本發(fā)明涉及RS₃型抗性淀粉的制備，具體涉及一種以RS₃型馬鈴薯抗性淀粉為晶種復合異淀粉酶、普魯蘭酶的分步脫支酶解過程制備RS₃型秈米抗性淀粉的方法。

背景技術(shù)：

抗性淀粉是指不被健康人體小腸所消化，而能在大腸中被消化吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物的總稱。RS₃型抗性淀粉又稱為回生或重結(jié)晶淀粉，制備原理主要是將淀粉糊化后再迅速冷藏老化回生，淀粉在外加熱源的處理條件下，分子鏈吸水糊化，結(jié)晶高聚態(tài)瓦解，呈高能無序態(tài)；迅速冷藏過程中淀粉分子在空間構(gòu)象上發(fā)生重結(jié)晶，轉(zhuǎn)為結(jié)構(gòu)高度致密的有序態(tài)。RS₃既具有抗性淀粉獨特的抗酶解消化能力和類似胰島素、膳食纖維的生理活性功能，且具有顆粒細小、顏色白膩、風味淡、持水力溫和等特點，而受到世界各地食品科學家及營養(yǎng)學家的關(guān)注，有重要的“藥膳”和商業(yè)價值。直鏈淀粉分子間氫鍵結(jié)合形成雙螺旋進一步堆積聚集形成重結(jié)晶是淀粉短期回生的主力軍。秈米因其粗糙的口感，易碎，較差的加工品質(zhì)及易陳化等劣勢，商品價值極低。大量研究表明，秈米淀粉組分中的直鏈淀粉含量遠高于粳米和糯米，是極好的生產(chǎn)RS₃型抗性淀粉的原料。晶種誘導是指在晶核形成初期，通過添加一定量的晶種降低體系的過飽和度，使晶體在外加晶核的基礎(chǔ)上快速生長，提高體系穩(wěn)定性，加快晶體形成，得到晶體粒度分布集中的晶體顆粒。馬鈴薯原料易得，天生具有高含量的直鏈淀粉，是作為制備RS₃型秈米抗性淀粉晶種的最佳選擇。

近幾年，RS₃的制備方法主要有濕熱法、酶法、微波法、超聲輔助法等，但無論是單一制備方法還是幾種方法結(jié)合的制備方法都不能得到粒度分布集中的晶體顆粒產(chǎn)品，且目前使用的酶法制備RS₃均采用液化酶復合脫支酶，液化酶不僅使原料中的直鏈淀粉損失且反應過程中產(chǎn)生的大量糊精也影響了RS₃生成。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)中制備RS₃型抗性淀粉技術(shù)的不足，提供一種RS₃型秈米抗性淀粉的晶種誘導-雙酶復合制備方法，該方法通過對秈米淀粉進行微波預糊化，異淀粉酶和普魯蘭酶分步脫支酶解淀粉分子，提高體系直鏈淀粉含量，再以RS₃型馬鈴薯抗性淀粉為晶種制備RS₃型秈米抗性淀粉，得到的RS₃晶體粒度分布集中，平均產(chǎn)率可達27.42%。

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種RS₃型秈米抗性淀粉的晶種誘導-雙酶復合制備方法，該方法步驟如下：

a.取粉碎并過40目篩的秈米制成秈米淀粉，將秈米淀粉調(diào)至含水量為30-40%后用微波爐以450-600W功率處理2min，得秈米干淀粉；

b.將上述秈米干淀粉用pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為10-50%的淀粉乳，80-85℃水浴條件下處理20-30min，冷卻至45-50℃，加入異淀粉酶酶解1-5h，異淀粉酶的加入量為1g秈米干淀粉加10-40 U異淀粉酶，滅酶，冷卻至室溫，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)pH為4.5，水浴加熱至55-60℃，再加入普魯蘭酶酶解1-5h，普魯蘭酶的加入量為1g秈米干淀粉加10-40U普魯蘭酶，滅酶，冷卻至30-70℃；

c.于上述酶解后的淀粉乳中加入為秈米干淀粉重量2-10%的RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種，混勻后快速置于4℃環(huán)境中冷藏24-48h，純化，干燥，即得RS₃型秈米抗性淀粉；

上述提及的RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種是以馬鈴薯淀粉（市購產(chǎn)品）為原料，加蒸餾水配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為10%的馬鈴薯淀粉乳，于80-85%恒溫水浴下預糊化至馬鈴薯淀粉乳呈透明凝膠狀，滅菌，冷卻至室溫，最后置于4℃環(huán)境中冷藏24-48h，純化，即可。

上述RS₃型馬鈴薯抗性淀粉晶種制備中的純化是指將冷藏后的馬鈴薯淀粉乳的pH值調(diào)為1.5，于馬鈴薯淀粉乳中，按1g原料馬鈴薯淀粉加12-20U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，38-40℃恒溫水浴處理1-2h，調(diào)節(jié)pH值為6.0-6.5；再按1g原料馬鈴薯淀粉加80-100U耐高溫a-淀粉酶的比例加入耐高溫a-淀粉酶，于90-95℃恒溫水浴處理20-30min，調(diào)節(jié)pH值為4.0-4.5；接著，按1g原料馬鈴薯淀粉加150-200U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于58-60℃恒溫水浴處理1-2h，冷卻至室溫；最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，離心，棄上清液，重復處理（即加乙醇離心過程）3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇。其中，離心時的轉(zhuǎn)速為4000-4500r/min、時間為15-35min。

上述RS₃型馬鈴薯抗性淀粉晶種制備中的滅菌是指采用高壓蒸汽滅菌鍋于110-121℃、0.05-0.15MPa條件下滅菌處理20-30min。

上述步驟b中pH為5.0的磷酸鹽緩沖鹽是由0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液與0.1mol/L 檸檬酸溶液配制。

上述步驟b中的兩次滅酶是指將酶解后的淀粉乳于85-90℃恒溫水浴10-15min。

上述步驟c中的純化是指將冷藏后的淀粉乳調(diào)pH值為1.5，于該冷藏后的淀粉乳中，按1g秈米干淀粉加12-20U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，38-40℃恒溫水浴處理1-2h，調(diào)節(jié)pH值為6.0-6.5；再按1g秈米干淀粉加80-100U耐高溫a-淀粉酶的比例加入耐高溫a-淀粉酶，于90-95℃恒溫水浴處理20-30min，調(diào)節(jié)pH值為4.0-4.5；然后按1g秈米干淀粉加150-200U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于58-60℃恒溫水浴處理1-2h，冷卻至室溫；最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，離心，棄上清液，重復（即重復加乙醇離心的過程）處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇。其中，離心時的轉(zhuǎn)速為4000-4500r/min、時間為15-35min。

上述步驟c中的干燥是指于60-70℃烘干8-10h。

上述提及的秈米淀粉的制備為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，凡依現(xiàn)有技術(shù)能制備得到秈米淀粉的方法，皆適應用于本發(fā)明。如：將秈米粉原料置入浸漬槽中，加入為秈米粉重量5倍的0.3-0.5%質(zhì)量濃度的氫氧化鈉溶液，50℃下浸漬24小時，然后排出堿液，用清水洗滌一次，再次加入為秈米粉原料重量5倍的0.3-0.5%質(zhì)量濃度的氫氧化鈉溶液浸漬36-38小時，排出堿液后研磨成漿，研磨時按1:1的重量比一邊研磨一邊加入0.3-0.5%質(zhì)量濃度的氫氧化鈉溶液，將米漿沉淀或送入離心機中分離，所得的濕淀粉再用清水多次漂洗，精凈即可。

上述提及的各種酶均為市購產(chǎn)品。

本發(fā)明利用微波技術(shù)預先處理秈米淀粉原料，能使淀粉分子膨脹，擴大與異淀粉酶和普魯蘭酶的接觸面積，提高了酶解效率。淀粉體系中的直鏈淀粉含量迅速提高，并在外加晶種的誘導條件下快速發(fā)生重結(jié)晶，生成粒度分布集中的RS₃型秈米抗性淀粉晶體顆粒產(chǎn)品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1.秈米因其粗糙的口感、易碎、較差的加工品質(zhì)和易陳化等劣勢，商品價值極低。本發(fā)明充分利用秈米中直鏈淀粉遠高于粳米和糯米這一優(yōu)勢，將其作為生產(chǎn)RS₃型抗性淀粉的原料，提升了秈米附加值和應用領(lǐng)域。

2.本發(fā)明采用異淀粉酶和普魯蘭酶分步對秈米淀粉進行脫支處理，此方法避免了目前研究中使用液化酶導致直鏈淀粉損失且產(chǎn)生大量糊精影響RS₃生成等負面影響。

3.脫支酶解后添加RS₃型馬鈴薯抗性淀粉晶種，誘導淀粉體系中易于重結(jié)晶的直鏈淀粉在較低的過飽和度下快速聚集生長，避免了自然起晶時間長，易發(fā)生爆發(fā)成核等劣勢現(xiàn)象，晶種誘導成核不僅有利于RS₃型秈米抗性淀粉晶體的生長，還有利于提高產(chǎn)率，得到晶體粒度分布集中的抗性淀粉產(chǎn)品。

4.本發(fā)明使用的淀粉原料易得，不受季節(jié)限制，可常年生產(chǎn)，加工成本合理，產(chǎn)品具有很好的市場前景。

具體實施方式

秈米淀粉的制備：取秈米粉碎，過40目篩，按現(xiàn)有技術(shù)制備成秈米淀粉。

實施例1

RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種的制備：以馬鈴薯淀粉為原料，加蒸餾水配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為10%的馬鈴薯淀粉乳，于80%恒溫水浴下預糊化，至馬鈴薯淀粉乳呈透明凝膠狀，再采用高壓蒸汽滅菌鍋于110℃、0.05MPa條件下處理30min，冷卻至室溫，置于4℃環(huán)境中冷藏24h，調(diào)pH值為1.5；于馬鈴薯淀粉乳中，按1g原料馬鈴薯淀粉加12U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，于38℃恒溫水浴處理2h，調(diào)節(jié)pH值為6.0；再按1g原料馬鈴薯淀粉加80U耐高溫a-淀粉酶的比例加入耐高溫a-淀粉酶，于90℃恒溫水浴處理30min，調(diào)節(jié)pH值為4.0；接著，按1g原料馬鈴薯淀粉加150U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于58℃恒溫水浴處理2h，冷卻至室溫；最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，以4000r/min離心35min，棄上清液，重復處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，即得。

RS₃型秈米抗性淀粉的制備：以上述秈米淀粉為原料，調(diào)節(jié)含水量為30%，用微波爐以450W功率處理2min后，得秈米干淀粉，用pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液將秈米干淀粉配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為10%的淀粉乳，80℃水浴條件下處理30min，冷卻至45℃，加入異淀粉酶（1g秈米干淀粉加10U異淀粉酶）酶解5h，滅酶（于85℃恒溫水浴15min），冷卻至室溫，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)pH為4.5，水浴加熱至55℃，再加入普魯蘭酶（1g秈米干淀粉加10U普魯蘭酶）酶解5h，滅酶（于85℃恒溫水浴15min），冷卻至30℃；于上述酶解后的淀粉乳中加入為秈米干淀粉重量2%的上述RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種，混勻后快速置于4℃環(huán)境中冷藏24h，將冷藏后的淀粉乳調(diào)pH值為1.5，再于該冷藏后的淀粉乳中加入胃蛋白酶（1g秈米干淀粉加12U胃蛋白酶），38℃恒溫水浴處理2h，調(diào)節(jié)pH值為6.0，接著加入耐高溫a-淀粉酶（1g秈米干淀粉加80U耐高溫a-淀粉酶），于90℃恒溫水浴處理30min，調(diào)節(jié)pH值為4.0，然后加入葡萄糖淀粉酶（1g秈米干淀粉加150U葡萄糖淀粉酶），于58℃恒溫水浴處理2h，冷卻至室溫，最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，以4000r/min離心35min，棄上清液，重復處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，60℃干燥10h，即得RS₃型秈米抗性淀粉。

實施例2

RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種的制備：以馬鈴薯淀粉為原料，加蒸餾水配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為10%的馬鈴薯淀粉乳，于85%恒溫水浴下預糊化，至馬鈴薯淀粉乳呈透明凝膠狀，再采用高壓蒸汽滅菌鍋于121℃、0.15MPa下處理20min，冷卻至室溫，置于4℃環(huán)境中冷藏48h，調(diào)pH值為1.5；于馬鈴薯淀粉乳中，按1g原料馬鈴薯淀粉加20U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，于40℃恒溫水浴處理1h，調(diào)節(jié)pH值為6.5；再按1g原料馬鈴薯淀粉加100U耐高溫a-淀粉酶的比例加入耐高溫a-淀粉酶，于95℃恒溫水浴處理20min，調(diào)節(jié)pH值為4.5；接著，按1g原料馬鈴薯淀粉加150U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于60℃恒溫水浴處理1h，冷卻至室溫；最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，以4500r/min離心15min，棄上清液，重復處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，即得。

RS₃型秈米抗性淀粉的制備：以上述秈米淀粉為原料，調(diào)節(jié)含水量為40%，用微波爐以600W功率處理2min，用pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液將秈米干淀粉配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為50%的淀粉乳，85℃水浴條件下處理20min，冷卻至50℃，加入異淀粉酶（1g秈米干淀粉加40U異淀粉酶）酶解1h，滅酶（于90℃恒溫水浴10min），冷卻至室溫，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)pH至4.5，水浴加熱至60℃，再加入普魯蘭酶（1g秈米干淀粉加40U普魯蘭酶）酶解1h，滅酶（于90℃恒溫水浴10min），冷卻至70℃；于上述酶解后的淀粉乳中加入為秈米干淀粉重量10%的上述RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種，混勻后快速置于4℃環(huán)境中冷藏48h，將冷藏后的淀粉乳調(diào)pH值至1.5，再于冷藏后的淀粉乳中加入胃蛋白酶（1g秈米干淀粉加20U胃蛋白酶），40℃恒溫水浴處理1h，調(diào)節(jié)pH值為6.5，接著加入耐高溫a-淀粉酶（1g秈米干淀粉加100U耐高溫a-淀粉酶），于95℃恒溫水浴處理20min，調(diào)節(jié)pH值為4.5，然后加入葡萄糖淀粉酶（1g秈米干淀粉加200U葡萄糖淀粉酶），于60℃恒溫水浴處理1h，冷卻至室溫，最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，以4500r/min離心15min，棄上清液，重復處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，70℃干燥8h，即得RS₃型秈米抗性淀粉。

實施例3

RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種的制備：以馬鈴薯淀粉為原料，加蒸餾水配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為10%的馬鈴薯淀粉乳，于82%恒溫水浴下預糊化，至馬鈴薯淀粉乳呈透明凝膠狀，采用高壓蒸汽滅菌鍋于115℃、0.10MPa條件下處理25min，冷卻至室溫，置于4℃環(huán)境中冷藏36h，調(diào)pH值為1.5；于馬鈴薯淀粉乳中，按1g原料馬鈴薯淀粉加16U胃蛋白酶的比例加入胃蛋白酶，于39℃恒溫水浴處理1.5h，調(diào)節(jié)pH值為6.2；再按1g原料馬鈴薯淀粉加90U耐高溫a-淀粉酶的比例加入耐高溫a-淀粉酶，于92℃恒溫水浴處理25min，調(diào)節(jié)pH值為4.2；接著，按1g原料馬鈴薯淀粉加180U葡萄糖淀粉酶的比例加入葡萄糖淀粉酶，于59℃恒溫水浴處理1.5h，冷卻至室溫；最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，以4200r/min離心25min，棄上清液，重復處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，即得。

RS₃型秈米抗性淀粉的制備：以上述秈米淀粉為原料，調(diào)節(jié)含水量為35%，用微波爐以500W功率處理2min，得秈米干淀粉；用pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液將秈米干淀粉配制成淀粉質(zhì)量分數(shù)為30%的淀粉乳，82℃水浴條件下處理25min，冷卻至48℃，加入異淀粉酶（1g秈米干淀粉加20U異淀粉酶）酶解3h，滅酶（88℃恒溫水浴12min），冷卻至室溫，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)pH至4.5，水浴加熱至58℃，再加入普魯蘭酶（1g秈米干淀粉加20U普魯蘭酶）酶解3h，滅酶（88℃恒溫水浴12min），冷卻至50℃；于上述酶解后的淀粉乳中加入為秈米干淀粉重量7%的上述RS₃型馬鈴薯抗性淀粉濕晶種，混勻后快速置于4℃環(huán)境中冷藏36h，將冷藏后的淀粉乳調(diào)pH值至1.5，再于冷藏后的淀粉乳中加入胃蛋白酶（1g秈米干淀粉加16U胃蛋白酶），39℃恒溫水浴處理1.5h，調(diào)節(jié)pH值為6.2，接著加入耐高溫a-淀粉酶（1g秈米干淀粉加90U耐高溫a-淀粉酶），于92℃恒溫水浴處理25min，調(diào)節(jié)pH值為4.2，然后加入葡萄糖淀粉酶（1g秈米干淀粉加180U葡萄糖淀粉酶），于59℃恒溫水浴處理1.5h，冷卻至室溫，最后加入95%質(zhì)量濃度的乙醇，以4200r/min離心25min，棄上清液，重復處理3次，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，65℃干燥9h，即得RS₃型秈米抗性淀粉。