本公開涉及腸道病毒的檢測，具體地，涉及用于檢測腸道病毒的引物組、探針及試劑盒。

背景技術(shù)：

醫(yī)院、畜禽養(yǎng)殖及屠宰場等分散點源的污水中含有大量的病原微生物，使水源成為了傳染性疾病傳播的重要因子。大量的研究發(fā)現(xiàn)污水中腸道病毒造成的傳染性疾病對于公眾健康造成了巨大的威脅。腸道病毒屬于小核糖核酸病毒科，其為單正鏈RNA的無包膜病毒，具有感染性，可引起手足口病，又稱發(fā)疹性水皰型口腔炎。根據(jù)近幾年的報道，由腸道病毒EV71和CA16所引起的手足口病容易形成爆發(fā)流行，嚴重的導致患者死亡，造成大眾的恐慌。除此之外，腸道病毒中的CA10、CA6、CB3、CB5和腸道病毒Echo30也是引發(fā)手足口病的常見血清型，因而成為相關人員研究手足口病檢測對象的熱點。

由腸道病毒的流行病學可知，環(huán)境因素中經(jīng)由水傳播造成的病原體感染是其主要的途徑之一。2006年開始執(zhí)行的《醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標準》(GB18466-2005)對醫(yī)療機構(gòu)污水處理全過程的無害化提出了新的要求，增加了腸道病毒這一檢測指標。因此，建立快速、準確、簡便的污水中腸道病毒的檢測技術(shù)為污水中致病因子及相關疾病的監(jiān)測和預警提供了重要的參考，對于提高我們應對腸道病毒引發(fā)疾病的處置能力具有重要意義。

目前，聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)與環(huán)式介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)技術(shù)是最常用的腸道病毒感染診斷方法，但是，LAMP檢測RNA樣本需要設置單獨的逆轉(zhuǎn)錄步驟，60-90min才可以完成反應，且對SNP識別度不夠，引物結(jié)合區(qū)域單位點突變不能被LAMP識別。LAMP采用65℃恒溫擴增，若待檢測區(qū)域的GC含量過低、過高或者二級結(jié)構(gòu)復雜，則擴增效果較差；此外LAMP采用多組引物進行滾環(huán)復制，產(chǎn)物量巨大，極易污染實驗環(huán)境，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。而PCR存在試驗程序繁瑣、耗時較長、產(chǎn)物量巨大、易污染實驗環(huán)境產(chǎn)生假陽性結(jié)果的缺點，并且檢測需要使用精密儀器，非實驗室環(huán)境下難以現(xiàn)場檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本公開的目的是解決現(xiàn)有腸道病毒檢測中存在的檢測儀器平臺昂貴、檢測耗時長、敏感性和特異性差、檢出率低和覆蓋度差的問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本公開提供一種用于檢測腸道病毒的引物組，其中，該引物組包括SEQ ID NO.1-14所示的引物；所述腸道病毒包括腸道病毒EV71、腸道病毒CA16、腸道病毒CA10、腸道病毒CA6、腸道病毒CB3、腸道病毒CB5和腸道病毒Echo30。

上述引物組適用于重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，RPA是模擬生物體內(nèi)DNA復制、基于重組酶、聚合酶介導的擴增原理發(fā)展而來。重組酶和引物形成微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配對形成復制所需的3’羥基末端，在DNA聚合酶的作用下，在25-43℃進行復制延伸，形成新的DNA互補鏈。隨著反應進行，反應產(chǎn)物以指數(shù)級增長，5-20min即可完成檢測。與常規(guī)PCR反應不同的是，RPA反應所需引物長度通常為30-38nt。引物序列的設計與選擇對RPA的結(jié)果至關重要，其長度的增加也使引物設計及選擇難度增加。本發(fā)明中提供的引物組在適宜的引物濃度條件下，可以互不影響的在一次擴增中同時檢測腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，多重檢測時每個目標最低檢出限均達到5拷貝/體系。

本發(fā)明還提供一種與權(quán)利要求1所述的引物組配合使用的探針，其中，所述探針包括SEQ ID NO.17-23所示的探針混合物。

上述探針在設計過程中，不僅考慮到了不同目標基因在一個反應體系中共擴增的問題，還考慮到了要避免探針出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體的情況，本發(fā)明中的探針混合物能夠全面覆蓋腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，特異性良好并且覆蓋度高。

在RPA擴增體系中，本發(fā)明提供的上述探針混合物與引物組配合使用可以實現(xiàn)模板擴增的實時監(jiān)控，所述探針其中兩個堿基上各標記一個熒光基團和淬滅基團，在兩個基團之間有雙脫氧間臂(dSpacer)位點，該位點可被來自大腸桿菌的3’-5’核酸外切酶識別，可以使兩個基團分離，從而使熒光信號與擴增產(chǎn)物的累積相同步，這樣結(jié)合熒光擴增檢測儀便可在10-20分鐘內(nèi)檢測到熒光曲線。

本發(fā)明還提供一種用于檢測腸道病毒的試劑盒，其中，所述試劑盒含有SEQ ID NO.1-14所示的引物組和SEQ ID NO.17-23所示的探針混合物。

本發(fā)明提供的試劑盒，通過以上所述的引物組、探針混合物建立了7種易致病的腸道病毒RPA檢測的引物組、探針、試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、全面、敏感、特異、自動的檢測結(jié)果判定，顯著提高了對7種腸道病毒同時進行檢測的敏感性、特異性和簡便性。

本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

具體實施方式

以下是對本發(fā)明具體實施方式的詳細說明，應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅限于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種用于檢測腸道病毒的引物組，其中，該引物組包括SEQ ID NO.1-14所示的引物；所述腸道病毒包括腸道病毒EV71、腸道病毒CA16、腸道病毒CA10、腸道病毒CA6、腸道病毒CB3、腸道病毒CB5和腸道病毒Echo30。

本發(fā)明中提供的引物組在適宜的引物濃度條件下，可以互不影響的在一次RPA擴增中同時檢測腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，多重檢測對所有檢測目標的最低檢出限均達到5拷貝/體系。

本發(fā)明還提供一種與權(quán)利要求1所述的引物組配合使用的探針，其中，所述探針包括SEQ ID NO.17-23所示的探針混合物。

上述探針在設計過程中，不僅考慮到了不同目標基因在一個反應體系中共擴增的問題，還考慮到了要避免探針出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體的情況，本發(fā)明中的探針混合物能夠分別全面覆蓋腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，特異性良好并且覆蓋度高。

在RPA擴增體系中，本發(fā)明提供的上述探針混合物與引物組配合使用可以實現(xiàn)模板擴增的實時監(jiān)控，所述探針其中兩個堿基上各標記一個熒光基團(ROX、FAM、VIC、CY5)和淬滅基團(BHQ1、BHQ2、BHQ3)，在兩個基團之間有雙脫氧間臂(dSpacer)位點，該位點可被來自大腸桿菌的3’-5’核酸外切酶識別，可以使兩個基團分離，從而使熒光信號與擴增產(chǎn)物的累積相同步，這樣結(jié)合熒光擴增檢測儀便可在10-20分鐘內(nèi)檢測到熒光曲線。

本發(fā)明還提供一種用于檢測腸道病毒的試劑盒，其中，所述試劑盒含有SEQ ID NO.1-14所示的引物組和SEQ ID NO.17-23所示的探針混合物。

本發(fā)明提供的試劑盒，通過以上所述的引物組、探針混合物可以建立了7種易致病的腸道病毒RPA檢測的引物組、探針、試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、全面、敏感、特異、自動的檢測結(jié)果判定，顯著提高了對7種腸道病毒同時進行檢測的敏感性、特異性和簡便性。

進一步地，所述試劑盒還包括陽性內(nèi)質(zhì)控、逆轉(zhuǎn)錄酶、反應體系緩沖液、DNA重組酶、DNA聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、3’-5’核酸外切酶、dNTP和水。

通過以上方案，逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RT-RPA)只需將RPA體系與逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA混合，構(gòu)建RT-RPA反應體系，就可直接以RNA為模板，20min內(nèi)實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄與檢測過程的一體化。因此，RPA技術(shù)比其他等溫擴增或PCR技術(shù)更適用于腸道病毒的現(xiàn)場診斷。RT-RPA技術(shù)極大地縮短了檢測時間，簡化了反應程序，與核酸快速提取技術(shù)相結(jié)合使野外和現(xiàn)場檢測成為可能。

進一步地，所述的陽性內(nèi)質(zhì)控含有SEQ ID NO.15-16所示的引物序列、SEQ ID NO.24所示的探針和模板pET28a質(zhì)粒；所述陽性內(nèi)質(zhì)控(Internal Amplification Control，IAC)，可以有效提示因為操作失誤、PCR抑制物等原因造成的假陰性檢測結(jié)果。

進一步地，為了增強檢測結(jié)果的準確性，所述的試劑盒檢測項目分為兩管；A管含有SEQ ID NO.1-8所示的引物序列和SEQ ID NO.17-20所示的探針序列；B管含有SEQ ID NO.9-16所示的引物序列和SEQ ID NO.21-24所示的探針序列。

進一步地，為了增加檢測結(jié)果的準確性，所述試劑盒的優(yōu)選工作程序為：每個循環(huán)為3個39℃10s，在每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光，共有40個循環(huán)。

進一步地，所述試劑盒用于檢測污水、廢物或土壤中腸道病毒或者來源于人體樣本如水皰液、唾液或糞便中的腸道病毒。其中，所述腸道病毒包括腸道病毒EV71、腸道病毒CA16、腸道病毒CA10、腸道病毒CA6、腸道病毒CB3、腸道病毒CB5和腸道病毒Echo30。

特別地，本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠?qū)崿F(xiàn)形態(tài)學、免疫學、LAMP以及單重實時熒光檢測所無法完成的快速、全面、敏感、特異、自動的結(jié)果判定，達到如下的檢測效果：

(一)多重檢測覆蓋面廣

目前，腸道病毒檢測僅限于CA16、EV71等最常見的血清型，對于其它腸道病毒多采取通用方案的檢測，缺乏特異性。本發(fā)明所建立的檢測方法可以一次性的檢測7種血清型的腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30，檢測流程簡單，結(jié)果簡易且可靠，節(jié)省了時間、人力和物力成本。

(二)耗時短

逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RT-RPA)只需要將RPA體系與逆轉(zhuǎn)錄酶混合，構(gòu)建RT-RPA反應體系，就可以RNA為模板實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄與檢測過程的一體化。整個反應20min即可完成，而RT-PCR、Real-time PCR、LAMP等技術(shù)需要60-90min才可完成。

(三)對儀器平臺要求低

RT-RPA反應可在常溫下進行，不需要配備專門的熱循環(huán)擴增儀，更好的實現(xiàn)了腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的現(xiàn)場應急檢測。

(四)特異性好

RPA可識別引物結(jié)合區(qū)的SNP，使得其對非檢測目標有極強的辨識能力，而LAMP和普通Real-time PCR則無法識別SNP，這使得RPA檢測的特異性明顯優(yōu)于LAMP和Real-time PCR。本發(fā)明所建立的檢測方法特異性還體現(xiàn)在一整套引物探針的特異性：所有引物探針都經(jīng)過blast比對分析，具有高度的保守性和特異性；特異性實驗證實本發(fā)明能夠很好的區(qū)分包括輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腺病毒、鼻病毒、EV72、CB1、CB2、Echo9腸道病毒等其他病毒，證明檢測方法具有高度的特異性，能夠?qū)⒎菣z測目標準確區(qū)分開來。

(五)靈敏度高

本發(fā)明所建立的檢測方法的最低檢出限可達到5拷貝/反應。

(六)成本較低

本發(fā)明所建立的通過重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)檢測腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的方法在操作性上降低了人力成本和時間成本。該方法無需復雜高端儀器，降低了儀器成本。

(七)預防假陰性結(jié)果

本發(fā)明反應體系中添加的陽性內(nèi)質(zhì)控(IAC)，可以有效的提示因為操作失誤、PCR抑制物等原因造成的假陰性檢測結(jié)果。

本發(fā)明建立了7種易致病的腸道病毒RPA檢測的引物組、探針、試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、全面、敏感、特異、自動的檢測結(jié)果判定，顯著提高了對7種腸道病毒同時進行檢測的敏感性、特異性和簡便性。

以下通過實施例進行進一步詳細說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不因此受到任何限制。

以下實施例中試劑均為商購產(chǎn)品，引物、探針均在上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

實施例1

1.引物、探針合成：

按照表1和表2所示的引物、探針序列，進行序列合成。序列中Y代表簡并堿基T/C；R代表簡并堿基A/G；探針中ROX、FAM、VIC、CY5為熒光基團，BHQ1、BHQ2、BHQ3為淬滅基團，均用于修飾T堿基；在探針的3’末端還連接有磷酸基團(phosphate)。

表1

表2

2.特異性驗證：

選擇以下9個樣本作為模擬干擾樣本：輪狀病毒(來自山東CDC，3001)、諾如病毒(來自山東CDC，3002)、札如病毒(來自山東CDC，3003)、腺病毒(來自山東CDC，3004)、鼻病毒(來自山東CDC，3005)、腸道病毒EV72(來自山東CDC，3008)、CB1(來自山東CDC，3010)、CB2(來自山東CDC，3011)、Echo9(來自山東CDC，3014)的核酸，用于特異性評估，將上述每個樣本混合作為特異性檢測模板，進行RT-RPA擴增。

RT-RPA反應體系配制：本試劑盒包括陽性內(nèi)質(zhì)控在內(nèi)共有八個檢測目標，分為兩管進行檢測：A管檢測目標為EV71、CA16、CA10和CA6；B管檢測目標為CB3、CB5、Echo30以及IAC。每管總體系50μl，向含有RPA凍干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反應管中加入再水化緩沖液29.5μl，醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/L)；按照表3所示分別配制A、B組引物混合物和探針混合物；0.00003ng/ul pET28a 1μl；逆轉(zhuǎn)錄酶1μl(200U/μl)，模板5μl，剩余用水補足。

表3

RT-RPA反應程序如下：選擇FAM、VIC、CY5、ROX作為報告基團，每個循環(huán)為3個39℃、10s，再循環(huán)結(jié)束時收集熒光，共有40個循環(huán)。

RT-RPA反應結(jié)果判斷：空白對照、IAC成立，否則視實驗結(jié)果無效；若A管中FAM通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.1-2的引物對和SEQ ID NO.17的探針有非特異性擴增；若A管中ROX通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.3-4的引物對和SEQ ID NO.18的探針有非特異性擴增；若A管中VIC通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.5-6引物對和SEQ ID NO.19的探針有非特異性擴增；若A管中CY5通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.7-8和SEQ ID NO.20的探針引物對有非特異性擴增；若B管中FAM通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.9-10的引物對和SEQ ID NO.21的探針有非特異性擴增；若B管中VIC通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.11-12和SEQ ID NO.22的探針的引物對有非特異性擴增；若B管中CY5通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.13-14的引物對和SEQ ID NO.23的探針有非特異性擴增。

結(jié)果顯示A管、B管中均未出現(xiàn)非特異性擴增。

3.最低檢出限驗證：

使用濃度均為10⁴拷貝/μl的腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的核酸等比例混合作為模板I、同樣方法配制濃度均為10³拷貝/μl、10²拷貝/μl、10¹拷貝/μl、2拷貝/μl、10⁰拷貝/μl的7種腸道病毒等比例混合核酸作為模板II、III、IV、V、VI。按照以上所述反應體系分別加入模板I-VI，并按照以上所述的反應程序進行試驗。

RT-RPA反應結(jié)果判斷：空白對照、IAC成立，否則視實驗結(jié)果無效；若A管中FAM通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.1-2的引物對和SEQ ID NO.17的探針可檢測出該濃度的模板；若A管中ROX通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.3-4的引物對和SEQ ID NO.18的探針可檢測出該濃度的模板；若A管中VIC通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.5-6的引物對和SEQ ID NO.19的探針可檢測出該濃度的模板；若A管中CY5通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.7-8的引物對和SEQ ID NO.20的探針可檢測出該濃度的模板；若B管中FAM通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.9-10的引物對和SEQ ID NO.21的探針可檢測出該濃度的模板；若B管中VIC通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.11-12的引物對和SEQ ID NO.22的探針可檢測出該濃度的模板；若B管中CY5通道有擴增曲線，則SEQ ID NO.13-14的引物對和SEQ ID NO.23的探針可檢測出該濃度的模板。

結(jié)果顯示本試劑盒對于目標腸道病毒的最低檢出限度均達到了5拷貝/體系(即為1拷貝/μl)。

4.樣本耐受性檢測

以乙醇沉淀法提取腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30各10株的，提取的RNA作為模板，根據(jù)以上所述的反應體系與反應程序進行擴增。

RT-RPA反應結(jié)果判斷與最低檢出限反應判斷方法相同。

結(jié)果顯示本發(fā)明試劑盒對如上所述的以乙醇簡單提取的RNA為模板擴增均獲得陽性結(jié)果，本發(fā)明試劑盒對樣本的耐受性極好。

5.覆蓋度檢測

以腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30RNA核酸各5株分別作為模板進行覆蓋度檢測，根據(jù)如上所述反應體系和反應程序進行擴增。

RT-RPA反應結(jié)果判斷與最低檢出限反應判斷方法相同。

結(jié)果顯示本發(fā)明試劑盒對所有35株腸道病毒均可覆蓋檢測出。

對比例1

1.引物、探針合成

根據(jù)表4所示的序列合成引物、探針序列，序列中Y代表簡并堿基T/C；R代表簡并堿基A/G。所述引物、探針用于RT-RPA檢測腸道病毒；探針中ROX、FAM、VIC、CY5為熒光基團，BHQ1、BHQ2、BHQ3為淬滅基團，均用于修飾T堿基；在探針的3’末端還連接有磷酸基團(phosphate)

表4

2.特異性驗證

選擇以下9個樣本作為模擬干擾樣本：輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腺病毒、鼻病毒、腸道病毒EV72、CB1、CB2、Echo9的核酸，用于特異性評估，將上述樣本的核酸混合物作為特異性檢測模板，進行擴增。

RT-RPA反應體系配制、RT-RPA的反應程序、反應結(jié)果判斷均與實施例1中的特異性驗證相同。

結(jié)果顯示，以上反應結(jié)果均為陰性，對比例的引物、探針特異性高。

3.最低檢出限驗證

使用濃度均為10⁴拷貝/μl的腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的核酸等比例混合作為模板I、同樣方法配制濃度均為10³拷貝/μl、10²拷貝/μl、10¹拷貝/μl、2拷貝/μl、10⁰拷貝/μl的7種腸道病毒等比例混合核酸作為模板II、III、IV、V、VI。按照以上所述反應體系分別加入模板I-VI，并按照以上所述的反應程序進行試驗。

反應結(jié)果判斷與實施例1中的最低檢出限驗證相同。

結(jié)果顯示對比例對7種腸道病毒的最低檢出限為100拷貝/體系。

4.樣本耐受性驗證

以乙醇沉淀法提取腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30的RNA各5株，作為模板，根據(jù)以上所述的RT-PRA反應體系與反應程序進行擴增。

反應結(jié)果判斷與實施例1中的樣本耐受性驗證相同。

結(jié)果顯示對比例有2株EV71、2株CA16、2株CA10、1株CB3的漏檢。

5.覆蓋度檢測

以腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30各10株分別作為模板進行覆蓋度檢測，根據(jù)如上所述RT-PCR反應體系和反應程序進行擴增。

反應結(jié)果判斷與實施例1中的覆蓋度檢測相同。

結(jié)果顯示對比例漏檢1株腸道病毒EV71、1株腸道病毒CA16、2株腸道病毒CB3。

經(jīng)過實施例1與對比例1可以看出，本發(fā)明所建立的檢測方法可以一次性的檢測7種血清型的腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30。本發(fā)明試劑盒可識別引物結(jié)合區(qū)的單個核苷酸突變位點(SNP)，對非檢測目標有極強的辨識能力。并且本試劑盒對于樣本中痕量的腸道病毒EV71、CA16、CA10、CA6、CB3、CB5以及Echo30病毒檢測能力更強，本發(fā)明試劑盒的最低檢出限以及覆蓋度顯著低于對比例。

以上詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內(nèi)容。