技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化法。

背景技術(shù)：

羥脯氨酸（hydroxyproline），亞氨基酸之一，通常在第四位上帶有羥基，但有時(shí)也在第3位上。由于有兩個(gè)不對(duì)稱的碳原子，所以有4種立體異構(gòu)體。在動(dòng)物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸。自然界中不存在D-羥脯酸。是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，可以通過脯氨酸羥化酶生成。在食品、醫(yī)學(xué)和工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用。在化妝品上, 羥脯氨酸可消除氧化劑和調(diào)整細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)的效果，化妝品中添加可保養(yǎng)皮膚和延緩衰老；以之為底物縮合反應(yīng)生成二棕櫚酰羥脯氨酸，可刺激膠原纖維收縮作用，高效清除皮膚氧自由基；N-乙酰羥脯氨酸具有保濕作用，化妝品中添加可有效維持表皮細(xì)胞的水分，使皮膚保持彈性；醫(yī)學(xué)上，在食品和飲料中添加可防止過敏性炎癥，衍生物 N-乙酰羥脯氨酸可用于治療結(jié)蹄組織疾病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；順式-4-羥脯氨酸作為抗癌藥物治療各種癌癥，包括肝，膀胱，前列腺，腎盂等。防止骨膠原折疊成一個(gè)穩(wěn)定的三螺旋構(gòu)象,從而減少瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和纖維化過程中膠原過度沉積；抗肝纖維化、抗高血壓。

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，大氣污染和全球變暖的趨勢(shì)日益惡化。國(guó)內(nèi)多采用生物提取法由明膠、骨膠、干酪素、大豆表皮等蛋白質(zhì)，用鹽酸水解，用亞硝化法提取亞氨酸后經(jīng)樹脂層析后精制、結(jié)晶而成，并且順式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)還需要通過手性異構(gòu)合成，生物法合成順式-4-羥脯氨酸具有經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)雙重意義，生物法合成順式-4-羥脯氨酸的基因工程菌主要有大腸桿菌和酵母。

目前生物法合成順式-4-羥脯氨酸主要有兩種方式：發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。發(fā)酵法原料來源廣泛且可再生，成本低，產(chǎn)量較高，污染也較小，但其調(diào)控過程比較復(fù)雜；生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)量高，成本低，過程簡(jiǎn)單，有利于下游提取操作。大腸桿菌生長(zhǎng)速率快，生產(chǎn)周期短，而大腸桿菌中底物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞膜需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，目前大腸桿菌中有脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PutP，通過過表達(dá)putp基因提高生產(chǎn)菌株的脯氨酸在胞內(nèi)的底物濃度，來提高順式-4-羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化效率，而加入底物α-酮戊二酸在初始反應(yīng)液中導(dǎo)致反應(yīng)液中酸度嚴(yán)重影響反應(yīng)進(jìn)行，需要調(diào)節(jié)pH至中性，然而使用α酮戊二酸鈉代替α酮戊二酸,通過α-酮戊二酸鈉和α-酮戊二酸以一定的配比作為緩沖加入反應(yīng)解決了pH的問題。該方法能提高脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞速率即解決了生產(chǎn)過程中的脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞速率慢的問題，又解決了反應(yīng)中高濃度的α-酮戊二酸會(huì)影響反應(yīng)pH值問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化法，該方法通過改變脯氨酸進(jìn)入細(xì)胞的速度，提高了順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量，節(jié)省了調(diào)節(jié)pH步驟，簡(jiǎn)化了方法。

一種生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化法，通過加快底物脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)速率來提高順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)率。

上述一種生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化法中，所述加快底物脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，包括以下步驟：先構(gòu)建過表達(dá)脯氨酸羥化酶基因ecp4h和脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因putp的基因工程菌；再誘導(dǎo)培養(yǎng)基因工程菌獲得全細(xì)胞，最后用全細(xì)胞催化反應(yīng)生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸。

作為上述方法優(yōu)選的是，所述脯氨酸羥化酶基因ecp4h，GenBank: FU758039.1 ；脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因putp Gene bankYP_003053684.1。

上述方法包括以下步驟：

步驟1，配種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、反應(yīng)液、soc培養(yǎng)基、菌體洗液，并與培養(yǎng)皿、錐形瓶、離心管滅菌備用；

步驟2，構(gòu)建得重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入宿主菌體內(nèi)，然后在37℃下培養(yǎng)12-14h得菌種；

步驟3，向離心管中依次接入種子培養(yǎng)基、抗生素和菌種，培養(yǎng)9-10h得發(fā)酵菌種；

步驟4，向錐形瓶中接入發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵菌種，搖床培養(yǎng)至OD至少為0.6時(shí)，加入至終濃度為0.8-1.2mmol的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心8-10min后倒掉上清，用菌體洗液洗滌濾渣2-4遍后得全細(xì)胞備用；

步驟5，向滅菌后錐形瓶中加入全細(xì)胞，保證加入的全細(xì)胞干重為0.41g/L，再加入緩沖溶液和反應(yīng)液進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)；

步驟6，每隔5-8h取樣一次，并通過液相檢測(cè)產(chǎn)物，待全細(xì)胞催化55-65h時(shí)結(jié)束得產(chǎn)物順式-4-羥脯氨酸。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟2中所述重組質(zhì)粒為pET28a-EP4H和pACYC-PutP、pET28a-EP4H和pCDF-PutP或pET28a-EP4H-PutP。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟3中培養(yǎng)條件為溫度37℃、轉(zhuǎn)速250rpm。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟4中發(fā)酵菌種接入的量為1-2%；搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200rpm；誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為200rpm；離心10min，離心力為4000g/min。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟5中全細(xì)胞反應(yīng)時(shí)間為60h。

作為上述方法優(yōu)選的是，步驟5中反應(yīng)液由9-11g/L脯氨酸、9-11g/L酮戊二酸、9-11g/L α-酮戊二酸鈉、硫酸亞鐵和維生素C混合而成，其中硫酸亞鐵和維生素C的摩爾濃度比為3：4mmol/L。

有益效果

本發(fā)明方法提供了一種生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化法。本發(fā)明方法通過在大腸桿菌BL21(DE3)胞內(nèi)共表達(dá)了脯氨酸羥化酶和脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸在重組菌中的高效合成。與現(xiàn)有的順式-4-羥脯氨酸發(fā)酵法相比，該方法操作簡(jiǎn)便、可持續(xù)、性價(jià)比高，具有良好的工業(yè)化前景。。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒pET28a-EP4H；

圖2為重組質(zhì)粒pACYC-PutP；

圖3為重組質(zhì)粒pCDF-PutP；

圖4為重組質(zhì)粒pET28a-EP4H-PutP。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的色譜圖，其中峰1為順式-4-羥脯氨酸。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的色譜圖，其中峰1為脯氨酸。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以大腸桿菌基因組為模板，以putp基因兩端的引物PCR擴(kuò)增，得到的putp片段克隆至載體pACYCDuet-1的NdeI和XhoI位點(diǎn)。得到重組質(zhì)粒pACYC-PutP。

實(shí)施例2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以大腸桿菌基因組為模板，以putp基因兩端的引物PCR擴(kuò)增，得到的putp片段克隆至載體pCDFDuet-1的NdeI和XhoI位點(diǎn)。得到重組質(zhì)粒pCDF-PutP。

實(shí)施例3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以大腸桿菌基因組為模板，以putp基因兩端的引物PCR擴(kuò)增，后擴(kuò)增出的基因片段兩端分別加入NdeI/XhoI酶切位點(diǎn)后酶切連接構(gòu)建于在體pACYC-duet。載體上酶切位點(diǎn)為NdeI/XhoI。構(gòu)建得重組質(zhì)粒pACYC-PutP。PCR擴(kuò)增使得基因PutP兩端酶切位點(diǎn)都為XhoI，后通過酶切連接后構(gòu)建出pET28a-EP4H-PutP。

實(shí)施例4

一種生產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化法，包括以下步驟：

步驟1，配硫酸亞鐵溶液、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、反應(yīng)液、soc培養(yǎng)基、菌體洗液、然后與培養(yǎng)基、錐形瓶、離心管滅菌備用，其中：

發(fā)酵培養(yǎng)基LB：蛋白胨10g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，氨芐青霉素0.02%，氯霉素0.01%，鏈霉素0.01% pH7.0。

反應(yīng)液：10 g /L 脯氨酸， 10 g/Lα-酮戊二酸, 0.2mol/L磷酸二氫鉀, 0.2mol/L磷酸氫二鉀,0.8mmol /L維生素C, 0.4 mmol /L 硫酸亞鐵。

菌體洗液:PBS 7.0溶液，11.09g/LNaH₂PO_{4 ,}2.96g/LNa₂HPO₄。

soc培養(yǎng)基:蛋白胨4g/L，酵母粉1g/L，NaCl 10mm/L，KCl 2.5mm/L，MgSO₄ 10mm/L，MgCl₂ 20mm/L，葡萄糖20 g/L。

種子培養(yǎng)基的配方同發(fā)酵培養(yǎng)基LB。

步驟2，將實(shí)施例1中構(gòu)建得重組質(zhì)粒pET-28a-Ecp4H；pACYC- putP及菌株pET-28a-Ecp4H轉(zhuǎn)入大腸桿菌B21（DE3）后在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h得菌種；

步驟3，取50ml離心管接入10ml的種子培養(yǎng)基和0.2um的抗生素，在平板上挑點(diǎn)接入搖管中，搖床37℃轉(zhuǎn)速為250rpm下培養(yǎng)得發(fā)酵菌種；

步驟4，向錐形瓶中接入發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵菌種，搖床培養(yǎng)至OD長(zhǎng)至0.6時(shí)，加入至終濃度為1mmol的IPTG，20℃，200rpm誘導(dǎo)12h后，在離心力為4000g的情況下離心10 分鐘，倒掉上清，收集菌體后用菌體洗液2遍后備用；

步驟5，向滅菌后錐形瓶中加入步驟4的菌體，保證加入后的菌體的干重為0.41g/L，再加入緩沖溶液和反應(yīng)液進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)，步驟5中反應(yīng)液由9g/L脯氨酸、9g/L酮戊二酸、9g/Lα酮戊二酸鈉、硫酸亞鐵和維生素C混合而成，其中硫酸亞鐵和維生素C的摩爾濃度比為3：4mmol/L；

步驟6，每隔6h取一次樣檢測(cè)，并通過液相檢測(cè)產(chǎn)物，等到55h-65h停止催化反應(yīng)，取最終產(chǎn)物。

順式-4-羥脯氨酸含量，HPLC-ELSD分析。

HPLC-ELSD分析使用蒸發(fā)光檢測(cè)器，色譜柱為Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC條件為：流動(dòng)相A：1升純水中含有7毫升三氟乙酸0.653毫升七氟丁酸，流動(dòng)相B：100% 乙腈，條件如下：100% A；流速：1.0 ml/min；柱溫：28.5±1°C；進(jìn)樣量：10 μl。ELSD檢測(cè)條件：霧化溫度為115°C，氣流速為3.2L/min。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC-ELSD分析（如圖3所示），出峰時(shí)間為4.1分鐘與標(biāo)品出峰時(shí)間一致。

實(shí)施例5

除步驟2中所用重組質(zhì)粒為pET-28a-Ecp4H和pCDF-PutP外，其它部分同實(shí)施例4。

實(shí)施例6

除步驟2中所用重組質(zhì)粒為pET-28a-Ecp4H-PutP，其它部分同實(shí)施例4。

實(shí)施例7

除步驟5中反應(yīng)液中α酮戊二酸和α酮戊二酸鈉鹽的體積比為1:5，其他的同時(shí)實(shí)施例6。

對(duì)比例

以上述產(chǎn)脯氨酸羥化酶菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且調(diào)節(jié)底物α-酮戊二酸和α-酮戊二酸鈉進(jìn)行配比，其他反應(yīng)條件同實(shí)施例1，轉(zhuǎn)化結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中順式-4-羥脯氨酸最高濃度達(dá)到2.3g/L。

本發(fā)明方法產(chǎn)順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量記錄于下表中。

從上述實(shí)施例的結(jié)果中可以看出，本發(fā)明制備方法通過改變細(xì)胞對(duì)于脯氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，提高了順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量，其中以重組質(zhì)粒pET-28a-Ecp4H-PutP構(gòu)建的基因工程菌效果更加，另外，α酮戊二酸和α酮戊二酸鈉鹽的體積比為1：5時(shí)，順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量也得到了很大的改善，因此，本發(fā)明方法在簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程的同時(shí)，提高了順式-4-羥脯氨酸的產(chǎn)量，具有良好的市場(chǎng)前景。