的藥物組合物，其還包含可藥用賦形劑。46.根據(jù)項44所述的藥物組合物，其中所述兩種或更多種mirna由重組載體表達。47.根據(jù)項47所述的藥物組合物，其中所述重組載體選自dna質粒、病毒載體和dna微環(huán)。48.根據(jù)項44所述的藥物組合物，其包含選自以下的兩種或更多種mirna：hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。49.根據(jù)項48所述的藥物組合物，其還包含可藥用賦形劑。50.根據(jù)項48所述的藥物組合物，其中所述兩種或更多種mirna由重組載體表達。51.根據(jù)項48所述的藥物組合物，其中所述重組載體選自dna質粒、病毒載體和dna微環(huán)。52.一種誘導前脂肪細胞分化成脂肪細胞的方法，其包括向前脂肪細胞群施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。53.根據(jù)項52所述的方法，其中使前脂肪細胞分化成脂肪細胞的誘導大于當將前脂肪細胞暴露于100nm羅格列酮兩天接著暴露于維持培養(yǎng)基時前脂肪細胞向脂肪細胞的分化。54.根據(jù)項52所述的方法，其中所述一種或更多種mirna選自hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。55.一種降低脂肪細胞之脂質含量的方法，其包括向脂肪細胞群施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir、hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。56.根據(jù)項55所述的方法，其中所述脂肪細胞的脂質含量低于暴露于100nm羅格列酮兩天隨后暴露于維持培養(yǎng)基的脂肪細胞的脂肪含量。57.根據(jù)項55所述的方法，其中所述脂肪細胞的脂質含量低于在培養(yǎng)持續(xù)時間內暴露于100nm羅格列酮之脂肪細胞的脂質含量。58.根據(jù)項57所述的方法，其中所述培養(yǎng)持續(xù)時間是8天至16天。59.根據(jù)項58所述的方法，其中所述培養(yǎng)持續(xù)時間是10天至14天。60.根據(jù)項59所述的方法，其中所述培養(yǎng)持續(xù)時間是14天。61.根據(jù)項55所述的方法，其中所述一種或更多種mirna選自hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。62.一種提高有此需要的對象之胰島素敏感性的方法，其包括向所述對象施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aagomir、hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-1antagomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-19bantagomir、hsa-mir-30bagomir和hsa-mir-30bantagomir。63.根據(jù)項62所述的方法，其中所述對象是哺乳動物。64.根據(jù)項63所述的方法，其中所述哺乳動物是人。65.根據(jù)項62所述的方法，其中所述一種或更多種mirna選自：hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。66.一種提高細胞中的一種或更多種解偶聯(lián)蛋白表達或活性的方法，其包括向所述細胞施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。67.根據(jù)項66所述的方法，其中所述細胞選自褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪細胞、肝細胞或者肌肉細胞。68.根據(jù)項66所述的方法，其中所述一種或更多種解偶聯(lián)蛋白包括ucp-1或ucp-2。69.一種引起有此需要的對象之脂肪消耗的方法，其包括向所述對象施用選自以下的一種或更多種mirna：hsa-let-7aantagomir、hsa-mir-1agomir、hsa-mir-19bagomir和hsa-mir-30bagomir。70.根據(jù)項69所述的方法，其中所述對象是哺乳動物。71.根據(jù)項70所述的方法，其中所述哺乳動物是人。72.選自表1、11、13和14中記載的mirna中的一種或更多種mirna的agomir或antagomir在制造用于治療肥胖的藥物中的用途。73.根據(jù)項72所述的用途，其中所述一種或更多種mirna選自has-let-7aantagomir、has-mir-1agomir、has-mir-19bagomir和has-mir-30bagomir。74.根據(jù)項72所述的用途，其中所述agomir或antagomir與靶向部分連接。75.根據(jù)項74所述的用途，其中所述靶向部分是適配體。76.一種用于治療肥胖的組合物，其包含選自表1、11、13和14中記載的mirna之一種或更多種mirna的agomir或antagomir。77.根據(jù)項76所述的組合物，其中所述一種或更多種mirna選自has-let-7aantagomir、has-mir-1agomir、has-mir-19bagomir和has-mir-30bagomir。78.根據(jù)項76所述的組合物，其中所述agomir或antagomir與靶向部分連接。79.根據(jù)項76所述的組合物，其中所述靶向部分是適配體。當前第1頁12