本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及miR399在促進(jìn)大豆氮磷吸收利用及開(kāi)花方面的應(yīng)用。更具體地，涉及大豆miR399在促進(jìn)大豆根系發(fā)育、增加氮磷含量與生物量、促進(jìn)開(kāi)花的新功能，以及利用該基因在培育氮磷協(xié)同高效植物方面以及促進(jìn)豆科作物開(kāi)花方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為20-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在植物體內(nèi)大量存在，能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)（Jones-Rhoades et al., 2006；Rogers et al., 2013）。植物中miRNA的生物合成過(guò)程較為復(fù)雜（Kai et al., 2010）。已有研究表明：在植物適應(yīng)養(yǎng)分脅迫方面，miRNA有十分重要的作用。作為植物不可缺少的礦質(zhì)養(yǎng)分，磷不僅是構(gòu)成核酸、磷脂、ATP等的結(jié)構(gòu)組分，而且參與了光合作用、呼吸作用、能量傳遞及酶活性調(diào)節(jié)等生理生化過(guò)程。磷也是維持現(xiàn)代農(nóng)業(yè)所必需的肥料主要成分之一（López-Arredondo et al., 2014）。雖然土壤中的總磷豐富，但大部分磷難以移動(dòng)而且通常容易被鈣、鐵、鋁等固定，導(dǎo)致土壤有效磷不足，而磷缺乏必然會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)（Raghothama, 1999；Wang et al., 2010）。土壤有效磷含量低，已成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一（Kochian, 2012）。因此研究如何更有效地利用磷資源，已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)和基礎(chǔ)科學(xué)研究的重要問(wèn)題。

通過(guò)多年的研究，人們已對(duì)植物低磷脅迫響應(yīng)的miRNA有較深入的認(rèn)識(shí)。MiR399是一種受低磷誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA，在植物中比較保守，其靶基因是一種編碼E2結(jié)合酶基因PHO2（Fujii et al., 2005；Aung, 2006）。低磷條件下，miR399通過(guò)負(fù)調(diào)控PHO2，解除其對(duì)下游磷響應(yīng)基因如磷轉(zhuǎn)運(yùn)子的抑制，從而促進(jìn)磷的吸收。高磷條件下，過(guò)量表達(dá)miR399的擬南芥地上部積累了大量的磷，而對(duì)根部磷積累沒(méi)有影響（Chiou et al., 2006）。與此一致的是，在擬南芥pho2突變體中也觀(guān)察到相似表型，表明miR399通過(guò)調(diào)節(jié)PHO2的表達(dá)，不僅改變根部磷的吸收，而且影響植株地上部磷的分配（Bari, 2006；Chiou et al., 2006），說(shuō)明miR399在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)磷平衡方面起重要作用。此外擬南芥嫁接實(shí)驗(yàn)還證實(shí)miR399能從地上部向根部轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響根部PHO2的有效轉(zhuǎn)錄本水平，暗示miR399從地上部到根部長(zhǎng)距離運(yùn)輸是植物適應(yīng)低磷脅迫的一個(gè)重要機(jī)制（Lin et al., 2008）。最近的研究揭示，PHO2參與泛素化磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT，它能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與PHT1相互作用，從而通過(guò)調(diào)節(jié)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膜上的量而調(diào)控植物對(duì)磷的吸收（Huang et al., 2013）。

大豆(Glycine max)是世界上重要的糧油作物，但全球大面積的酸性土壤普遍缺磷，限制了其生長(zhǎng)發(fā)育并降低產(chǎn)量（Kutama et al., 2009）。作為豆科作物，它能與根瘤菌共生形成根瘤，固定空氣中的氮?dú)?，為植物提供氮源，改善土壤質(zhì)量（Unkovich et al., 2000）。大豆生長(zhǎng)發(fā)育與固氮過(guò)程均需要大量磷營(yíng)養(yǎng)（Sa et al., 1991）。豆科作物生產(chǎn)上常存在“以磷增氮”效應(yīng)（楊俊豐，1992）。一般認(rèn)為，第一，磷能促進(jìn)植株地上部和根系的生長(zhǎng)，提供更多碳源供給根瘤生長(zhǎng)；第二，磷對(duì)根瘤的形成與固氮過(guò)程起直接作用，從而提高固氮量，改善作物氮營(yíng)養(yǎng)（Graham et al., 1979；Israel, 1993），達(dá)到氮磷協(xié)同高效。但與其他作物一樣，同樣遭受著土壤低磷脅迫，限制了大豆的生長(zhǎng)發(fā)育與共生固氮，使產(chǎn)量降低（Olivera et al., 2004；Kutama et al., 2009）。一方面可能低磷限制了作物生長(zhǎng)進(jìn)而限制了固氮作用；另一方面可能缺磷直接影響了根瘤的發(fā)育和固氮功能（Crews, 1993；Almeida et al., 2000；Chen et al., 2011）。很多研究表明，低磷脅迫下，豆科作物根瘤生物量、固氮酶活性、固氮能量均下降，導(dǎo)致作物減產(chǎn)（Israel, 1987；Ribet et al., 1995；Schulze et al., 2006）。要適應(yīng)低磷脅迫，需要通過(guò)協(xié)調(diào)磷的吸收、分配、再利用以及對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，來(lái)維持體內(nèi)磷動(dòng)態(tài)平衡（Chiou et al., 2011；Liang et al., 2014）。但遺憾的是，我們對(duì)大豆低磷響應(yīng)miRNA如何調(diào)控磷養(yǎng)分平衡尚不清楚。miR399與大豆氮磷養(yǎng)分平衡直接的關(guān)系仍不明確，miR399對(duì)豆科植物的生長(zhǎng)發(fā)育有怎么的影響都不清楚，限制了其實(shí)踐應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，明確了miR399基因，包括miR399e和miR399g，在促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆根系發(fā)育、提高了植株氮含量，最終增加轉(zhuǎn)基因植株生物量方面的作用。明確了miR399，尤其是miR399e，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆開(kāi)花的作用?；诎l(fā)掘該基因的功能，可應(yīng)用于豆科植物的氮磷協(xié)同高效育種，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高作物產(chǎn)量。

本發(fā)明的目的是提miR399在調(diào)控促進(jìn)大豆氮磷吸收利用方面的應(yīng)用。

本發(fā)明另一目的是提供miR399在促進(jìn)大豆開(kāi)花方面的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明首先進(jìn)行了miR399e和miR399g前體序列的cDNA克隆，然后分別構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)miR399e和miR399g的整株轉(zhuǎn)基因大豆株系，比較研究了在不同氮磷養(yǎng)分條件下過(guò)量表達(dá)miR399e和miR399g的轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因株系的氮磷含量及生長(zhǎng)表型。

結(jié)果顯示：

（1）在高磷高氮和低磷高氮條件下，過(guò)表達(dá)miR399e和miR399g轉(zhuǎn)基因大豆的生物量、總根長(zhǎng)和根表面積均增加。

（2）高磷高氮條件下，過(guò)表達(dá)miR399e和miR399g轉(zhuǎn)基因大豆總磷和總氮含量增加。

（3）高磷高氮和高磷低氮條件下，過(guò)表達(dá)miR399e轉(zhuǎn)基因株系在老葉中積累可溶性磷。

（4）在高磷高氮和低磷高氮條件下，過(guò)表達(dá)miR399e促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆開(kāi)花。

研究得出以下結(jié)論：

（1）miR399具有促進(jìn)豆科作物吸收和利用氮磷能力，從而在提高植株氮磷協(xié)同高效方面以及促進(jìn)豆科作物開(kāi)花方面具有很好的應(yīng)用。

（2）miR399具有增加大豆根系發(fā)育的功能，過(guò)表達(dá)miR399的轉(zhuǎn)基因大豆顯著增加了總根長(zhǎng)和跟表面積，進(jìn)而增加了根系與土壤的接觸面積，有利于根系吸收養(yǎng)分。

（3）miR399具有增加大豆氮磷含量、提高氮磷吸收利用能力從而促進(jìn)生物量的功能，與野生型大豆相比，過(guò)量表達(dá)miR399的轉(zhuǎn)基因大豆氮磷含量顯著增加，氮磷吸收利用能力提高，進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)基因大豆生物量。

（4）miR399在促進(jìn)大豆開(kāi)花方面具有很好的應(yīng)用，與野生型非轉(zhuǎn)基因大豆相比，過(guò)量表達(dá)miR399e的轉(zhuǎn)基因大豆開(kāi)花時(shí)間。

因此，以下所述應(yīng)用均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)：

miR399在促進(jìn)豆科植物吸收和/或利用氮磷能力方面的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，是指miR399在促進(jìn)豆科植物根系發(fā)育方面的應(yīng)用，或miR399在促進(jìn)豆科植物氮磷含量和/或生物量增加方面的應(yīng)用。

更進(jìn)一步地，是指miR399在促進(jìn)豆科植物總根長(zhǎng)和/或根表面積的增加方面的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述miR399是指miR399e或miR399g。

miR399在促進(jìn)豆科植物開(kāi)花方面的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述miR399是指miR399e。

miR399在促進(jìn)豆科植物老葉中可溶性磷的積累方面的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述miR399是指miR399e。

另外，優(yōu)選地，上述豆科植物是指大豆。

本發(fā)明為了探明miR399與豆科植物氮磷養(yǎng)分平衡調(diào)控以及miR399對(duì)豆科植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，通過(guò)大豆低磷響應(yīng)小分子RNA建庫(kù)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)大豆有5個(gè)miR399家族成員，均受低磷誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)以及RLMRACE實(shí)驗(yàn)證實(shí)大豆PHO2和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因GmPT5是miR399的靶基因。利用大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別過(guò)量表達(dá)該基因家族的miR399e和miR399g，研究發(fā)現(xiàn)miR399e和miR399g促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆根系發(fā)育、提高了植株氮含量，最終增加了轉(zhuǎn)基因植株的生物量。與野生型相比，過(guò)表達(dá)miR399e促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆開(kāi)花。本發(fā)明的研究成果將為包括大豆在內(nèi)的豆科作物氮磷協(xié)同高效和高產(chǎn)分子育種提供基因資源。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明公開(kāi)了miR399調(diào)控大豆氮磷養(yǎng)分平衡和開(kāi)花的功能，明確了miR399e和miR399g在豆科植物中的磷養(yǎng)分調(diào)節(jié)方面的功能及，為深入解析大豆適應(yīng)低磷脅迫和揭示豆科作物氮磷協(xié)同高效提供理論依據(jù)。過(guò)量表達(dá)miR399e/g能夠增加總根長(zhǎng)和根表面積、增加大豆氮磷含量，從而增加生物量。過(guò)量表達(dá)miR399e可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆開(kāi)花。

本發(fā)明可應(yīng)用于通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)促進(jìn)豆科作物吸收和利用氮磷能力，對(duì)大豆適應(yīng)低磷脅迫和揭示豆科作物氮磷協(xié)同高效具有重要的理論和實(shí)踐意義。

附圖說(shuō)明

圖1為過(guò)量miR399e和miR399g轉(zhuǎn)基因整株材料的miR399表達(dá)量。

圖2為過(guò)量miR399e和miR399g對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因植株根系（總根長(zhǎng)和根表面積）的影響。

圖3為過(guò)量miR399e和miR399g在不同氮磷養(yǎng)分處理下對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株生長(zhǎng)的影響。

圖4為過(guò)量miR399e和miR399g在不同氮磷養(yǎng)分處理下對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株氮/磷含量的影響。

圖5為過(guò)量miR399e對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株開(kāi)花的影響。

注：以上圖中WT為野生型（YC03-3，即粵春03-3），#6、#7為過(guò)量表達(dá)MIR399e株系，#1為過(guò)量表達(dá)MIR399g株系。HPHN為高磷高氮處理，LPHN為低磷高氮處理，HPLN為高磷低氮處理，LPLN為低磷低氮處理，處理40天。圖中數(shù)據(jù)為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SE），星號(hào)代表同一處理下不同植株與野生型間的差異（Student’s t-test）， *表示差異顯著（ρ<0.05），**表示差異極顯著（ρ<0.01）。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1 構(gòu)建過(guò)量表達(dá)miR399e和miR399g的整株轉(zhuǎn)基因大豆株系

1、miR399e和miR399g過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

（1）引物設(shè)計(jì)

從網(wǎng)站下載miR399e和miR399g的前體全長(zhǎng)序列，分別設(shè)計(jì)特異的擴(kuò)增引物，OE-miR399e（F（Sac I）：AAgagctcCATGCAACGCAAAATAAAGG；R（Xba I）：AAtctagaAAATATGGCATATGAATGGT），

OE-miR399g（F（Sac I）：AAgagctcCCACCAACGCATATTATAACC；R（Xba I）：AAtctagaCATGAAGCAGTACTTTAAGCC）。

（2）片段擴(kuò)增及裝載pTF101.1

以大豆YCO3-3的cDNA為模板，分別用OE-miR399e和OE-miR399g的特異引物擴(kuò)增相應(yīng)片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見(jiàn)下表1和表2。

表 1 PCR反應(yīng)體系

表 2 PCR反應(yīng)條件

（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及T載體連接

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收片段與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，PCR檢測(cè)后送測(cè)序公司測(cè)序。

（4）目的載體連接

測(cè)序正確，提取該質(zhì)粒與pTF101.1質(zhì)粒，用同樣的內(nèi)切酶分別進(jìn)行雙酶切，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒分別回收酶切產(chǎn)物。用連接酶將兩者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，PCR檢測(cè)后送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序正確后將菌液和質(zhì)粒分別保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)將重組的目的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101、EHA101，檢測(cè)無(wú)誤后保存菌液備用。

2、大豆整株遺傳轉(zhuǎn)化

（1）種子萌發(fā)

將完好的大豆YC03-3種子單層排列在培養(yǎng)皿中，放入干燥器中，并將培養(yǎng)皿打開(kāi)，蓋子緊挨著培養(yǎng)皿。將100 ml的次氯酸鈉加至干燥器中250 ml燒杯中，然后沿著杯壁緩緩加入4.2 ml 濃鹽酸（HCl），立即密閉干燥器，靜置過(guò)夜。次日，蓋上培養(yǎng)皿取出，將培養(yǎng)皿放到超凈工作臺(tái)中打開(kāi)除去過(guò)多的氯氣。將消毒的種子種臍朝下播種至萌發(fā)培養(yǎng)基（GM）中，每皿25顆。然后放置在人工氣候室（16小時(shí)光照24 ℃/8小時(shí)黑暗24 ℃）培養(yǎng)4-5天。

（2）農(nóng)桿菌接種

將攜帶目的載體的農(nóng)桿菌EHA101在50 ml液體YEP培養(yǎng)基（添加壯觀(guān)霉素、卡那霉素、氯霉素）中擴(kuò)大培養(yǎng)，28 ℃下200 rpm培養(yǎng)20小時(shí)。5000 rpm下將菌液離心10分鐘，棄上清，用液體共培養(yǎng)基（CM）重懸菌液至OD650值為1.0-1.2。

（3）共培養(yǎng)

用已滅菌的解剖刀從離子葉節(jié)大約0.5 cm的下胚軸切下萌發(fā)的種子，沿著子葉剖開(kāi)種子，并剔除子葉節(jié)上幼芽。在子葉、下胚軸和子葉節(jié)區(qū)域垂直于軸切出7-8個(gè)切口。向裝有外植體的培養(yǎng)皿中加入重懸的農(nóng)桿菌菌液，充分浸泡外植體30分鐘。隨后將外植體轉(zhuǎn)移到固體CM培養(yǎng)基上，切口向下，用保鮮膜封住培養(yǎng)皿，水平放置在人工氣候室暗培養(yǎng)3天。

（4）幼芽的誘導(dǎo)

在液體幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SI）中清洗后，將外植體45°角斜插在固體SI培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿用醫(yī)用透氣膠帶封口，人工氣候室（16小時(shí)光照24 ℃/8小時(shí)黑暗24 ℃）培養(yǎng)。2周后，在子葉節(jié)切去下胚軸，將新的切面插入至新的SI培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2周。

（5）幼芽伸長(zhǎng)

切除未分化的外植體及子葉，并在分化的外植體基部切一個(gè)新切口，然后轉(zhuǎn)移到幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（SE）上，培養(yǎng)皿用醫(yī)用透氣膠帶封口，人工氣候室（16小時(shí)光照24 ℃/8小時(shí)黑暗24 ℃）培養(yǎng)2－8周。每2周更換一次SE培養(yǎng)基，每次剔除老化的愈傷組織，在外植體基部切一個(gè)新切口。

（6）生根培養(yǎng)

待幼芽生長(zhǎng)到3 cm長(zhǎng)時(shí)，把它們從愈傷組織上切下來(lái)，轉(zhuǎn)移到裝有生根培養(yǎng)基（RM）的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行生根培養(yǎng)2周左右。莖上長(zhǎng)出幾條根時(shí)，從培養(yǎng)基中取出轉(zhuǎn)化苗，用自來(lái)水沖洗根部去除培養(yǎng)基，移植到水培瓶中。在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)4周（16小時(shí)光照24 ℃/8小時(shí)黑暗24 ℃）后，將轉(zhuǎn)化苗移植到溫室中，用1/2濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至結(jié)莢，每2周換一次營(yíng)養(yǎng)液。

（7）轉(zhuǎn)基因大豆后代鑒定

轉(zhuǎn)化苗（T0代植株）轉(zhuǎn)移至水培后，用除草劑涂半片葉片上檢測(cè)植株是否具有除草劑抗性。同時(shí)采樣提取DNA，進(jìn)行Bar基因檢測(cè)。待T0代收種后，將種子播種進(jìn)行水培繁種，期間對(duì)過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系采樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后利用熒光定量PCR檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)施例2 過(guò)量miR399e和miR399g分析實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)方法

（1）種子消毒

將成熟、飽滿(mǎn)的大豆種子單層排列在培養(yǎng)皿中，放入干燥器中，并將培養(yǎng)皿打開(kāi)，蓋子緊挨著培養(yǎng)皿。將100 ml的次氯酸鈉加至干燥器中的250 ml燒杯中，然后沿著杯壁緩緩加入4.2 ml 濃鹽酸（HCl），立即密閉干燥器，靜置10小時(shí)。從干燥器中拿出后除去過(guò)多的氯氣。

（2）催芽

將消毒后的種子點(diǎn)入濕潤(rùn)的石英砂中催芽萌發(fā)。

（3）移苗

一周后兩葉一心時(shí)選擇正常、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至水培系統(tǒng)，于溫室中用1/2大豆?fàn)I養(yǎng)液培養(yǎng)。

（4）處理

一周左右待第一片三出復(fù)葉完全展開(kāi)后進(jìn)行處理：低磷低氮結(jié)瘤（LP: 25 μM，LN: 530 μM）、高磷低氮結(jié)瘤（HP: 500 μM，LN: 530 μM ） 、低磷高氮（LP: 25 μM， HN: 5.3 mM）、高磷高氮（HP: 500 μM，HN: 5.3 mM ），每個(gè)處理5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每周換一次營(yíng)養(yǎng)液，每3天調(diào)一次pH。

（5）采樣

對(duì)處理后0天、7 天、35天、40天的根、葉、根瘤采樣，液氮冷凍，-80℃保存。

2、結(jié)果

為了明確過(guò)表達(dá)大豆miR399e和miR399g對(duì)大豆磷營(yíng)養(yǎng)的影響，本文通過(guò)大豆整株轉(zhuǎn)化體系獲得了過(guò)表達(dá)miR399e和miR399g的轉(zhuǎn)基因大豆株系，并通過(guò)除草劑篩選、Bar基因檢測(cè)以及熒光定量PCR鑒定，確定了2個(gè)過(guò)表達(dá)miR399e和1個(gè)miR399g過(guò)表達(dá)株系，即OE-miR399e-6（#6）、OE-miR399e-7（#7）和OE-miR399g-1（#1）。由于真正行使功能的是成熟miRNA，而miR399d/e/f/g的成熟序列一樣，熒光定量PCR并不能區(qū)分miR399d/e/f/g，因此我們首先通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因大豆和野生型中葉部成熟miR399d/e/f/g的表達(dá)量，miR1520d作為看家基因。

圖1為過(guò)量miR399e和miR399g轉(zhuǎn)基因整株材料的miR399表達(dá)量檢測(cè)。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR399e（#6、#7）和miR399g（#1）的株系中miR399的表達(dá)水平明顯高于野生型，其中OE-miR399e-6 (#6)、OE-miR399e-7 (#7)、OE-miR399g-1 (#1)株系分別為野生型的12.0倍、4.7倍和2.8倍，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異達(dá)到顯著（*，ρ<0.05）或極顯著水平（**，ρ<0.01）。

實(shí)施例3 過(guò)量miR399e和miR399g對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株根系的影響

1、根系是植物吸收磷的主要器官，根表面積代表根系與土壤的接觸面積，是與養(yǎng)分吸收相關(guān)的重要指標(biāo)。

我們對(duì)過(guò)表達(dá)miR399e和miR399g的轉(zhuǎn)基因大豆與野生型大豆進(jìn)行處理40天，然后收樣對(duì)根系性狀進(jìn)行分析。

2、結(jié)果

圖2為過(guò)量miR399e和miR399g對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株根系的影響。結(jié)果表明：在HPHN條件下，兩個(gè)OE-miR399e株系（#6、#7）的總根長(zhǎng)分別為野生型的1.85和1.72倍，OE-miR399g-1為野生型的1.63倍。在LPHN條件下，兩個(gè)OE-miR399e株系（#6、#7）的總根長(zhǎng)分別為野生型的1.34和1.49倍，OE-miR399g-1為野生型的1.68倍；HPLN條件下過(guò)表達(dá)株系與野生型總根長(zhǎng)差異不顯著；而LPLN條件下，OE-miR399g-1為野生型的1.58倍，其它過(guò)表達(dá)株系與野生型差異不顯著。HPHN條件下，兩個(gè)OE-miR399e株系（#6、#7）的根表面積分別為野生型的1.73和1.67倍，OE-miR399g-1為野生型的1.47倍（ρ= 0.078）。LPHN條件下，兩個(gè)OE-miR399e株系（#6、#7）的根表面積分別為野生型的1.33、1.47倍，OE-miR399g-1為野生型的1.69倍。HPLN條件下過(guò)表達(dá)株系與野生型根表面積差異不顯著；LPLN條件下，OE-miR399g-1為野生型的1.58倍，其它過(guò)表達(dá)株系與野生型差異不顯著。

實(shí)施例4 過(guò)量miR399e和miR399g在不同氮磷養(yǎng)分處理下對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株生長(zhǎng)和氮/磷含量的影響

1、植株生物量測(cè)定

稱(chēng)量地上部和根部樣品鮮重，所有樣品在105 ℃烘箱殺青30分鐘后置于75 ℃烘干至恒重，稱(chēng)取干重。

2、全磷、全氮含量的測(cè)定

（1）待測(cè)液制備（H₂SO₄- H₂O₂消煮法）

1）稱(chēng)取粉碎的植物干樣和標(biāo)準(zhǔn)樣品0.2 g，分別置于50 mL的消煮管底部。加1 mL二級(jí)水潤(rùn)濕后，加入5 mL濃H₂SO₄，輕輕搖勻，另取干凈消煮管作為空白對(duì)照（加1 mL 二級(jí)水和5 mL濃H₂SO₄）。彎頸小漏斗扣住管口，靜置過(guò)夜；

2）用消煮爐先180 ℃消煮，待H₂SO₄分解冒大量白煙后升高溫度至350℃。溶液呈均勻棕黑色時(shí)取下，稍冷卻后加10滴雙氧水（H₂O₂），搖勻，再消煮5分鐘，重復(fù)3-5次，每次逐次減少H₂O₂的量。溶液清亮或無(wú)色后，再消煮10分鐘，去除多余的H₂O₂，取下，冷卻；

3）二級(jí)水沖洗彎頸漏斗后，定容至50 mL，搖勻，留存待測(cè)。

（2）全磷、全氮含量測(cè)定（流動(dòng)分析法）

1）磷酸鹽模塊試劑

硫酸溶液：取濃H₂SO₄ 40 mL加入960 mL蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至聚乙烯瓶中，加入2 mL FDD6混勻，保存于冰箱中；

蒸餾水+FFD6：取1 L蒸餾水于聚乙烯瓶中，加入2 mL FDD6搖勻，保存于冰箱中；

鉬酸銨溶液：取0.12 g酒石酸（氧）銻鉀（K(SbO)C₄H₄O₆·1/2H₂O）和3.0 g鉬酸銨（(NH₄)Mo₇O₂₄·4H₂O）溶于485 mL蒸餾水中，加入15 mL濃硫酸（H₂SO₄）混勻，保存于冰箱中；

抗壞血酸溶液：取5.5 g抗壞血酸（Vc）溶于470 mL蒸餾水中，加入30 mL丙酮，保存于冰箱中；

沖洗液： 800 mL蒸餾水中加入25 mL濃硫酸混勻，定容至1000 mL；

氮磷混合標(biāo)準(zhǔn)液：取0.9548 g無(wú)水NH₄Cl和0.2197 g無(wú)水KH₂PO₄溶于蒸餾水中，定容至1000 mL，配制成氮磷混標(biāo)儲(chǔ)存液, 保存于冰箱中；

工作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：見(jiàn)表3。

表3 氮磷混標(biāo)工作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

2）氨氮模塊試劑

氯化鈉/硫酸溶液：取10.0 g NaCl溶于800 mL蒸餾水，加入7.5 mL濃硫酸以及1mL Brij35，定容至1 L，保存于冰箱中；

緩沖溶液：取25.0g酒石酸鉀鈉（NaKC₄H₄O₆.4H₂O）、27.0g氫氧化鈉（NaOH）和17.9 g磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄.12H₂O）溶于300 mL蒸餾水，加入0.5 mL Brij35，定容至500 mL，保存于冰箱中；

水楊酸鈉/亞硝基鐵氰化鈉溶液：取75.0g水楊酸鈉（Na₂C₇H₅O₃），0.15g亞硝基鐵氰化鈉（Na₂[Fe(CN)₅NO].2H₂O）溶于蒸餾水，加入0.5 mL Brij35，定容至500mL，保存于冰箱中；

0.3%次氯酸鈉溶液：取4.3mL 7%次氯酸鈉（NaClO），蒸餾水稀釋定容至100 mL，加0.5 mL Brij35，儲(chǔ)存在棕色瓶中，保存于冰箱中；

沖洗液：同磷酸鹽模塊；

氮磷混合標(biāo)準(zhǔn)液：同磷酸鹽模塊；

工作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：同磷酸鹽模塊。

3）上機(jī)測(cè)定全磷、全氮含量

取0.5mL待測(cè)液于測(cè)量杯，加入1.5mL蒸餾水稀釋4倍，按順序放在連續(xù)流動(dòng)分析儀的取樣器轉(zhuǎn)盤(pán)上，收集并處理數(shù)據(jù)。

3、結(jié)果

圖3和圖4為過(guò)量miR399e和miR399g在不同氮磷養(yǎng)分處理下對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株生長(zhǎng)和氮/磷含量的影響。

結(jié)果顯示：過(guò)量表達(dá)miR399e和miR399g促進(jìn)了氮磷的吸收，提高了氮磷協(xié)同利用效率，進(jìn)而促進(jìn)了大豆生長(zhǎng)，顯著提高了植株的氮、磷含量和生物量。

實(shí)施例4 過(guò)量miR399e對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株開(kāi)花的影響

以實(shí)驗(yàn)大豆材料第一朵花開(kāi)放的時(shí)間（天數(shù)）統(tǒng)計(jì)為開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖5為過(guò)量miR399e對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株開(kāi)花的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大豆中過(guò)表達(dá)miR399e導(dǎo)致提前開(kāi)花，與野生型相比，在HPHN條件下 OE-MIR399e兩個(gè)株系分別提前4天和7天開(kāi)花；LPHN條件下OE-MIR399e兩個(gè)株系分別提前4天和5天開(kāi)花。