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鑒定豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌組合物和方法與流程

文檔序號:12249808閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種鑒定豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌的組合物,其特征在于,所述組合物至少包含如下兩組引物對;其中一組引物對選自由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,和序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對組成的引物對組中的至少一組引物對;另一組引物對選自由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對組成的引物對組中的至少一組引物對。

2.如權(quán)利要求1所述的組合物,其特征在于,所述組合物包含如下五組引物對:序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對。

3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物,其特征在于,所述組合物用于同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌。

4.一種含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述組合物的試劑盒。

5.如權(quán)利要求4所述試劑盒,還包括說明書。

6.一種同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的多重PCR方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:

(1)篩選具有豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的至少兩個(gè)高保守性基因片段,作為PCR檢測的靶點(diǎn)基因,分別設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增上述靶點(diǎn)基因的引物,所述引物至少包含如下兩組引物對;其中一組引物對選自由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,和序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對組成的引物對組中的至少一組引物對;另一組引物對選自由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對,和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對組成的引物對組中的至少一組引物對;

(2)將步驟(1)的引物對放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中,擴(kuò)增靶點(diǎn)基因;以及

(3)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多重PCR方法,其特征在于,步驟(1)中,豬多殺性巴氏桿菌的保守性基因片段為KMT1基因、16s rRNA,副豬嗜血桿菌pila基因、16s rRNA和lipo基因。

8.如權(quán)利要求6或7所述的多重PCR方法,其特征在于,步驟(2)中采用兩個(gè)PCR反應(yīng)體系;優(yōu)選所述兩個(gè)PCR反應(yīng)體系的退火溫度分別為55℃和58℃。

9.如權(quán)利要求8所述的多重PCR方法,其特征在于,步驟(2)所述兩個(gè)PCR反應(yīng)體系分別如下:PCR反應(yīng)體系1:DNA模板10μl,副豬嗜血桿菌16srRNA和豬多殺性巴氏桿菌16s rRNA上、下游引物分別為各1.2μl和0.8μl,PCR Mix30μl,超純水補(bǔ)充至55μl;PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min,進(jìn)入94℃60s,55℃1min和72℃1min的循環(huán),循環(huán)30次,最后72℃延伸10min;PCR反應(yīng)體系2:DNA模板12μl,副豬嗜血桿菌pila,LIPO,豬多殺性巴氏桿菌KMT1多套上、下游引物分別為各0.96μl,0.64μ和0.8μl,PCR Mix30μl,超純水補(bǔ)充至60μl;PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min,進(jìn)入94℃60s,58℃1min和72℃1min的循環(huán),循環(huán)30次,最后72℃延伸10min。

10.一種通過權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述組合物,權(quán)利要求4或5的試劑盒,權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述PCR方法對樣品進(jìn)行鑒定的方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:將待測樣品直接接種在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h后,取菌液98℃加熱10min提取病原體DNA樣品,作為模板,按照權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述方法進(jìn)行多重PCR,得到擴(kuò)增結(jié)果后確認(rèn)是否含有豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌;優(yōu)選在反應(yīng)體系1中,通過815bp的條帶鑒定副豬嗜血桿菌,通過305bp的條帶鑒定豬多殺性巴氏桿菌,在反應(yīng)體系2中,通過288bp或231bp的條帶鑒定副豬嗜血桿菌,通過588bp的條帶鑒定豬多殺性巴氏桿菌。

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