本發(fā)明屬于口岸采樣送樣檢測標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域，具體涉及一種物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式。

背景技術(shù)：
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輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物及其傳播的各種疾病對(duì)人類公共衛(wèi)生危害非常嚴(yán)重，是世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一。全球一體化為輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物及蟲媒病的廣范圍、快速度的傳播提供了機(jī)會(huì)；新發(fā)傳染病不斷出現(xiàn)，各種公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)一旦發(fā)生迅速傳遍全球，對(duì)人類的生命健康帶來前所未有的威脅，檢疫風(fēng)險(xiǎn)顯著加劇。但目前口岸現(xiàn)有的輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法存在很多問題，如無法鑒定若蟲、雌蟲等非成蟲態(tài)媒介、肢體殘肢不全的昆蟲及近緣種，輸入性媒介由于缺少參考資料和參比標(biāo)本無法準(zhǔn)確快速鑒定以及數(shù)據(jù)共享性差等。DNA條形碼(DNA barcodes)是用線粒體基因組內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、短的DNA片段來鑒定物種的一項(xiàng)分子物種鑒定技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景，在物種鑒定、假牛羊肉、假魚翅、以次充好等食品欺詐、中草藥種類、生物多樣性及瀕危物種保護(hù)等研究領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。特別是在物種鑒定方面，借助互聯(lián)網(wǎng)⁺可數(shù)字化共享成為該方法的一大優(yōu)勢，利用所建立的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并借助建成的大規(guī)模數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)了大批量快速準(zhǔn)確地鑒別物種。

口岸截獲的輸入性媒介生物的鑒定大多依賴傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類，大多依賴成蟲的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，而口岸截獲的往往是幼蟲、卵、蛹等非成蟲蟲態(tài)。目前通常的做法是將幼蟲、卵和蛹等飼養(yǎng)成成蟲后再鑒定，鑒定周期長，存在著很大的公共衛(wèi)生及生態(tài)隱患，且無法準(zhǔn)確鑒定雌性、肢體殘肢不全的昆蟲及近緣種，但是輸入性醫(yī)學(xué)媒介的近緣種在攜帶的病原體上可能有很大的區(qū)別，對(duì)公共衛(wèi)生安全的威脅風(fēng)險(xiǎn)不同，如果鑒定不準(zhǔn)確極易引起防御過當(dāng)浪費(fèi)資源，或者防御不足產(chǎn)生危害公共衛(wèi)生安全等問題，傳統(tǒng)的鑒定手段已無法滿足提高通關(guān)效率，降低通關(guān)成本，提升口岸通關(guān)和貿(mào)易便利化水平的要求。因此，全國各大口岸亟待開展醫(yī)學(xué)媒介生物鑒定方法的技術(shù)轉(zhuǎn)型升級(jí)、完成檢測技術(shù)的革新。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式，以DNA條形碼鑒定技術(shù)及相關(guān)分子生物學(xué)檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，依托本單位獨(dú)立建立的醫(yī)學(xué)媒介生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫和公共數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用輸入性媒介生物DNA條形碼檢疫鑒定新模式，實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性媒介生物的快速準(zhǔn)確鑒定。

本發(fā)明的物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、統(tǒng)一發(fā)放樣品采集工具、樣品采集管及其運(yùn)輸裝置、樣品采集信息記錄表、物種鑒定系統(tǒng)客戶端至一線口岸，所述的樣品采集工具包括一種便攜耐用的野外采集昆蟲工具、漏斗形昆蟲采樣裝置、電動(dòng)吸蚊器、雙層疊帳、誘蚊器、粘鼠板、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠，所述的樣品采集信息表包括輸出國、啟運(yùn)港、中轉(zhuǎn)港、到達(dá)港、貨物類型和數(shù)量、貨物包裝種類和數(shù)量、啟運(yùn)時(shí)間、到港時(shí)間，所述的物種鑒定系統(tǒng)客戶端是以物種檢疫鑒定中心已有的GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)為基礎(chǔ)的手機(jī)版APP或其他接口；

(2)、進(jìn)行樣品采集：如若發(fā)現(xiàn)活體標(biāo)本，放置于-20℃冰箱中冷凍處理，待其死亡后，依據(jù)檢測需求，將標(biāo)本保存于對(duì)應(yīng)的樣品采集管中，已死亡的個(gè)體或殘肢同樣依據(jù)不同的檢測需求裝入不同的樣品采集管中，采集樣品后需填寫步驟(1)的樣品采集信息記錄表，并掃描樣品采集管上的唯一性條碼標(biāo)識(shí)將樣品單號(hào)錄入至物種鑒定系統(tǒng)，對(duì)采樣現(xiàn)場和采集的樣本進(jìn)行拍照記錄，記錄采集現(xiàn)場的環(huán)境情況，了解樣本入境的方式；

(3)、樣品送檢的前處理：根據(jù)采集到樣本的種類以及口岸的意愿，可選擇整體樣本送檢或者組織送檢，蠅類、蚤類、螨類、蜱類體積較小的媒介生物，可以直接將標(biāo)本保存在含樣品保存劑的樣品采集管中，對(duì)于身體表面鱗片較多，而且鱗片形成的體表花紋具有重要分類意義的生物，以送干制標(biāo)本為宜，如果需要進(jìn)行病原體尤其是RNA病原體的檢測，則需盡快將樣品低溫處死，在覆蓋一層保鮮膜的冰盤中快速分揀種類，以液氮或干冰冷凍方式2小時(shí)之內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測，或者將新鮮采集并分揀后的樣品放入無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測；如果口岸需保存標(biāo)本，也可取標(biāo)本部分組織保存于含樣品保存劑的樣品采集管中，取樣的原則是對(duì)標(biāo)本的外部形態(tài)破壞降到最低，標(biāo)本的其余部分在做好唯一性條碼標(biāo)識(shí)后，貼上與送檢樣品采集管上的一一對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志和樣品采集標(biāo)簽，所述的樣品采集標(biāo)簽包括采集地、采集時(shí)間、采集人和采集管對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志，妥善保管，以備后用；

(4)、送樣：將已采樣的樣品采集管放入專門的樣品采集管運(yùn)輸裝置中，附上填寫完整的步驟(2)的采集信息記錄表通過郵寄或者專人送達(dá)的方式將標(biāo)本送至物種檢疫鑒定中心；

(5)、收樣：物種檢疫鑒定中心在樣品送達(dá)后，掃描唯一性條碼標(biāo)志錄入單號(hào)，并將步驟(2)的采集信息記錄表內(nèi)容錄入物種鑒定系統(tǒng)，同時(shí)物種鑒定系統(tǒng)更新檢測進(jìn)度，將收樣信息發(fā)至送樣口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端，口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端可隨時(shí)登錄系統(tǒng)查看進(jìn)度；

(6)、送檢樣品物理信息的采集：物種檢疫鑒定中心利用雙面觀顯微裝置及昆蟲無損照相的裝置對(duì)采集標(biāo)本的圖像等物理信息進(jìn)行處理，并錄入系統(tǒng)；

(7)、樣品DNA條形碼的檢測：提取DNA，采用通用的DNA條形碼基因片段對(duì)送檢樣本進(jìn)行檢測鑒定，對(duì)于難區(qū)分的近緣種，物種檢疫鑒定中心將聯(lián)合采用線粒體COI、COII、12S、16S和Cytb基因、核糖體ITS2基因多基因聯(lián)合對(duì)送檢的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。利用醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體快速檢測技術(shù)，采用改進(jìn)的媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的NGS檢測前處理方法，分別獲得單個(gè)媒介生物體內(nèi)外攜帶的細(xì)菌性病原體DNA，使用篩選的用于鑒定媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的最佳可變區(qū)或多個(gè)可變區(qū)組合，利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增方法，并采用新一代測序平臺(tái)，一次性高通量的檢測醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體，實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的DNA條形碼鑒定及攜帶病原體的檢測，或采用特異性引物檢測輸入性媒介生物所攜帶的病毒性病原體或者寄生蟲；

(8)、結(jié)果反饋：物種檢疫鑒定中心通過物種鑒定系統(tǒng)將鑒定結(jié)果推送反饋至口岸GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)客戶端，并按委托方的要求返還樣本，寄送檢測報(bào)告，或者在征得送檢方同意的前提下將樣品保存在物種檢疫鑒定中心。

優(yōu)選，所述的樣品采集管，有大、中、小三種規(guī)格，直徑分別為60mm、30mm、10mm，分別適用于不同大小的醫(yī)學(xué)媒介生物，包括蓋子、管體、泡沫填充、昆蟲針及唯一性條碼標(biāo)識(shí)，所述的泡沫填充需填充于管體最下部，所述的唯一性條碼標(biāo)識(shí)被印刷于管體外壁上，所述的泡沫填充可被樣品保存劑來替代，制成可密封保存的液體浸泡采集管，所述的樣品保存劑為非凍型組織DNA保存液或無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液。

優(yōu)選，所述的采集管運(yùn)輸裝置也有大、中、小三種規(guī)格，分別適用于不同大小的采集管，包括上蓋、箱體、采集管固定槽及卡扣，所述的卡扣位于上蓋的邊緣位置，所述的采集管固定槽陳列在箱體內(nèi)，箱體內(nèi)部放置有冷凍液，可較長時(shí)間位置-20℃的環(huán)境。

樣品采集管和采集管運(yùn)輸裝置解決了目前采集裝置不統(tǒng)一、不方便保存標(biāo)本和送樣檢測的問題，可以直接將唯一性條碼標(biāo)識(shí)印刷在采集管上，從而解決貼標(biāo)簽?zāi)：磺寤蛞酌撀涞膯栴}；采集管運(yùn)輸裝置與采集管大小配套使用，可固定采集管，卡扣設(shè)計(jì)方便采集管的放入，扣緊后可保證運(yùn)輸過程中采集管不易搖晃及灑落，解決了目前已有的送樣裝置非定制不統(tǒng)一、運(yùn)輸不用型號(hào)和外觀的采集管產(chǎn)生搖晃等情況導(dǎo)致標(biāo)本損壞的問題。

優(yōu)選，所述的漏斗形昆蟲采樣裝置，包括漏斗形裝置和廣口瓶，所述的漏斗形裝置中間開口，邊緣光滑，并卡扣在廣口瓶上，所述的廣口瓶內(nèi)壁光滑。

所述的漏斗形昆蟲采樣裝置使用時(shí)，需將廣口瓶埋入地下，瓶口幾乎與地面齊平，放誘餌于廣口瓶底部，然后將漏斗形裝置卡住瓶口處即可，昆蟲被誘餌誘導(dǎo)通過漏斗形裝置的底口鉆進(jìn)廣口瓶中，由于廣口瓶內(nèi)壁光滑，故昆蟲不易逃脫且能夠在被檢測前保持形體的完整性。

優(yōu)選，步驟(3)所述的取標(biāo)本部分組織，有以下要求：對(duì)于媒介昆蟲，采集一條腿保存在樣品采集管中，對(duì)于鼠類，剪2cm的鼠尾、鼠肝或鼠肺保存在樣品采集管中，對(duì)于體積非常小的寄生性醫(yī)學(xué)媒介生物，如螨、蜱、蚤，如果是活體，將媒介生物饑餓處理，放入樣品采集管中，如果是死亡個(gè)體，則直接放入樣品采集管中。饑餓處理是為了減少由于吸食寄主的血液對(duì)檢測結(jié)果造成污染。

優(yōu)選，步驟(7)所述的多基因聯(lián)合，具體步驟為：分別從樣本取1條后足，進(jìn)行基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增所用引物為：COⅠ：GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATATTGG，TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COII：CCTCGTCGTTATTCAGATTATCCTGA，TCAGGATAATCTGAATAACGTCGACC；12S：TTAGGTGAAAGCGACGGGCGAT，AATTTGTGCCAGCAGYCGCGGT；16S：CGCCTGTTTATCAAAAACAT，CCGGTCTGAACTCAGATCACGT；Cytb：GGWTAYGTWYTWCCWTGRGGWCARAT，GCRTAWGCRAAWARRAARTAYCAYTCWGG；ITS2：GCATCGATGAAGAACGCAGC，GCTGCGTTCTTCATCGATGC，PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5μl20μmol/L濃度的正向引物2.5μl，10μmol/L濃度的dNTP 1.5μl，Ex-TaqDNA聚合酶1μl，模板DNA 2μl，無菌水定容到50μl；擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃40s，54℃40s，72℃1min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；PCR結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行兩端雙向測序，序列分析與比對(duì)測序結(jié)果經(jīng)校對(duì)無誤后用于后續(xù)分析，所得序列上傳至GenBank，將序列在GenBank和BOLD中進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)行種類鑒定，用軟件進(jìn)行分析，以Kimura 2-parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)樹，輔助進(jìn)行種類的鑒定。

所述的便攜耐用的野外采集昆蟲工具，其結(jié)構(gòu)及使用方法如中國專利ZL201520094555.7所示。所述的電動(dòng)吸蚊器、雙層疊帳、誘蚊器、粘鼠板、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠、非凍型組織DNA保存液、無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液均可在市面上購買得到。

步驟(1)所述的物種鑒定系統(tǒng)擁有軟件著作權(quán)，軟著登字第0564334。

所述的雙面觀顯微裝置其結(jié)構(gòu)及使用方法如中國專利ZL201420701647.2所示，所述的昆蟲無損照相的裝置其結(jié)構(gòu)及使用方法如中國專利ZL201520006169.8所示。

步驟(7)所述的提取DNA，對(duì)于整體或組織較大的樣品，取部分組織研磨后，提取樣品組織的基因組DNA，對(duì)于個(gè)體非常小的媒介生物，參考中國專利ZL201310375667.5的方法提取DNA，直接獲得DNA條形碼片段。參考中國專利申請201610147895.0的方法，在不破壞憑證標(biāo)本的前提下，獲取蜱螨這些微小媒介生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)，所述的組織研磨。使用中國專利ZL201420855384.0的拋棄型微量生物組織研磨工具。

目前，物種鑒定中心已經(jīng)收集了全國大陸28個(gè)省份的口岸及周邊地區(qū)的近400種7萬余頭媒介生物，原始取得DNA條形碼數(shù)據(jù)萬余條。本發(fā)明建立媒介生物DNA條形碼檢疫鑒定新模式，實(shí)現(xiàn)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的快速準(zhǔn)確鑒定。解決了醫(yī)學(xué)媒介生物尤其是媒介昆蟲的檢測受發(fā)育狀態(tài)、肢體殘缺的不全限制、近緣種難以準(zhǔn)確鑒定、某些雌性昆蟲無法鑒定以及輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物由于缺少參考資料和參比標(biāo)本無法準(zhǔn)確快速鑒定的難題，為防控輸入性媒介生物入侵，保障我國公共衛(wèi)生和生態(tài)安全提供技術(shù)支持。

本發(fā)明建立了標(biāo)準(zhǔn)化的采樣、送樣、檢測等流程，保證了樣品或樣品組織的統(tǒng)一不會(huì)被污染，從而更加高效、準(zhǔn)確的獲得鑒定結(jié)果。

附圖說明：

圖1是大號(hào)采集管的結(jié)構(gòu)示意圖，A為裝有泡沫填充的干制樣品保存管，B為帶有樣品保存劑的液體浸泡采集管；

圖2是中號(hào)采集管的結(jié)構(gòu)示意圖，A為裝有泡沫填充的干制樣品保存管，B為帶有樣品保存劑的液體浸泡采集管；

圖3是小號(hào)采集管的結(jié)構(gòu)示意圖，A為裝有泡沫填充的干制樣品保存管，B為帶有樣品保存劑的液體浸泡采集管

圖4是采集管運(yùn)輸裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5是漏斗形昆蟲采樣裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

其中，1：蓋子，2：管體，3：昆蟲針；4：條碼標(biāo)識(shí)；5：泡沫填充；6：樣品保存劑；7：上蓋；8：箱體；9：采集管固定槽；10：卡扣；11：漏斗形裝置；12：廣口瓶；13：底口。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

物種檢疫鑒定中心的運(yùn)行模式，包括以下步驟：

(1)、統(tǒng)一發(fā)放樣品采集工具、樣品采集管及其運(yùn)輸裝置、樣品采集信息記錄表、物種鑒定系統(tǒng)客戶端至一線口岸，所述的樣品采集工具包括一種便攜耐用的野外采集昆蟲工具(參考中國專利ZL201520094555.7)、漏斗形昆蟲采樣裝置、電動(dòng)吸蚊器(天牌)、雙層疊帳(YWJC-01DZ)、誘蚊器、粘鼠板(15×15cm)(達(dá)豪)、Ⅱ號(hào)鼠夾、鼠籠(18×18×38cm)，所述的樣品采集信息表包括輸出國、啟運(yùn)港、中轉(zhuǎn)港、到達(dá)港、貨物類型和數(shù)量、貨物包裝種類和數(shù)量、啟運(yùn)時(shí)間、到港時(shí)間，所述的物種鑒定系統(tǒng)客戶端是以物種檢疫鑒定中心已有的GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)為基礎(chǔ)的手機(jī)版APP或其他接口；

(2)、進(jìn)行樣品采集：如若發(fā)現(xiàn)活體標(biāo)本，放置于-20℃冰箱中冷凍處理，待其死亡后，依據(jù)檢測需求，將標(biāo)本保存于對(duì)應(yīng)的樣品采集管中，已死亡的個(gè)體或殘肢同樣依據(jù)不同的檢測需求裝入不同的樣品采集管中，采集樣品后需填寫步驟(1)的樣品采集信息記錄表，并掃描樣品采集管上的唯一性條碼標(biāo)識(shí)將樣品單號(hào)錄入至物種鑒定系統(tǒng)，對(duì)采樣現(xiàn)場和采集的樣本進(jìn)行拍照記錄，記錄采集現(xiàn)場的環(huán)境情況，了解樣本入境的方式；

(3)、樣品送檢的前處理：根據(jù)采集到樣本的種類以及口岸的意愿，可選擇整體樣本送檢或者組織送檢，蠅類、蚤類、螨類、蜱類體積較小的媒介生物，可以直接將標(biāo)本保存在含樣品保存劑的樣品采集管中，對(duì)于身體表面鱗片較多，而且鱗片形成的體表花紋具有重要分類意義的生物，以送干制標(biāo)本為宜，如果需要進(jìn)行病原體尤其是RNA病原體的檢測，則需盡快將樣品低溫處死，在覆蓋一層保鮮膜的冰盤中快速分揀種類，以液氮或干冰冷凍方式2小時(shí)之內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測，或者將新鮮采集并分揀后的樣品放入無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液(RNAfixer GK3132)(上海捷瑞生物工程有限公司)中，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測；如果口岸需保存標(biāo)本，也可取標(biāo)本部分組織保存于含樣品保存劑的樣品采集管中，取樣的原則是對(duì)標(biāo)本的外部形態(tài)破壞降到最低，標(biāo)本的其余部分在做好唯一性條碼標(biāo)識(shí)后，貼上與送檢樣品采集管上的一一對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志和樣品采集標(biāo)簽，所述的樣品采集標(biāo)簽包括采集地、采集時(shí)間、采集人和采集管對(duì)應(yīng)的條碼標(biāo)志，妥善保管，以備后用；

(4)、送樣：將已采樣的樣品采集管放入專門的樣品采集管運(yùn)輸裝置中，附上填寫完整的步驟(2)的采集信息記錄表通過郵寄或者專人送達(dá)的方式將標(biāo)本送至物種檢疫鑒定中心；

(5)、收樣：物種檢疫鑒定中心在樣品送達(dá)后，掃描唯一性條碼標(biāo)志錄入單號(hào)，并將步驟(2)的采集信息記錄表內(nèi)容錄入物種鑒定系統(tǒng)，同時(shí)物種鑒定系統(tǒng)更新檢測進(jìn)度，將收樣信息發(fā)至送樣口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端，口岸物種鑒定系統(tǒng)客戶端可隨時(shí)登錄系統(tǒng)查看進(jìn)度；

(6)、送檢樣品物理信息的采集：物種檢疫鑒定中心利用雙面觀顯微裝置(參考中國專利ZL201420701647.2)及昆蟲無損照相的裝置(參考中國專利ZL201520006169.8)對(duì)采集標(biāo)本的圖像等物理信息進(jìn)行處理，并錄入系統(tǒng)；

(7)、樣品DNA條形碼的檢測：提取DNA，對(duì)于整體或組織較大的樣品，取部分組織研磨后，提取樣品組織的基因組DNA，對(duì)于個(gè)體非常小的媒介生物，參考中國專利ZL201310375667.5的方法提取DNA，直接獲得DNA條形碼片段，參考中國專利申請201610147895.0的方法，在不破壞憑證標(biāo)本的前提下，獲取蜱螨這些微小媒介生物的DNA條形碼數(shù)據(jù)，所述的組織研磨。使用中國專利ZL201420855384.0的拋棄型微量生物組織研磨工具；然后采用通用的DNA條形碼基因片段對(duì)送檢樣本進(jìn)行檢測鑒定(鑒定方法參考岳巧云，邱德義，胡佳，等.DNA條形碼—醫(yī)學(xué)媒介生物快速準(zhǔn)確鑒定的利器[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2013(5):60)，對(duì)于難區(qū)分的近緣種，物種檢疫鑒定中心將聯(lián)合采用線粒體COI、COII、12S、16S和Cytb基因、核糖體ITS2基因多基因聯(lián)合對(duì)送檢的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，利用醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體快速檢測技術(shù)(具體方法參考陳健等《NGS法檢測大頭金蠅攜帶細(xì)菌性病原體的研究》)，采用改進(jìn)的媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的NGS檢測前處理方法，分別獲得單個(gè)媒介生物體內(nèi)外攜帶的細(xì)菌性病原體DNA，使用篩選的用于鑒定媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體的最佳可變區(qū)或多個(gè)可變區(qū)組合(具體方法參考Chakravorty S,Helb D,Burday M,et al.A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria[J].Journal of microbiological methods,2007,69(2):330-339.)，利用優(yōu)化的PCR擴(kuò)增方法并采用新一代測序平臺(tái)(Illumina(HiSeq 2500/4000)測序平臺(tái)，深圳華大基因公司)，一次性高通量的檢測醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細(xì)菌性病原體，實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入性醫(yī)學(xué)媒介生物的DNA條形碼鑒定及攜帶病原體的檢測，或采用特異性引物檢測輸入性媒介生物所攜帶的病毒性病原體或者寄生蟲(具體方法參考楊美芬,王玉明,黃永坤,等.用細(xì)菌16S rRNA熒光定量PCR法檢測腸道菌群的變化[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2006,18(4):266-269)；

(8)、結(jié)果反饋：物種檢疫鑒定中心通過物種鑒定系統(tǒng)將鑒定結(jié)果推送反饋至口岸GLIMS業(yè)務(wù)管理系統(tǒng)客戶端，并按委托方的要求返還樣本，寄送檢測報(bào)告，或者在征得送檢方同意的前提下將樣品保存在物種檢疫鑒定中心。

所述的樣品采集管，有大、中、小三種規(guī)格(分別如圖1、2、3所示)，直徑分別為60mm、30mm、10mm，分別適用于不同大小的醫(yī)學(xué)媒介生物，包括蓋子1、管體2、泡沫填充5、昆蟲針3及唯一性條碼標(biāo)識(shí)4，所述的泡沫填充5需填充于管體2最下部，所述的唯一性條碼標(biāo)識(shí)4被印刷于管體2外壁上，所述的泡沫填充5可被樣品保存劑6來替代，制成可密封保存的液體浸泡采集管，所述的樣品保存劑6為非凍型組織DNA保存液或無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液。

所述的采集管運(yùn)輸裝置也有大、中、小三種規(guī)格，分別適用于不同大小的采集管，如圖4所示，包括上蓋7、箱體8、采集管固定槽9及卡扣10，所述的卡扣10位于上蓋7的邊緣位置，所述的采集管固定槽9陳列在箱體8內(nèi)，箱體8內(nèi)部放置有冷凍液，可較長時(shí)間位置-20℃的環(huán)境。

樣品采集管和采集管運(yùn)輸裝置解決了目前采集裝置不統(tǒng)一、不方便保存標(biāo)本和送樣檢測的問題，可以直接將唯一性條碼標(biāo)識(shí)印刷在采集管上，從而解決貼標(biāo)簽?zāi)：磺寤蛞酌撀涞膯栴}；采集管運(yùn)輸裝置與采集管大小配套使用，可固定采集管，卡扣設(shè)計(jì)方便采集管的放入，扣緊后可保證運(yùn)輸過程中采集管不易搖晃及灑落，解決了目前已有的送樣裝置非定制不統(tǒng)一、運(yùn)輸不用型號(hào)和外觀的采集管產(chǎn)生搖晃等情況導(dǎo)致標(biāo)本損壞的問題。

所述的漏斗形昆蟲采樣裝置，如圖5所示，包括漏斗形裝置11和廣口瓶12，所述的漏斗形裝置11中間開口，邊緣光滑，并卡扣在廣口瓶12上，所述的廣口瓶12內(nèi)壁光滑。

所述的漏斗形昆蟲采樣裝置使用時(shí)，需將廣口瓶埋入地下，瓶口幾乎與地面齊平，放誘餌于廣口瓶底部，然后將漏斗形裝置卡住瓶口處即可，昆蟲被誘餌誘導(dǎo)通過漏斗形裝置的底口13鉆進(jìn)廣口瓶中，由于廣口瓶內(nèi)壁光滑，故昆蟲不易逃脫且能夠在被檢測前保持形體的完整性。

步驟(3)所述的取標(biāo)本部分組織，有以下要求：對(duì)于媒介昆蟲，采集一條腿保存在樣品采集管中，對(duì)于鼠類，剪2cm的鼠尾、鼠肝或鼠肺保存在樣品采集管中，對(duì)于體積非常小的寄生性醫(yī)學(xué)媒介生物，如螨、蜱、蚤，如果是活體，將媒介生物饑餓處理，放入樣品采集管中，如果是死亡個(gè)體，則直接放入樣品采集管中。饑餓處理是為了減少由于吸食寄主的血液對(duì)檢測結(jié)果造成污染。

步驟(7)中的多基因聯(lián)合鑒定，具體方法為：分別從樣本取1條后足，采用TIANGEN公司生產(chǎn)的Universal Genomic DNA Extraction試劑盒(編號(hào)：DP302-02)，按照試劑盒的使用手冊進(jìn)行基因組DNA提取。PCR擴(kuò)增所用引物為：COⅠ：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA；COII：CCTCGTCGTTATTCAGATTATCCTGA，TCAGGATAATCTGAATAACGTCGACC；12S：TTAGGTGAAAGCGACGGGCGAT，AATTTGTGCCAGCAGYCGCGGT；16S：CGCCTGTTTATCAAAAACAT，CCGGTCTGAACTCAGATCACGT；Cytb:GGWTAYGTWYTWCCWTGRGGWCARAT，GC RTAWGCRAAWARRAARTAYCAYTCWGG；ITS2：GCATCGATGAAGAACGCAGC，GCTGCGTTCTTCATCGATGC。由寶生物工程(大連)有限公司合成。Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑均從TIANGEN公司購置。PCR反應(yīng)體系(50μl)：10×PCR buffer 5μl；正向引物(20μmol/L)2.5μl；dNTP(10mmol/L)1.5μl；Ex-TaqDNA聚合酶1μl；模板DNA 2μl；無菌水定容到50μl。擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃40s，54℃40s，72℃1min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR結(jié)束后將PCR產(chǎn)物送上海立菲科技有限公司進(jìn)行兩端雙向測序。序列分析與比對(duì)測序結(jié)果經(jīng)校對(duì)無誤后用于后續(xù)分析。所得序列上傳至GenBank，將序列在GenBank和BOLD中進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)行種類鑒定。用Mega 6.06軟件進(jìn)行分析，以Kimura 2-parameter模式構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)樹，輔助進(jìn)行種類的鑒定。