本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻MIT1基因、其編碼的蛋白及其在抑制水稻分枝中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻(Oryza sativa)為禾本科單子葉植物，是世界上重要的糧食作物之一。目前，我國水稻種植面積約4.5億畝，居世界第二位，總產(chǎn)量2.04億噸，居世界第一位，單產(chǎn)420公斤，是世界平均水平的1.6倍。然而，隨著人口的持續(xù)增長和耕地面積的不斷減少，對糧食生產(chǎn)帶來了更大的挑戰(zhàn)。因此，通過品種的遺傳改良，挖掘作物的單產(chǎn)潛力是解決糧食安全問題的有效途徑，也是保障世界糧食產(chǎn)量穩(wěn)步增長的根本出路所在。

分蘗是決定水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，是單子葉植物生長發(fā)育過程中形成的一種特殊的分枝性狀，存在著一定的規(guī)律。水稻分蘗發(fā)生的早晚或多少，與品種特性有關(guān)，分蘗增長速度在品種間也存在差異，即遺傳因素是影響分蘗動態(tài)變化的主要原因之一。水稻分蘗分為有效分蘗和無效分蘗，有效分蘗的比例高，即分蘗的成穗率高是群體質(zhì)量的重要標(biāo)志。如果能控制最高分蘗數(shù)，使后期無效分蘗減少，分蘗成穗率便可大幅度提高，而有望提高產(chǎn)量。分蘗角度為抽穗前主莖與分蘗之間的夾角。分蘗角度過小，常規(guī)種植會使植株間的空隙較大，葉面積指數(shù)較小，浪費(fèi)光能；分蘗角度過大，易使個體間遮擋，光能利用率降低。因此，分蘗角度對于水稻株型的構(gòu)成具有重要意義，與植物的形態(tài)，群體密度，光能利用率和風(fēng)速等水稻生理生態(tài)特性有重大的關(guān)系。從育種角度來看，豐產(chǎn)性好的水稻品種表現(xiàn)為分蘗力強(qiáng)，成穗率高，穗粒數(shù)多，結(jié)實(shí)率高，這也是實(shí)現(xiàn)超級稻高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的保證，即在超級稻生物量較高的基礎(chǔ)上提高收獲指數(shù)。選育分蘗變化平穩(wěn)，有效分蘗期長，成穗率高的品種，產(chǎn)生足夠的群體數(shù)量，保證良好的群體結(jié)構(gòu)，更好的協(xié)調(diào)群體與個體間的矛盾，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)量。

水稻矮源是帶有矮稈或半矮稈基因的種質(zhì)資源，大量實(shí)驗證明矮化能明顯提高水稻的產(chǎn)量。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的矮稈基因主要是sd1。系統(tǒng)分析我國育成的秈稻品種表明，利用的矮稈資源主要有六個：矮腳南特、矮仔占、低腳烏尖、花龍水田谷、矮腳水谷田和中山無名種等。其中矮仔占、矮腳南特、低腳烏尖、花龍水田谷及其衍生品種都是由一對隱性半矮桿基因sd1控制，同時還存在著不同程度的微效多基因的影響。

但是，矮稈基因利用單一和遺傳背景狹隘可能造成遺傳上的脆弱性，近幾年來國內(nèi)外新育成的許多矮稈品種產(chǎn)量潛力停滯不前也可能與此有關(guān)。而已鑒定出的許多半矮稈和矮稈基因不少都對水稻的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)負(fù)面的影響，限制了它們在雜交育種中的應(yīng)用。囚此，發(fā)掘和鑒定控制水稻株高的基因，開展株高基因定位、克隆及作用機(jī)理等方面的研究，實(shí)現(xiàn)對水稻株高的定向改良，具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價值。同時，水稻是研究禾本科植物的模式作物，水稻基因組的測序已完成，這為水稻基因的克隆及其功能提供了極為有利的條件。

研究人員從環(huán)境因素、生理生化及基因組學(xué)等多方面對植物矮化多分枝機(jī)制進(jìn)行了研究，并取得了很大的進(jìn)展。從不同的多分枝突變體中發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)控植物分枝的植物激素—獨(dú)腳金內(nèi)酯(Strigolactones)，它在植物根部產(chǎn)生并向上運(yùn)輸，從而抑制腋芽的發(fā)育和植物的分枝，對于控制植物株型具有重要的意義。獨(dú)腳金內(nèi)酯途徑基因的突變通常會導(dǎo)致植物分蘗或分枝數(shù)目的增加，同時伴有植株高度的降低。研究人員從矮化多分枝/分蘗突變體中克隆了多個突變基因，如從腋生分枝增多的擬南芥突變體中克隆了MAX1至MAX4基因，從多分枝的豌豆ramous(rms)突變體中克隆了RMS1至RMS5基因，從矮化多分蘗的水稻突變體dwarf/high tillering dwarf(htd)中克隆了D3、D10、D14/D88/HTD2、D17/HTD1、D27、D53、OsTB1/FC1等基因。從頂端優(yōu)勢削弱的矮牽牛dad(decreased apical dominance)突變體中克隆的DAD1至DAD3也位于獨(dú)腳金內(nèi)酯途徑中。

獨(dú)腳金內(nèi)酯的生物合成起源于類胡蘿卜素。在植物類胡蘿卜素合成過程中，八氫番茄紅素合成酶(PSY)的產(chǎn)物—15-順式-八氫番茄紅素，通過脫氫反應(yīng)和異構(gòu)反應(yīng)合成下游反應(yīng)需要的全反式-番茄紅素，被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化合成胡蘿卜素和葉黃素，作為某些激素的底物，如ABA和SL。在此途徑中，需要兩種異構(gòu)酶的參與，分別為15-順式-ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶(Z-ISO)和胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)。Z-ISO在此途徑中催化9,15,9'-3-順式-ζ-胡蘿卜素發(fā)生異構(gòu)反應(yīng)，形成9,9'-2-順式-ζ-胡蘿卜素，作為后續(xù)反應(yīng)的的底物。在本發(fā)明中，將Z-ISO命名為MIT1。該酶起源于NnrU基因，它編碼一個跨膜蛋白—亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶U(nitrite and nitric oxide reductase U，NnrU)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供水稻MIT1基因及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先提供了水稻MIT1蛋白，其具有：

1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供了編碼水稻MIT1蛋白的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或

3)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

本發(fā)明提供了含有編碼水稻MIT1蛋白的基因的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。

本發(fā)明提供了水稻MIT1蛋白或其編碼基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了水稻MIT1蛋白或其編碼基因在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了水稻MIT1蛋白或其編碼基因在提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種水稻MIT1基因突變基因，其為水稻MIT1基因第二內(nèi)含子3’末端的2個堿基AG和第三外顯子5’端的8個堿基GTCTACTT缺失，所述水稻MIT1基因含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。

本發(fā)明提供了上述突變基因或含有該突變基因的生物材料在農(nóng)作物改良育種、制種中的應(yīng)用。

所述的農(nóng)作物為水稻、玉米、小麥或棉花。

本發(fā)明提供了上述突變基因或含有該突變基因的生物材料在提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明提供了水稻MIT1基因(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)及其編碼的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)。將野生型MIT1基因組DNA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化mit1突變體的愈傷組織，發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的表型完全恢復(fù)正常，分蘗數(shù)和株高都和野生型一致，因而MIT1基因具有抑制水稻分蘗的功能，有望對水稻株型的形成進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而對株型定向設(shè)計，以提高水稻生產(chǎn)力，在水稻種質(zhì)資源改良中篩選效果明顯，經(jīng)濟(jì)價值巨大。

(2)因輻射誘變造成與野生型相比有10bp缺失，采用實(shí)驗室常用的瓊脂糖電泳就能開展分子檢測，即能夠?qū)崿F(xiàn)鑒別，不需要特別的檢測技術(shù)和方法。

附圖說明

圖1為野生型春江06與MIT1突變體mit1的表型。其中，A，B，C圖分別為野生型和mit1的幼苗期、分蘗期和成熟期的表型；D，E圖分別為插秧后野生型和mit1的株高和分蘗的動態(tài)變化。A圖比例尺為5cm，B，C圖比例尺為20cm。

圖2為野生型和mit1的產(chǎn)量相關(guān)性狀。A圖為各節(jié)間長度比較。比例尺為5cm。B圖為穗形。比例尺為5cm。C圖為粒形。D圖為成熟期株高。E圖為有效分蘗數(shù)。F圖為每穗粒數(shù)。G圖為百粒重。H圖為單株產(chǎn)量。

圖3為MIT1基因的圖位克隆和功能互補(bǔ)驗證。A圖為MIT1的圖位克隆。B圖為MIT1基因結(jié)構(gòu)及在突變體mit1中的突變位點(diǎn)。C圖為mit1突變體的互補(bǔ)驗證。B260-1和B260-2為兩個轉(zhuǎn)基因回補(bǔ)株系。比例尺為15cm。

圖4為MIT1的同源蛋白序列比對和進(jìn)化分析。A圖為水稻、玉米、擬南芥中的MIT1，ZmZ-ISO、AtZ-ISO的蛋白序列比對。B圖為MIT1的進(jìn)化分析。

圖5為MIT1組織表達(dá)模式。

圖6為水稻組織GUS染色結(jié)果。圖中，a莖，b莖節(jié)，c根，d穗，e葉片，f葉鞘，g側(cè)芽，h葉鞘橫切面，i穎殼橫切面，j根橫切面。a,f,g圖的比例尺為200μm，b,c,d,e圖的比例尺為100μm，h,I,j圖的比例尺為50μm。

圖7為MIT1蛋白的亞細(xì)胞定位。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。

實(shí)施例1突變體的獲得與表型分析

突變體mit1是經(jīng)⁶⁰Co-γ輻射誘變粳稻品種春江06得到(輻射劑量為200Gy，劑量率為10Gy·h^-1)，表型上它與野生型相比有著多方面的改變。突變體mit1表現(xiàn)為分蘗中度增多、株高半矮的表型，成熟期株高稍矮，約為野生型的80％，各節(jié)間等比例一定程度的縮短；分蘗數(shù)目增多，約為野生型的2倍(見圖1)；株型緊湊，分蘗角度和葉片角度??；插秧后的不同發(fā)育時期，mit1株高均低于野生型，分蘗均多于野生型(見圖2)。突變體mit1的育性結(jié)實(shí)正常，每穗粒數(shù)約為野生型70％，但單株總粒數(shù)及產(chǎn)量比野生型有所增加(見圖2)。

實(shí)施例2水稻MIT1基因的獲得和功能互補(bǔ)驗證

1、水稻MIT1基因的獲得

本發(fā)明的MIT1基因是采用圖位克隆方法通過突變體mit1克隆得到的。

經(jīng)⁶⁰Co-γ輻射誘變得到的突變體mit1經(jīng)過多代自交種植確認(rèn)該突變具有穩(wěn)定遺傳的特性。純合突變體mit1與正常表型的秈稻Dular，進(jìn)行雜交，所有雜交F₁中個體均矮化分蘗中度增多表型。在F₂種植群體中出現(xiàn)了明顯分離，通過調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)野生型與突變體的分離比例符合3:1遺傳分離比例。由此可以推測，該水稻矮化分蘗中度增多突變體的突變性狀是由1對隱性基因控制。

為了定位控制該分蘗中度增多突變體基因的位置，利用F1代自交構(gòu)建的F₂分離群體作為定位的群體，以BSA法選取l0株F₂突變單株構(gòu)建DNA混池，利用能較均勻覆蓋全基因組的170對Indel標(biāo)記對兩個親本與基因池進(jìn)行多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)與第12染色體上的R12-8和R12-10連鎖。為了精細(xì)定位目的基因，將F₂定位群體擴(kuò)大到1529株矮化分蘗中度增多個體，并開發(fā)了8對新的InDel標(biāo)記，最終將目的基因定位在標(biāo)記M4和M7之間(圖3的A圖)。這兩個標(biāo)記之間的物理距離為2Mb，位于第12染色體的著絲粒區(qū)，包含15個候選基因。根據(jù)各基因預(yù)測的蛋白功能，首先選擇功能與本研究相關(guān)的6個基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)基因LOC_Os12g21710發(fā)生突變。

LOC_Os12g21710基因組DNA全長2937bp，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼區(qū)全長1104bp，共設(shè)計8對引物進(jìn)行測序(引物序列見表1)。對基因測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，此基因在第二內(nèi)含子和第三外顯子交界處發(fā)生10bp的缺失，包括第二內(nèi)含子3’末端的2個堿基(ag)和第三外顯子5’端的8個堿基(GTCTACTT)(見圖3的B圖)。這10bp的缺失造成轉(zhuǎn)錄過程中第二內(nèi)含子沒有被拼接掉而被錯誤讀取以及第三外顯子讀取的提前終止，從而造成基因的突變。將該基因命名為MIT1。根據(jù)水稻基因組注釋網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)預(yù)測，MIT1編碼15-順式-ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶(15-cis-zeta-carotene isomerase，Z-ISO)，它是類胡蘿卜素生物合成過程中一個重要的異構(gòu)酶。

表1實(shí)施例1中涉及的引物序列

2、MIT1基因的功能互補(bǔ)驗證

本發(fā)明將MIT1基因克隆至植物表達(dá)載體pCAMBIA 1305.1(購自pCAMBIA公司)，并在大腸桿菌TOP10中擴(kuò)繁。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將pCAMBIA 1305.1攜帶的MIT1基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株。

12g21710基因組互補(bǔ)載體構(gòu)建：因為基因組DNA片段比較大，所以分成兩段擴(kuò)增，以PstI位點(diǎn)為界限。第一個片段，5’端引入SacI位點(diǎn)，3’端引入PstI位點(diǎn)，片段長為4625bp，ATG前長度為1834bp，重組到pCAMBIA1305.1的SacI+PstI位點(diǎn)中去；第二個片段，兩端都引入PstI位點(diǎn)，片段長度為1240bp，TGA后長度為1086bp，重組到含第一個片段的載體的PstI位點(diǎn)中去。所用引物為12g21710S1SPF：ATGATTACGAATTCGAGCTCCAGTGGACAAAGCTTACCAAACTG和12g21710S1SPR：CCAAGCTTGCATGCCTGCAGCAAAAGGAAAACACTTG；12g21710S2PPF：TGTTATTCCTTTTGCTGCAGTTATCGATGGAAGAC和12g21710S2PPR：CCAAGCTTGCATGCCTGCAGCCTGGCACTTCTGATATAGGG。

互補(bǔ)植株的表型完全恢復(fù)正常，分蘗數(shù)和株高都和野生型一致?；蚪MDNA的互補(bǔ)結(jié)果證明了LOC_Os12g21710就是目的基因(見圖3的C圖)。

實(shí)施例3 MIT1的同源蛋白序列比對和進(jìn)化分析

水稻Z-ISO(MIT1)、玉米Z-ISO(ZmZ-ISO)和擬南芥Z-ISO(AtZ-ISO)序列比對顯示同源性比較高。據(jù)水稻基因組注釋網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)預(yù)測，MTI1包含368個氨基酸，ChloroP 1.1Prediction Server預(yù)測該蛋白在N端有一個葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(方框部分)，整個蛋白含有5個跨膜區(qū)(下劃線部分)，還有一個NnrU結(jié)構(gòu)域(見圖4的A圖)。

Z-ISO為15-順式-ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶，是參與類胡蘿卜素生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一。進(jìn)化樹分析顯示，MTI1在高等植物和硅藻中都有同源基因，它們都有一個共同的起源—NnrU基因，該基因在反硝化細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，如根癌土壤桿菌(Agrobacterium fabrum str.C58)和苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti 1021)(見圖4的B圖)。NnrU編碼一個跨膜蛋白—亞硝酸鹽和一氧化氮還原酶U(nitrite and nitric oxide reductase U，NnrU)，最初在紅假單胞菌2.4.3中有描述，催化細(xì)菌反硝化作用。

實(shí)施例4水稻MIT1基因表達(dá)模式

提取粳稻品種日本晴不同組織(根、莖、葉片、葉鞘、側(cè)芽、花、穗)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行Real-time PCR(RT-PCR)檢測，以水稻Ubiquitin基因為內(nèi)參，檢測MIT1基因在水稻不同組織中的表達(dá)差異。

1、RNA提取

采用RNAprep pure Plant Kit(天根)進(jìn)行水稻總RNA的提取。用于分析基因組織表達(dá)模式的樣品取材于抽穗期的野生型的根、莖、葉片、葉鞘、側(cè)芽、幼穗等部位。

(1)100mg樣品經(jīng)液氮研磨后加入450μL裂解液，震蕩混勻。將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱中，12000rpm離心5min，收集管中上清至RNase-free的離心管中；

(2)加入1/2倍上清體積的無水乙醇，顛倒混勻后將溶液轉(zhuǎn)入吸附柱中，12000rpm離心1min，棄掉廢液；

(3)向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm離心1min，棄掉廢液；

(4)向吸附柱中央加入80μL DNaseⅠ工作液，室溫放置15min；

(5)向吸附柱中加入350μL去蛋白液，12000rpm離心1min，棄掉廢液；

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，棄掉廢液；

(7)重復(fù)步驟(6)，然后再12000rpm離心2min，棄掉廢液。將吸附柱置于一個新的RNase-free離心管中，室溫放置數(shù)分鐘；

(8)向吸附膜中央滴加30μL RNase-free ddH₂O，室溫放置5min，12000rpm離心2min，RNA保存于-80℃；

2、cDNA合成

第一鏈cDNAs合成采用III First Strand Synthesis Kit(Invitrogen,USA)，由于水稻基因GC含量較高，采用試劑盒推薦的高GC方法并且選用Oligo(dT)20(50μM)進(jìn)行合成。具體操作方法如下：

(1)RNA/primer mixture的準(zhǔn)備：1至5μg總RNA，1μL Oligo(dT)20(50μM)，2.5μL dNTP mix(10mM)，DEPC處理水補(bǔ)齊至25μL；

(2)將上述體系放入65℃孵環(huán)境下孵育5min后立即轉(zhuǎn)移至55℃；

(3)cDNA Synthesis Mix的準(zhǔn)備(25μL)：DEPC-treated water 3μL，10×RT buffer 5μL，10μL MgCl₂(25mM)，5μL DTT(0.1M)，RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor 1μL，SuperScript III RT 1μL，上述混勻后置于55℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)將RNA/primer mixture與cDNA Synthesis Mix輕輕混勻，置于55℃，50min后轉(zhuǎn)入85℃，5min終止反應(yīng)后冰上放置；

(5)最后加入1μL RNase H 37℃，20min，-20℃存儲備用。

3、實(shí)時定量RT-PCR

Real-time PCR實(shí)驗采用Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)試劑盒(寶生物)，在Applied Biosystems公司的7300HT Real-Time PCR儀上進(jìn)行。以水稻ubiquitin基因作為內(nèi)參。每個反應(yīng)做三次生物學(xué)重復(fù)，相對表達(dá)量計算方法參見2-△△CT法。Real-time PCR程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40個循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

Real-time PCR反應(yīng)體系如下：

結(jié)果表明，MIT1在葉鞘中表達(dá)量高，其次是側(cè)芽、根和花，在莖和穗中表達(dá)量較低(見圖5)。

實(shí)施例5水稻組織GUS染色結(jié)果

12g21710Prom::GUS載體構(gòu)建：MIT1啟動子區(qū)通過PCR擴(kuò)增獲得，在5’端引入BamHI位點(diǎn)，3’端引入NcoI位點(diǎn),片段長為2460bp，為翻譯水平融合，包含前7個氨基酸在內(nèi)。重組到pCAMBIA1305.1的BamHI和NcoI位點(diǎn)中去。所用引物為12g21710PromBNF:CGGTACCCGGGGATCCGGAGAACCTGTCTGCACATTC，12g21710Prom BNG:CTCAGATCTACCATGGGGAGGA GAGATGGGAGGCCAT。利用農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷的方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，用于分析基因組織表達(dá)模式。

利用GUS(β-glucuronidase)基因作為報告基因，檢測了MIT1基因表達(dá)的空間分布情況。MIT1表達(dá)模式與RT-PCR結(jié)果一致，在莖、節(jié)、根、穎殼、葉片和葉鞘中均能檢測到GUS活性。在莖、穎殼和葉鞘中GUS活性較強(qiáng)(見圖6)。

實(shí)施例6 MIT1蛋白的亞細(xì)胞定位

35S::MIT1-GFP載體構(gòu)建：以水稻日本晴cDNA為模板擴(kuò)增MIT1的全長編碼區(qū)，片段長1104bp，片段5'和3'端分別引入酶切位點(diǎn)。用相應(yīng)的高保真內(nèi)切酶酶切空載體pAN580成線性載體，應(yīng)用In-Fusion高保真克隆試劑盒說明書連接載體和片段，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。PCR檢測獲得陽性克隆，菌液送公司測序正確后備用。所用引物為：12g21710GFPF：AGCCCAGATCAACTAGTATGGCCTCCCATCTCCTCCTC，12g21710GFPR：TTGCTCACCATGGATCCCCAAGGGAGTTGGTAGCTGGA。

瓊脂糖凝膠檢測，膠回收試劑盒(GenStar)回收目的片段；

(1)獲得目的片段：PCR擴(kuò)增

(2)載體準(zhǔn)備：所使用的內(nèi)切酶是NEB的。

37℃，酶切3h。瓊脂糖凝膠檢測，膠回收試劑盒(GenStar)回收目標(biāo)載體。

50℃連接，15min。冰上放置2min。向其中加入50μL的感受態(tài)細(xì)胞，比那個上放置30min.

(4)轉(zhuǎn)化：將上述混好的體系，42℃，熱擊45s。冰上放置2min。

加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，搖培45min-1h。

(5)涂板，平板倒置，37℃培養(yǎng)14-16h。

(6)挑單克隆，測序檢測正確的保菌保存，提質(zhì)粒保存。

為了闡述MIT1的亞細(xì)胞定位情況，利用綠色熒光蛋白(GFP)作為標(biāo)簽，構(gòu)建了35S::MIT1-GFP載體，將其轉(zhuǎn)入到野生型的原生質(zhì)體內(nèi)，觀察融合蛋白MIT1:GFP的瞬時表達(dá)，并以35S::GFP的瞬時表達(dá)作為對照。結(jié)果顯示由35S啟動子啟動的GFP蛋白在在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，而MIT1:GFP蛋白只在葉綠體里表達(dá)(見圖7)。所以，蛋白MIT1定位在葉綠體上。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。