本發(fā)明屬于白果產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取白果生物活性多肽的方法。
背景技術(shù)：
生物活性多肽是最近研究發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能或生命有機(jī)體的代謝活動(dòng)具有優(yōu)化功能的短肽類化合分子。與完整長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)相比，生物活性多肽優(yōu)異的理化性能，如良好的溶解性、親水性、低粘度、低發(fā)泡性等，均使得活性多肽的生物利用率更高，甚至比氨基酸更容易吸收，具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的功效，其具有一些原蛋白質(zhì)或其組份氨基酸所不具備的生物活性。生物活性肽的生物學(xué)功能包括免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抑菌、抗癌、抗氧化、改善元素吸收、調(diào)節(jié)食品風(fēng)味、口味和硬度等，因此，生物活性多肽被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和化妝品中。
生物活性多肽的分類可按原料來源和保健功能來劃分。按照原料來劃分的有：乳肽、大豆肽、玉米肽、魚貝類蛋白、膠原蛋白多肽等；按照功能來分有免疫活性肽、神經(jīng)活性肽、降血壓肽和抗菌多肽等。這些多肽已作為保健食品和藥物實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，并取得巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是我國(guó)對(duì)活性肽的研究起步較晚，產(chǎn)品種類少，市場(chǎng)開發(fā)不足。近些年來隨著人們保健美容意識(shí)及消費(fèi)能力的提高，具有良好生物活性的多肽類產(chǎn)品已經(jīng)走入平常百姓生活中，具有非常廣泛的市場(chǎng)和應(yīng)用前景。此外，我國(guó)生物物種豐富，蛋白質(zhì)資源充足，利用生物技術(shù)開發(fā)多肽活性物質(zhì)是提升經(jīng)濟(jì)作物的重要途徑。
白果仁中的最大成份為淀粉，其次為蛋白質(zhì)、脂肪及多糖，還含有維生素C、核黃素、胡蘿卜素、銀杏酸、白果酚、多種有益人體健康的微量元素以及五碳多糖，因此具有良好的醫(yī)用效果和食療作用。隨著蛋白多肽生理功能和消費(fèi)市場(chǎng)的擴(kuò)大，進(jìn)行白果生物活性多肽的制備是提高白果仁消費(fèi)面及經(jīng)濟(jì)利益的重要途徑之一。
傳統(tǒng)的生物多肽的制備可以由化學(xué)法完成，即利用酸或堿進(jìn)行蛋白質(zhì)的消化處理，該方法速度快，成本低，但是會(huì)對(duì)多肽造成一定的損傷，多肽結(jié)構(gòu)的控制不太容易，不僅破壞多肽的生理活性，產(chǎn)生毒副產(chǎn)品，而且會(huì)產(chǎn)生酸堿等化學(xué)污染。因此，有必要開發(fā)一種可以有效提取白果生物活性多肽的方法，應(yīng)用于功能性食品或藥品的研究與開發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種提取白果生物活性多肽的方法，解決了化學(xué)提取法對(duì)多肽造成的損傷，導(dǎo)致的多肽結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，破壞多肽生理活性，產(chǎn)生毒副產(chǎn)品，產(chǎn)生酸堿等化學(xué)污染的問題。
本發(fā)明提供的一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下步驟：
步驟1，粉碎：將白果仁于沸水中煮沸3-5min，干燥后進(jìn)行粉碎過篩，獲得白果粉；
步驟2，酶解：將步驟1中的白果粉用水溶解，其中白果粉與水的固液比為1g:10-30mL，攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH至5.5-7.0，在攪拌的同時(shí)加入破壁酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，在55-60℃下酶解1-4h，得到酶解液，然后將酶解液經(jīng)高溫滅酶，得到滅酶溶液；
其中，破壁酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1-1.0％，果膠酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1-1.0％，纖維素酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1-1.0％，蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.5-3.0％；
所述破壁酶由蝸牛酶、溶菌酶按7:1的質(zhì)量比例混合而成；所述蛋白酶為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或多種；
步驟3，兩步提取：將滅酶溶液的溫度調(diào)整至3-5℃，保持1-3h，經(jīng)抽濾分離或離心分離，獲得第一次水解液和第一次殘?jiān)?；將第一次水解液升溫?5-60℃，保持1-2h，然后經(jīng)離心分離，收集第一次上清液；
再將得到的第一次殘?jiān)苡?.1-0.3mol/L的NaCl溶液或者0.01-0.1mol/L的NaH2PO4溶液中，于60-80℃保持1-2h，然后再進(jìn)行抽濾分離或離心分離，收集第二次上清液，其中第一次殘?jiān)cNaCl溶液或者NaH2PO4溶液的固液比為1g:10-25mL；
步驟4，濃縮：合并第一次上清液和第二次上清液，濃縮去除部分水分，獲得濃縮液；
步驟5，干燥：將步驟4中所得濃縮液進(jìn)行干燥，得到白果生物活性多肽。
優(yōu)選的，步驟1中，過篩的目數(shù)為100-2000目。
優(yōu)選的，步驟2中，白果粉與水的固液比為1g:30mL。
優(yōu)選的，步驟2，高溫滅酶的方法為：將酶解液于95-100℃保溫5-7min。
優(yōu)選的，步驟3中，抽濾分離時(shí)添加助濾劑硅藻土。
優(yōu)選的，步驟4中，濃縮時(shí)，采用真空濃縮或者旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。
優(yōu)選的，步驟5中，干燥時(shí)采用真空干燥，且真空干燥的溫度為50℃。
本發(fā)明提取白果生物活性多肽的方法，通過多種酶制劑對(duì)生物樣品進(jìn)行處理，可以在溫和條件下將蛋白質(zhì)從植物組織中進(jìn)行分離，由于提取過程中并沒有添加化學(xué)試劑，不僅保證了蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)不被破壞，還可以有效提高蛋白的提取率，經(jīng)酶解后獲得的小分子活性多肽分子量多在1000Da(道爾頓)以下，且分布均勻，更有利于人體吸收?？捎糜谛迯?fù)肌膚、增加皮膚營(yíng)養(yǎng)，使用于食療時(shí)可以對(duì)病人迅速增加蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。
與傳統(tǒng)的兩步提取法相比，生物活性多肽產(chǎn)量高，小分子肽活性組份的比例大，無污染排放。例如同樣使用1000目的白果粉原材料，酶法提取白果多肽的得率為55％以上；1000Da左右的小肽活性組份的比例在80％以上，而傳統(tǒng)方法得到的活性小肽組份的比例不超過60％。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
此外，本發(fā)明及下列實(shí)施例中采用的各種酶均為市售。
優(yōu)選的，本發(fā)明一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下實(shí)施例。
實(shí)施例1
一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下步驟：
步驟1，粉碎：將白果仁于沸水中煮沸5min，干燥后粉碎時(shí)采用中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過200目篩，獲得200目的白果粉；
步驟2，酶解：將步驟1中的白果粉用水溶解，其中白果粉與水的固液比為1g:20mL，攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH至5.5，在攪拌的同時(shí)加入破壁酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，在55℃下酶解4h，得到酶解液，然后將酶解液經(jīng)高溫滅酶，得到滅酶溶液；
其中，高溫滅酶的方法為：將酶解液于100℃保溫5min；
其中，所述破壁酶由蝸牛酶、溶菌酶按7:1的質(zhì)量比例混合而成；所述蛋白酶由酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、風(fēng)味蛋白酶組成；
其中，破壁酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.4％，果膠酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.2％，纖維素酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.2％，酸性蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.5％，中性蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.2％，木瓜蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.5％，胰酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.3％，風(fēng)味蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％；
步驟3，兩步提取：將滅酶溶液的溫度調(diào)整至4℃，保持1h，經(jīng)3500r/min離心10min，獲得第一次水解液和第一次殘?jiān)粚⒌谝淮嗡庖荷郎刂?0℃，保持1h，然后經(jīng)12000r/min離心10min，收集第一次上清液；
再將得到的第一次殘?jiān)苡?.1mol/L的NaCl溶液中，于80℃保持2h，然后再以12000r/min離心15min，收集第二次上清液，其中第一次殘?jiān)cNaCl溶液的固液比為1g:25mL；
步驟4，濃縮：合并第一次上清液和第二次上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮至原體積的1/10，獲得濃縮液；
步驟5，干燥：將步驟4中所得濃縮液進(jìn)行50℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
經(jīng)分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽總量的85％左右，生物活性多肽的總提取率大約為60.02％。
實(shí)施例2
一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下步驟：
步驟1，粉碎：將白果仁于沸水中煮沸4min，干燥后粉碎時(shí)采用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過500目篩，獲得500目的白果粉；
步驟2，酶解：將步驟1中的白果粉用水溶解，其中白果粉與水的固液比為1g:25mL，攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH至6，在攪拌的同時(shí)加入破壁酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，在55℃下酶解3h，得到酶解液，然后將酶解液經(jīng)高溫滅酶，得到滅酶溶液；
其中，高溫滅酶的方法為：將酶解液于95℃保溫5min；
其中，所述破壁酶由蝸牛酶、溶菌酶按7:1的質(zhì)量比例混合而成；所述蛋白酶由酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶組成；
其中，破壁酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.5％，果膠酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.5％，纖維素酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.2％，酸性蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.2％，堿性蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，木瓜蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.5％，胰酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，風(fēng)味蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1％，菠蘿蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1％；
步驟3，兩步提?。簩缑溉芤旱臏囟日{(diào)整至3℃，保持3h，經(jīng)抽濾分離，獲得第一次水解液和第一次殘?jiān)粚⒌谝淮嗡庖荷郎刂?0℃，保持1h，然后經(jīng)12000r/min離心10min，收集第一次上清液；
再將得到的第一次殘?jiān)苡?.3mol/L的NaCl溶液中，于70℃保持1h，然后再經(jīng)抽濾分離，收集第二次上清液，其中第一次殘?jiān)cNaCl溶液的固液比為1g:15mL；
步驟4，濃縮：合并第一次上清液和第二次上清液，將上清液真空濃縮至原體積的1/10，獲得濃縮液；
步驟5，干燥：將步驟4中所得濃縮液進(jìn)行50℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
經(jīng)分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽總量的82％左右，生物活性多肽的總提取率大約為54.47％。
實(shí)施例3
一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下步驟：
步驟1，粉碎：將白果仁于沸水中煮沸3min，干燥后粉碎時(shí)采用中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過1000目篩，獲得1000目的白果粉；
步驟2，酶解：將步驟1中的白果粉用水溶解，其中白果粉與水的固液比為1g:30mL，攪拌混勻調(diào)節(jié)pH值至7.0，在攪拌的同時(shí)加入破壁酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，在58℃下酶解1h，得到酶解液，然后將酶解液經(jīng)高溫滅酶，得到滅酶溶液；
其中，高溫滅酶的方法為：將酶解液于100℃保溫7min；
其中，所述破壁酶由蝸牛酶、溶菌酶按7:1的質(zhì)量比例混合而成；所述蛋白酶由木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶組成；
其中，破壁酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1％，果膠酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，纖維素酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.8％，木瓜蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，風(fēng)味蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，菠蘿蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％；
步驟3，兩步提?。簩缑溉芤旱臏囟日{(diào)整至5℃，保持3h，經(jīng)抽濾分離，并且抽濾時(shí)添加助濾劑硅藻土，獲得第一次水解液和第一次殘?jiān)?；將第一次水解液升溫?5℃，保持1.5h，然后經(jīng)12000r/min離心10min，收集第一次上清液；
再將得到的第一次殘?jiān)苡?.01mol/L的NaH2PO4溶液中，于70℃保持1.5h，然后再以12000r/min離心15min，收集第二次上清液，其中第一次殘?jiān)cNaH2PO4溶液的固液比為1g:10mL；
步驟4，濃縮：合并第一次上清液和第二次上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮至原體積的1/10，獲得濃縮液；
步驟5，干燥：將步驟4中所得濃縮液進(jìn)行50℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
經(jīng)分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽總量的80％左右，生物活性多肽的總提取率大約為56.62％。
實(shí)施例4
一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下步驟：
步驟1，粉碎：將白果仁于沸水中煮沸5min，干燥后粉碎時(shí)采用中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過500目篩，獲得500目的白果粉；
步驟2，酶解：將步驟1中的白果粉用水溶解，其中白果粉與水的固液比為1g:20mL，攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH至5.5，在攪拌的同時(shí)加入破壁酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，在55℃下酶解4h，得到酶解液，然后將酶解液經(jīng)高溫滅酶，得到滅酶溶液；
其中，高溫滅酶的方法為：將酶解液于100℃保溫5min；
其中，所述破壁酶由蝸牛酶、溶菌酶按7:1的質(zhì)量比例混合而成；所述蛋白酶由酸性蛋白酶和中性蛋白酶組成；
其中，破壁酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.3％，果膠酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.2％，纖維素酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1％，酸性蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，中性蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％；
步驟3，兩步提?。簩缑溉芤旱臏囟日{(diào)整至4℃，保持1h，經(jīng)3500r/min離心10min，獲得第一次水解液和第一次殘?jiān)?；將第一次水解液升溫?0℃，保持1h，然后經(jīng)12000r/min離心10min，收集第一次上清液；
再將得到的第一次殘?jiān)苡?.1mol/L的NaCl溶液中，于80℃保持2h，然后再以12000r/min離心15min，收集第二次上清液，其中第一次殘?jiān)cNaCl溶液的固液比為1g:25mL；
步驟4，濃縮：合并第一次上清液和第二次上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮至原體積的1/10，獲得濃縮液；
步驟5，干燥：將步驟4中所得濃縮液進(jìn)行50℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
經(jīng)分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽總量的85％左右，生物活性多肽的總提取率大約為55.13％。
實(shí)施例5
一種提取白果生物活性多肽的方法，包括以下步驟：
步驟1，粉碎：將白果仁于沸水中煮沸3min，干燥后粉碎時(shí)采用中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過1000目篩，獲得1000目的白果粉；
步驟2，酶解：將步驟1中的白果粉用水溶解，其中白果粉與水的固液比為1g:30mL，攪拌混勻調(diào)節(jié)pH值至7.0，在攪拌的同時(shí)加入破壁酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，在58℃下酶解1h，得到酶解液，然后將酶解液經(jīng)高溫滅酶，得到滅酶溶液；
其中，高溫滅酶的方法為：將酶解液于100℃保溫7min；
其中，所述破壁酶由蝸牛酶、溶菌酶按7:1的質(zhì)量比例混合而成；所述蛋白酶為木瓜蛋白酶；
其中，破壁酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.1％，果膠酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％，纖維素酶的添加量占白果粉質(zhì)量的0.8％，木瓜蛋白酶的添加量占白果粉質(zhì)量的1.0％；
步驟3，兩步提?。簩缑溉芤旱臏囟日{(diào)整至5℃，保持3h，經(jīng)抽濾分離，并且抽濾時(shí)添加助濾劑硅藻土，獲得第一次水解液和第一次殘?jiān)粚⒌谝淮嗡庖荷郎刂?5℃，保持1.5h，然后經(jīng)12000r/min離心10min，收集第一次上清液；
再將得到的第一次殘?jiān)苡?.01mol/L的NaH2PO4溶液中，于70℃保持1.5h，然后再以12000r/min離心15min，收集第二次上清液，其中第一次殘?jiān)cNaH2PO4溶液的固液比為1g:10mL；
步驟4，濃縮：合并第一次上清液和第二次上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮至原體積的1/10，獲得濃縮液；
步驟5，干燥：將步驟4中所得濃縮液進(jìn)行50℃真空干燥，得到白果生物活性多肽。
經(jīng)分析，白果生物活性多肽中，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽總量的83％左右，生物活性多肽的總提取率大約為58.32％。
傳統(tǒng)方法得到的活性小肽組份(分子量小于1000Da)的比例不超過60％，且提取有效率小于45％。而由上述實(shí)施例所得結(jié)果可知，采用本發(fā)明的方法提取白果生物活性多肽，分子量在1000Da左右的生物活性小肽占多肽總量的80％以上，有較大幅度的提高。
盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。