本發(fā)明一種抗逆基因及其應(yīng)用，具體涉及一種蘋果抗逆相關(guān)基因MdoCKX7及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：果樹一般種植在丘陵山區(qū)和鹽堿地等土壤環(huán)境條件下，栽培方面面臨干旱缺水、鹽脅迫影響。目前，由于果樹遺傳背景的復(fù)雜性，對果樹抗逆基因的篩選工作相對滯后；此外，植物抗性性狀一般受多基因控制，這又提高了果樹抗性研究的難度。因此，亟待研究一種能夠提高干旱、鹽堿脅迫條件下的抗性，并對于果樹的抗性和產(chǎn)量起到關(guān)鍵作用的果樹抗逆基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種蘋果抗逆基因MdoCKX7及其在抗旱和抗鹽的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的應(yīng)用。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種蘋果抗逆基因是從蘋果中分離克隆出的抗鹽相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，并命名為MdMoCKX7，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種蘋果MdoCKX7基因的制備方法，包括以下步驟：(1)提取嘎啦蘋果組培葉片中的RNA及反轉(zhuǎn)錄；(2)cDNA全長序列的獲得：根據(jù)NCBI查到的擬南芥中MIEL1基因保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)兼并引物MdoCKX7-F,MdoCKX7-R，然后以反轉(zhuǎn)錄合成的嘎啦基因組cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA全長序列；其中，MdoCKX7-F序列如SEQ.ID.NO.3所示，MdoCKX7-R序列如SEQ.ID.NO.4所示；(3)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、載體連接、轉(zhuǎn)化，測序得到MdoCKX7基因，MdMoCKX7基因的開放閱讀框(openreadingframe,ORF)為1542bp，編碼513個(gè)氨基酸。進(jìn)一步，步驟(3)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10min。本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種蘋果MdoCKX7基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的應(yīng)用，利用強(qiáng)啟動(dòng)子(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將MdMoCKX7基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)證明，超量表達(dá)MdMoCKX7基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽和干旱脅迫下，死亡率相比于野生型明顯降低，說明MdMoCKX7基因在植株抗逆中發(fā)揮重要作用。綜上，本發(fā)明首次通過植物基因工程技術(shù)改善植物抗鹽、抗旱性和其他有益生產(chǎn)性狀，從嘎啦蘋果組培苗中分離克隆出的抗逆相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，并驗(yàn)證了該基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達(dá)之后轉(zhuǎn)基因植株抗鹽和抗干旱能力明顯提高。附圖說明圖1為MdoCKX7轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察。其中，(A)生長10天的野生型擬南芥(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥(L1，L5，L6)根系系統(tǒng)觀察。(B-C)轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，主根長度增長，側(cè)根數(shù)目顯著增多。Bars＝10mm。圖2為MdoCKX7轉(zhuǎn)基因擬南芥對細(xì)胞分裂素敏感性減弱。其中，(A)為不同濃度細(xì)胞分裂素(ZT)處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根系觀察；(B-C)為不同濃度細(xì)胞分裂素處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥主根長度和側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析；Bars＝10mm。圖3為MdoCKX7基因在擬南芥中過量表達(dá)對擬南芥抗鹽性的影響。其中，(A)為擬南芥在MS培養(yǎng)基上生長6天，選擇長勢一致的幼苗，轉(zhuǎn)移到含有100mMNaCl或200mMNaCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10天，觀察幼苗生長狀況；(B)為擬南芥生長在含有200mMNaCl的MS培養(yǎng)基10天，存活率統(tǒng)計(jì)。圖4為MdoCKX7基因在擬南芥中過量表達(dá)對擬南芥抗旱性的影響。其中，(A)為選擇長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱處理，干旱處理20天后，觀察擬南芥生長情況；對擬南芥復(fù)水2天后，觀察擬南芥生長情況；(B)干旱處理擬南芥，統(tǒng)計(jì)植株存活率。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。實(shí)施例1：蘋果MdMoCKX7基因的克隆一、嘎啦組培葉片RNA提取及反轉(zhuǎn)錄1、利用CTAB法提取總RNA：(1)取1.5g經(jīng)200mMNaCl鹽處理24小時(shí)的嘎啦蘋果組培苗，放入預(yù)冷的研缽，加液氮磨碎，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管中；(2)迅速加入10ml預(yù)熱到65℃的提取緩沖液(其中PVP和巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加)，輕輕混勻，65℃水浴中0.5小時(shí)，其中提取緩沖液組成見表1；表1-提取緩沖液CTAB20％(w/v)Tris-HCI0.1mol/lEDTA25mmol/lNaCI2mol/l巰基乙醇2％(w/v)PVP2％(w/v)RNasefreeddH2O定容到100ml(3)加入與上步離心管液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合物，冰浴振蕩0.5小時(shí)，4℃、12,000rpm離心20分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中；(4)加入1/3上清液體積的10mol/L預(yù)冷LiCl，-20℃放置3小時(shí)，12,000rpm離心30分鐘，棄上清液；(5)加入500μlSSTE緩沖液充分懸浮沉淀后，平均分裝到2支1.5ml離心管中，其中SSTE緩沖液組成見表2；表2-SSTE緩沖液NaCI1mol/lSDS0.5％(w/v)EDTA10mmol/lRNasefreeddH2O定容到10ml(6)分別加入與懸浮液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管；(7)分別加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管；(8)加入2.5倍上清液體積的預(yù)冷無水乙醇，-20℃放置1-2小時(shí)；(9)于4℃、12,000rpm離心20分鐘，70％乙醇洗2次；(10)于4℃、14,000rpm離心10分鐘，超凈臺上風(fēng)干沉淀；加入20μlDEPC水溶解RNA。(11)置-80℃儲藏，備用,或立即進(jìn)行以下反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。2、反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成(1)在0.2ml的微量離心管中配制表3混合液(其中表3中RNA為步驟1提取獲得的；如果用的是-80℃儲藏RNA，必須讓其在冰上緩慢融解)：表3-混合液RNA2μgOligo(dT)Primer(50μM)1μldNTPMixture(10mMeach)1μlRNasefｒeeddH2OUpto10μl(2)用槍頭輕輕混勻，將微量離心管放在PCR儀上(65℃5分鐘)進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，然后冰上急冷；(3)在上述微量離心管中繼續(xù)配制表4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。表4-反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液上述變性、退火后反應(yīng)液10μl5×PrimeScriptTMBuffer4μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μlPrimeScriptTMRTase(200U/μl)1μlRNasefreeddH2O4.5μlTotal20μl(4)在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30℃10分鐘，42℃60分鐘，70℃15分鐘，4℃保存。合成的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，用于進(jìn)行后面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。3、cDNA末端加尾利用TdT末端轉(zhuǎn)移酶，步驟2中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA3’末端加上Poly(C)尾巴，以此為模板進(jìn)行5’RACE擴(kuò)增。在1.5ml離心管中依次加入表5PCR反應(yīng)試劑，終體積為50μl。表5-PCR反應(yīng)試劑純化cDNA產(chǎn)物25μl5×TdTBuffer10μl0.1％BSA5μl10mMdCTP(終濃度0.5mM)2.5μlTdT15UddH2OUpto50μl(1)37℃反應(yīng)30分鐘；(2)加入50μl(等體積)的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，充分混勻；離心，取上層(水層)至另一新的1.5ml離心管中；(3)加入50μl(等體積)的氯仿/異戊醇(24∶1)，充分混勻；離心，取上層(水層)至另一新的1.5ml離心管中；(4)加入5μl(1/10體積)3MNaAC(pH5.2)，再加入125μl(2.5倍體積)預(yù)冷的無水乙醇，-20℃放置30-60分鐘；(5)4℃、12,000rpm離心15分鐘，70％乙醇洗2次；(6)4℃、12,000rpm離心10分鐘，超凈臺上風(fēng)干沉淀；用20μl無菌水溶解DNA，4℃保存。獲得的加尾cDNA作為模板用于后面的5′RACE擴(kuò)增。二、cDNA全長序列的獲得根據(jù)NCBI查到的擬南芥中MIEL1基因保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)兼并引物(MdoCKX7-F,MdoCKX7-R)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MdoCKX7-F：5’-GACTACCGCTCTCTCTCTATACT-3’其序列如SEQ.ID.NO.3所示；MdoCKX7-R：5’-GAAACTAATTACGCCAATAAG-3’其序列如SEQ.ID.NO.4所示；其中，PCR擴(kuò)增體系見表6。表6-PCR擴(kuò)增體系10×PCRbuffer(含Mg2+)2.5μldNTP(2.5mM/l)2.0μl引物1(10μM/l)1.0μl引物2(10μM/l)1.0μlcDNA或基因組DNA模板1.0μlTaq酶0.2μlddH2OUpto25.0μlPCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5分鐘；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳以檢測是否有適當(dāng)大小的條帶，并將PCR產(chǎn)物回收(回收根據(jù)Takara公司“AgaroseGelDNAPurificationKit”操作)、載體連接(取3.0μlPCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，操作步驟按pMD18-TVector說明書進(jìn)行)、轉(zhuǎn)化(連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在表面涂有IPTG/X-Gal的LB平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12-20小時(shí)；挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜)、序列測定(將搖好的菌取1ml放到1.5ml離心管中，密封，在北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定后，得到MdoCKX7基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。實(shí)施例2：轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1、將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8～10min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗5次，吸干水；播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(直接鋪于表面)，光培養(yǎng)(25～28℃，16h長日照或8h短日照10d)，至小苗長出，移栽到基質(zhì)培養(yǎng)到開花。2、挑取農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于10mLYEP液體培養(yǎng)基(含50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8(約48h)；取其中l(wèi)mL菌液加入20mLYEP液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8(約5h)；然后離心收集菌體，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)懸浮稀釋20倍，備用。3、將擬南芥花序浸到侵染液中15～20s，收集果莢，50mg·L-1Hyg抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過連續(xù)3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進(jìn)行表型分析。實(shí)施例3：轉(zhuǎn)基因擬南芥根系表型觀察1、MdoCKX7轉(zhuǎn)基因擬南芥影響根系發(fā)育選取萌發(fā)4～10天、長勢一致的野生型擬南芥(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥(L1，L5，L6)，在MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)6天后，觀察植株根系發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)主根長度和側(cè)根數(shù)目。由圖1可知，在擬南芥中異位表達(dá)MdoCKX7基因能顯著促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，而且轉(zhuǎn)基因擬南芥也表現(xiàn)出主根伸長的表型。2、MdoCKX7轉(zhuǎn)基因擬南芥對細(xì)胞分裂素敏感性的影響采用不同濃度細(xì)胞分裂素(0、0.1、1、10uM)處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥，觀察擬南芥根系發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)主根長度和側(cè)根數(shù)目。由圖2可知，在擬南芥中異位表達(dá)MdoCKX7基因能顯著降低對細(xì)胞分裂素的敏感性。實(shí)施例4：MdoCKX7基因在擬南芥中抗逆性功能驗(yàn)證1、MdoCKX7基因在擬南芥中過量表達(dá)對擬南芥抗鹽性的影響擬南芥在MS培養(yǎng)基上生長6天，選擇長勢一致的幼苗，轉(zhuǎn)移到含有100mMNaCl或200mMNaCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10天，觀察幼苗生長狀況，存活率統(tǒng)計(jì)。由圖3可知，轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫條件下表現(xiàn)出比野生型更好的生長狀態(tài)和更高的存活率。2、MdoCKX7基因在擬南芥中過量表達(dá)對擬南芥抗旱性的影響選擇長勢一致的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱處理，干旱處理20天后，觀察擬南芥生長情況；對擬南芥復(fù)水2天后，觀察擬南芥生長情況，干旱處理擬南芥，統(tǒng)計(jì)植株存活率。由圖4可知，轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫處理后，存活率明顯高于野生型。綜上，MdoCKX7基因在擬南芥中抗逆性功能驗(yàn)證結(jié)果充分說明了MdMAX1基因是一個(gè)抗逆相關(guān)的基因，該基因的過量表達(dá)可以提高植株的抗鹽和抗旱能力。當(dāng)前第1頁1 2 3