本發(fā)明涉及煙用香精香料的制取方法，具體是指一種固定化β-葡萄糖苷酶制備煙用藏紅花提取物的方法。

背景技術(shù)：

在煙草制品中，煙草的香氣和吸味是至關(guān)重要的，添加香料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是完善產(chǎn)品風(fēng)格和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一，可以給消費(fèi)者提供一些香氣和吸味滿意的卷煙制品。目前，我國(guó)煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統(tǒng)的方法配制的，即以天然提取物單體和合成單體混合調(diào)配而成，這樣所制得的煙用香料雖然市場(chǎng)操作簡(jiǎn)單，但存在香氣單調(diào)，對(duì)煙草改善性不足，而且改善卷煙抽吸品質(zhì)效果不明顯等缺點(diǎn)。

藏紅花(學(xué)名：polianthestuberosa)，又名夜來(lái)香、月下香，石蒜科藏紅花屬植物，分布于墨西哥、南美等地區(qū)。藏紅花中含有藏紅花醛、2,4,4-三甲基-3-甲醛-5-羥基-2,5-環(huán)己二烯-1-酮、2-羥基-3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、2,2,6-三甲基-1,4-環(huán)己二酮、二氫-β-紫羅蘭酮、異佛爾酮等香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)具有特征的甜香香韻。而花類的芳香物質(zhì)大多以糖苷鍵合態(tài)形式存在，難以釋放出來(lái)。如果用常規(guī)制備方法獲得香料，香料中香氣物質(zhì)的得率較低，使得藏紅花提取物在卷煙中的煙香不明顯，從而限制了藏紅花提取物在卷煙中的應(yīng)用。

β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase)，又稱β-d-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶(cellobias)和苦杏仁苷酶。它屬于纖維素酶類，是纖維素分解酶系中的重要組成成分，能夠水解糖苷類，同時(shí)釋放出β-d-葡萄糖和香氣成分。

固定化酶(immobilizedenzyme)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，是用物理或化學(xué)方法處理水溶性的酶使之變成不溶于水或固定于固相載體的但仍具有酶活性的酶衍生物。與游離酶相比，固定化酶可以較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)，從而提高了酶的使用效率，增加產(chǎn)物的收率，降低了成本；在反應(yīng)完成后固定化酶極易與產(chǎn)物分開(kāi)，簡(jiǎn)化提純工藝，提高了產(chǎn)物的質(zhì)量。因此，廣泛應(yīng)用于污水治理、醫(yī)藥工程、化工合成等領(lǐng)域，但在煙用藏紅花提取物制備中卻未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種固定化β-葡萄糖苷酶制備煙用藏紅花提取物的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，藏紅花提取得率高、品質(zhì)好。

本發(fā)明的制備方法包括以下步驟：

(1)取藏紅花干花，加入其5～15倍重量的水，微波提取兩次，每次1-3h，將提取液靜置冷卻后過(guò)濾，收集濾液得到藏紅花提取液；

(2)將0.1～0.3g固體β-葡萄糖苷酶溶于1ml檸檬酸緩沖液(0.1mol/l，ph4.5)中，加入15～20ml質(zhì)量濃度為2％的海藻酸鈉溶液，攪拌均勻，再加入20～30ml質(zhì)量濃度為2％氯化鈣溶液，4℃包埋1～3h后，用緩沖溶液洗滌，得海藻酸鈉固定化酶，其承載量為10～20u/g。

(3)取固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液，固定化β-葡萄糖苷酶固體用量0.5g/l～5g/l，酶處理的ph值3～7，酶處理溫度30℃～40℃，酶處理時(shí)間5h～30h，處理完成后在3℃沉降處理36h～48h；

(4)將酶處理后的提取液過(guò)濾，得澄清的藏紅花提取液，將過(guò)濾后的藏紅花提取液減壓濃縮，濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.30，收集濃縮液得到煙用藏紅花提取物。

進(jìn)一步的，所述酶處理后的提取液過(guò)濾時(shí)，用濾紙過(guò)濾去大顆粒的雜質(zhì)，得澄清的藏紅花提取液。

進(jìn)一步的，所述過(guò)濾后的藏紅花提取液減壓濃縮時(shí)，濃縮溫度為50～80℃，濃縮壓力為0.01～0.1個(gè)大氣壓。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取物，水解藏紅花中的香氣前體物質(zhì)，釋放出潛在的芳香成分，大大提高了藏紅花中的芳香物質(zhì)的提取得率，得到香氣更豐富、品質(zhì)更好的特色煙用香原料。本發(fā)明所制備的藏紅花提取物具有清新的花香香氣，并帶有宜人的甜香香韻。將藏紅花提取物添加到卷煙中，具有豐富煙香、增加甜香香韻的作用。本發(fā)明改善了藏紅花提取物的品質(zhì)，提升了了藏紅花提取物在卷煙中適應(yīng)性；該方法實(shí)現(xiàn)了連續(xù)操作，，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，便于工業(yè)化轉(zhuǎn)化；提高了產(chǎn)物的得率，降低了成本。

利用固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取物，釋放藏紅花提取物中藏紅花醛、二氫-β-紫羅蘭酮、異佛爾酮等芳香物質(zhì)，制備特色的煙用藏紅花提取物，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，提取得率高，香料品質(zhì)好。與游離β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取物相比，固定化處理后，不需要通過(guò)膜分離去除游離酶，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，便于工業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)化；減少了提取分離過(guò)程中的損失，得率提高了3.8％～10.9％；藏紅花提取物中主要香氣物質(zhì)藏紅花醛、二氫-β-紫羅蘭酮、異佛爾酮相對(duì)含量提高了13.3％～14.8％，添加到卷煙中，卷煙香氣更加豐富，甜香韻更加明顯。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

(1)取藏紅花干花，加入其5倍重量的水，微波提取兩次，每次1小時(shí)，將提取液靜置冷卻后過(guò)濾，收集濾液得到藏紅花提取液；

(2)將0.2g固體β-葡萄糖苷酶溶于1ml檸檬酸緩沖液(0.1mol/l，ph4.5)中，加入18ml質(zhì)量濃度為2％的海藻酸鈉溶液，攪拌均勻，再加入26ml質(zhì)量濃度為2％(w/v)氯化鈣溶液，4℃包埋1.5h后，用緩沖溶液洗滌，得海藻酸鈉固定化酶，其承載量為15u/g。

(3)取固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液，固定化β-葡萄糖苷酶固體用量0.5g/l，酶處理的ph值3～4，酶處理溫度35℃，酶處理時(shí)間30h，處理完成后在3℃沉降處理36h；

(4)將酶處理后的提取液用濾紙過(guò)濾去除大顆粒的雜質(zhì)，得澄清的藏紅花提取液，將過(guò)濾后的藏紅花提取液減壓濃縮，濃縮溫度為50℃，濃縮壓力為0.01個(gè)大氣壓，濃縮至相對(duì)密度為1.10，收集得到煙用藏紅花提取物。

實(shí)施例2

(1)取藏紅花干花，加入其15倍重量的水，微波提取兩次，每次3小時(shí)，將提取液靜置冷卻后過(guò)濾，收集濾液得到藏紅花提取液；

(2)將0.1g固體β-葡萄糖苷酶溶于1ml檸檬酸緩沖液(0.1mol/l，ph4.5)中，加入15ml質(zhì)量濃度為2％的海藻酸鈉溶液，攪拌均勻，再加入20ml質(zhì)量濃度為2％(w/v)氯化鈣溶液，4℃包埋1h后，用緩沖溶液洗滌，得海藻酸鈉固定化酶，其承載量為10u/g。

(3)取固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液，固定化β-葡萄糖苷酶固體用量5g/l，酶處理的ph值5～6，酶處理溫度30℃，酶處理時(shí)間15h，處理完成后在3℃沉降處理40h；

(4)將酶處理后的提取液用濾紙過(guò)濾去除大顆粒的雜質(zhì)，得澄清的藏紅花提取液，將過(guò)濾后的藏紅花提取液減壓濃縮，濃縮溫度為80℃，濃縮壓力為0.1個(gè)大氣壓，濃縮至相對(duì)密度為1.30，收集得到煙用藏紅花提取物。

實(shí)施例3

(1)取藏紅花干花，加入其10倍重量的水，微波提取兩次，每次2小時(shí)，將提取液靜置冷卻后過(guò)濾，收集濾液得到藏紅花提取液；

(2)將0.3g固體β-葡萄糖苷酶溶于1ml檸檬酸緩沖液(0.1mol/l，ph4.5)中，加入20ml質(zhì)量濃度為2％的海藻酸鈉溶液，攪拌均勻，再加入30ml質(zhì)量濃度為2％(w/v)氯化鈣溶液，4℃包埋3h后，用緩沖溶液洗滌，得海藻酸鈉固定化酶，其承載量為20u/g。

(3)取固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液，固定化β-葡萄糖苷酶固體用量2g/l，酶處理的ph值6～7，酶處理溫度40℃，酶處理時(shí)間5h，處理完成后在3℃沉降處理48h；

(4)將酶處理后的提取液用濾紙過(guò)濾去除大顆粒的雜質(zhì)，得澄清的藏紅花提取液，將過(guò)濾后的藏紅花提取液減壓濃縮，濃縮溫度為65℃，濃縮壓力為0.06個(gè)大氣壓，濃縮至相對(duì)密度為1.2，收集得到煙用藏紅花提取物。

實(shí)施例4

(1)取藏紅花干花，加入其7倍重量的水，微波提取兩次，每次1.4h，將提取液靜置冷卻后過(guò)濾，收集濾液得到藏紅花提取液；

(2)將0.15g固體β-葡萄糖苷酶溶于1ml檸檬酸緩沖液(0.1mol/l，ph4.5)中，加入16ml質(zhì)量濃度為2％的海藻酸鈉溶液，攪拌均勻，再加入27ml質(zhì)量濃度為2％氯化鈣溶液，4℃包埋2h后，用緩沖溶液洗滌，得海藻酸鈉固定化酶，其承載量為17u/g。

(3)取固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液，固定化β-葡萄糖苷酶固體用量3.5g/l，酶處理的ph值5.5～6.6，酶處理溫度36℃，酶處理時(shí)間20h，處理完成后在3℃沉降處理38h；

(4)將酶處理后的提取液用濾紙過(guò)濾去大顆粒的雜質(zhì)，得澄清的藏紅花提取液，將過(guò)濾后的藏紅花提取液減壓濃縮，濃縮溫度為72℃，濃縮壓力為0.08個(gè)大氣壓濃縮至相對(duì)密度為1.24，收集濃縮液得到煙用藏紅花提取物。

本發(fā)明采用固定化β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液，將其與其他步驟與本發(fā)明相同，而采用游離β-葡萄糖苷酶處理藏紅花提取液的處理方式比較，如表1所示，為不同處理方式藏紅花提取物中藏紅花醛、二氫-β-紫羅蘭酮、異佛爾酮相對(duì)含量比較，如表2所示，將不同處理方式下的藏紅花提取物，添加到卷煙中的卷煙評(píng)吸結(jié)果。

表1藏紅花醛、二氫-β-紫羅蘭酮、異佛爾酮相對(duì)含量比較

表2不同處理方式的藏紅花提取在卷煙中的感官評(píng)價(jià)效果

本發(fā)明的制備方法使藏紅花提取物的得率提高了3.8％～10.9％；以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：藏紅花提取物中主要香氣物質(zhì)藏紅花醛、二氫-β-紫羅蘭酮、異佛爾酮相對(duì)含量提高了13.3％～14.8％，將其添加到卷煙中，卷煙香氣更加豐富，甜香韻更加明顯。充分說(shuō)明了采用本發(fā)明的提取方法制備出了產(chǎn)量更高、品質(zhì)更好的藏紅花提取物。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，并不以此限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路上所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。