本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法，尤其涉及一種以D-果糖低成本生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法，屬功能糖制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

稀有糖是一類(lèi)重要的碳水化合物，在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮著非常重要的功能。根據(jù)國(guó)際糖協(xié)會(huì)定義，稀有糖是“在自然界存在但含量極少的一類(lèi)單糖及其衍生物”，一般具有低熱量、低吸收等特點(diǎn)，并且具有多種生理功能。D-阿洛酮糖的能值為0.007kcal/g，被稱為無(wú)能量的甜味劑；可抑制腸道α-葡萄糖苷酶活性，防止血糖升高，作為Ⅱ型糖尿病人的輔助治療劑；可減小脂肪合成酶活性，抑制腹腔內(nèi)脂肪堆積，降低血脂，并可預(yù)防肥胖；對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用。鑒于D-阿洛酮糖良好的性質(zhì)，美國(guó)食品及藥品管理局于2011年對(duì)D-阿洛酮糖的安全性進(jìn)行確認(rèn)，并正式批準(zhǔn)其為GRAS食品，允許應(yīng)用于食品和膳食補(bǔ)充劑以及醫(yī)藥制劑中，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景極為廣闊，是近年來(lái)功能糖研究熱點(diǎn)之一。

由于D-阿洛酮糖極為稀有，科學(xué)家嘗試生物轉(zhuǎn)化法合成D-阿洛酮糖。已報(bào)道的有以果糖為底物用D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶或D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶合成D-阿洛酮糖。日本學(xué)者還以蒜糖醇為底物生物合成D-阿洛酮糖，但蒜糖醇價(jià)格高，該途徑不具備工業(yè)價(jià)值。阿洛酮糖在自然界中的含量極少，不易從自然界中提取，并且化學(xué)合成的方法副產(chǎn)物多、不易純化；而生物催化法的研究目前主要停留在實(shí)驗(yàn)室水平，尚無(wú)大規(guī)模生產(chǎn)的報(bào)道。

由于生產(chǎn)阿洛酮糖的底物果糖或葡萄糖與阿洛酮糖的性質(zhì)及其接近，使得后期阿洛酮糖的分離純化極為困難。這些原因?qū)е掳⒙逋堑氖袌?chǎng)價(jià)格昂貴，阿洛酮糖約4000元/g，目前的產(chǎn)量?jī)H能滿足科研需求，多作為試劑銷(xiāo)售。雖然阿洛酮糖的市場(chǎng)需求日益增加，但高昂的價(jià)格限制了它們的市場(chǎng)規(guī)模和應(yīng)用。因此，大幅降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)變得極其重要。現(xiàn)階段，D-阿洛酮糖的主要分離方法是色譜法，此方法對(duì)分離設(shè)備、分離柱均有較高的要求，并且成本很高，不利于放大生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；Ｒ虼?，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單有效的分離方法在阿洛酮糖實(shí)現(xiàn)工業(yè)化方面變得極為重要。

經(jīng)檢索，有關(guān)利用固體葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖氧化酶去除殘余果糖實(shí)現(xiàn)獲得含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡(jiǎn)單、有效、低成本、純生物法大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法。

本發(fā)明所述低成本生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法，步驟是：

(1)以蒸餾水或pH為8.0的10mM的磷酸鹽緩沖液配制終濃度為500±50g/L的果糖溶液；

(2)以固體D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶為催化劑，按每100mL果糖溶液中添加50±5g催化劑的比例向果糖溶液中加入所述催化劑，在65±3℃反應(yīng)5±2h后分離除去催化劑，得到含D-阿洛酮糖和D-果糖的轉(zhuǎn)化液；

(3)聯(lián)合利用酶使轉(zhuǎn)化液中的D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，再用離子交換樹(shù)脂吸附除去葡萄糖酸，并循環(huán)重復(fù)此操作，得到含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液；

其中：

所述聯(lián)合利用酶使轉(zhuǎn)化液中的D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，再用離子交換樹(shù)脂吸附除去葡萄糖酸，并循環(huán)重復(fù)此操作的方法是：

①按每100mL轉(zhuǎn)化液中添加50±5g固體酶的比例向轉(zhuǎn)化液中加入固體葡萄糖異構(gòu)酶，在65±5℃反應(yīng)5±2h實(shí)現(xiàn)將轉(zhuǎn)化液中部分D-果糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖，然后分離去除固體葡萄糖異構(gòu)酶，得到含D-果糖、D-葡萄糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

②再按每100mL混合液中添加50±5g固體酶的比例向步驟①制備的混合液中加入固體葡萄糖氧化酶，在39±3℃反應(yīng)3±2h實(shí)現(xiàn)將混合液中全部的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，然后分離去除固體葡萄糖氧化酶，得到含D-果糖、葡萄糖酸和D-阿洛酮糖的混合溶液；

③按每100mL混合液中添加100±10g堿性陰離子交換樹(shù)脂的比例向步驟②制備的混合溶液中加入堿性陰離子交換樹(shù)脂，在25±3℃，120rpm條件下吸附40±10min，利用樹(shù)脂吸附除去混合溶液中的葡萄糖酸，得到含D-果糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

④將步驟③得到的混合溶液再次按步驟①②③所述方法進(jìn)行重復(fù)操作，10±3個(gè)循環(huán)后混合溶液中的大部分D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并利用樹(shù)脂吸附方式將其去除，即得到了含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液。

將含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液結(jié)晶(降溫結(jié)晶法)的方法是：利用真空干燥的方法干燥，得到飽和的阿洛酮糖糖溶液，將糖溶液加熱至65℃后，以1:8(v:v)的比例向糖溶液中加入丙酮溶液，然后加入D-阿洛酮糖晶種，以4℃/min的速度降溫，降至4℃，即可得到阿洛酮糖的結(jié)晶體。

上述低成本生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法中，所使用的固體葡萄糖氧化酶的制備方法是：

㈠氨基化樹(shù)脂EA的預(yù)處理，利用pH值為5.2的0.1M的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液將氨基化樹(shù)脂浸泡活化5h；

㈡將步驟㈠制備的樹(shù)脂浸漬于3％的戊二醛溶液中，在25℃下，以120rpm速度攪拌，交聯(lián)處理5h，得到戊二醛交聯(lián)的樹(shù)脂；

㈢用蒸餾水洗滌步驟㈡制備的戊二醛交聯(lián)的樹(shù)脂，洗滌3次，以洗去殘留的戊二醛溶液，得到改性樹(shù)脂；

㈣以每1g樹(shù)脂加入1mL液體酶的比例，將步驟㈢制備的改性樹(shù)脂與葡萄糖氧化酶液體混合，4℃，120rpm固定化10h，得到固定化的樹(shù)脂；

㈤利用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液洗滌步驟㈣制備的固定化的樹(shù)脂3次，完全去除游離的酶液，即得到固體葡萄糖氧化酶。

制得的固體葡萄糖氧化酶4℃保存，備用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述低成本生產(chǎn)D-阿洛酮糖優(yōu)選的實(shí)施方式是：

(1)以蒸餾水或pH為8.0的10mM的磷酸鹽緩沖液配制終濃度為500g/L的果糖溶液；

(2)以固體D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶為催化劑，按每100mL果糖溶液中添加45g催化劑的比例向果糖溶液中加入所述催化劑，在65℃反應(yīng)5h后分離除去催化劑，得到含D-阿洛酮糖和D-果糖的轉(zhuǎn)化液；

(3)按每100mL轉(zhuǎn)化液中添加50g固體酶的比例向轉(zhuǎn)化液中加入固體葡萄糖異構(gòu)酶，在65℃反應(yīng)5h實(shí)現(xiàn)將轉(zhuǎn)化液中部分D-果糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖，然后分離去除固體葡萄糖異構(gòu)酶，得到含D-果糖、D-葡萄糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(4)再按每100mL混合液中添加50g固體酶的比例向步驟(3)制備的混合液中加入固體葡萄糖氧化酶，在39℃反應(yīng)3h實(shí)現(xiàn)將混合液中全部的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，然后分離去除固體葡萄糖氧化酶，得到含D-果糖、葡萄糖酸和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(5)按每100mL混合液中添加100g堿性陰離子交換樹(shù)脂的比例向步驟(4)制備的混合溶液中加入堿性陰離子交換樹(shù)脂，在25℃，120rpm條件下吸附30min，利用樹(shù)脂吸附除去混合溶液中的葡萄糖酸，得到含D-果糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(6)將步驟(5)得到的混合溶液再次按步驟(3)(4)(5)所述方法進(jìn)行重復(fù)操作，11個(gè)循環(huán)后混合溶液中的大部分D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并利用樹(shù)脂吸附方式將其去除，即得到了含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液；

(7)轉(zhuǎn)化液利用真空干燥的方法干燥，得到飽和的阿洛酮糖糖溶液，將糖溶液加熱至65℃后，以體積比1:8的比例加入丙酮溶液，然后加入D-阿洛酮糖晶種，以4℃/min的速度降溫，降至4℃，即可得到阿洛酮糖的結(jié)晶體。

上述低成本生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法中：所述堿性陰離子交換樹(shù)脂優(yōu)選是大孔苯乙烯系弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D309。

上述低成本生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法中：對(duì)于吸附了葡萄糖酸的堿性陰離子交換樹(shù)脂，按每100g樹(shù)脂添加50mL 0.5mol/L的鹽酸的比例加入鹽酸，常溫解吸30min，即可得到葡萄糖酸溶液。

本發(fā)明方法生產(chǎn)的D-阿洛酮糖的分析方法為高效液相色譜法，所用儀器為日本島津液相色譜儀，檢測(cè)器為色差檢測(cè)器，分析柱為Carbomix Pb-NP10:8％(7.8×300mm)，柱溫78℃，流動(dòng)相為ddH2O，流速為0.5mL/min。

本發(fā)明利用酶專一性強(qiáng)，不產(chǎn)生副產(chǎn)物的特點(diǎn)進(jìn)行果糖與阿洛酮糖的分離，首先使用固體D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶將D-果糖轉(zhuǎn)換化為D-阿洛酮糖，然后，聯(lián)合利用固體葡萄糖異構(gòu)酶與固體葡萄糖氧化酶使轉(zhuǎn)化液中的D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，再用離子交換樹(shù)脂吸附除去葡萄糖酸，并循環(huán)重復(fù)此操作，得到含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液，此方法操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)施。

本發(fā)明所用的酶制劑均為固體酶，可重復(fù)使用多次，大大降低了成本，此外，葡萄糖酸的獲得在另一方面又進(jìn)一步降低了D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本?？傊谏鲜黾夹g(shù)方案，本發(fā)明提供了一種成本低、易操做、效率高的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)方法，有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是固體酶催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的反應(yīng)平衡圖。

圖2是葡萄糖酸吸附效果分析圖；

其中：1為吸附前；2為吸附后。

圖3是D-果糖除去前后高效液相分析比較圖；

其中：3為果糖除去前后含量對(duì)比圖，4為阿洛酮糖處理前后含量對(duì)比圖，5為阿洛酮糖標(biāo)樣。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1固體葡萄糖氧化酶的制備方法

(1)氨基化樹(shù)脂EA的預(yù)處理，利用pH值為5.2的0.1M的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液將氨基化樹(shù)脂浸泡活化5h；

(2)將步驟(1)制備的樹(shù)脂浸漬于3％的戊二醛溶液中，在25℃下，以120rpm速度攪拌，交聯(lián)處理5h，得到戊二醛交聯(lián)的樹(shù)脂；

(3)用蒸餾水洗滌步驟(2)制備的戊二醛交聯(lián)的樹(shù)脂，洗滌3次，以洗去殘留的戊二醛溶液，得到改性樹(shù)脂；

(4)以每1g樹(shù)脂加入1mL液體酶的比例，將步驟(3)制備的改性樹(shù)脂與葡萄糖氧化酶液體混合，4℃，120rpm固定化10h，得到固定化的樹(shù)脂；

(5)利用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液洗滌步驟(4)制備的固定化的樹(shù)脂3次，完全去除游離的酶液，即得到固體葡萄糖氧化酶。

制備的固體酶4℃保存，備用。

實(shí)施例2含高濃度D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化液的制備方法

(1)以蒸餾水配制終濃度為400g/L的果糖溶液；

(2)以固體D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶為催化劑，按每100mL果糖溶液中添加45g催化劑的比例向果糖溶液中加入所述催化劑，在62℃反應(yīng)7h后分離除去催化劑，得到含D-阿洛酮糖和D-果糖的轉(zhuǎn)化液，在平衡反應(yīng)過(guò)程中每隔1h取樣200μL，加入DDH₂O稀釋5倍至1mL，10000rpm離心10min，過(guò)膜除去蛋白后進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖1所示；

(3)按每100mL轉(zhuǎn)化液中添加45g固體酶的比例向轉(zhuǎn)化液中加入固體葡萄糖異構(gòu)酶，在60℃反應(yīng)7h實(shí)現(xiàn)將轉(zhuǎn)化液中部分D-果糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖，然后分離去除固體葡萄糖異構(gòu)酶，得到含D-果糖、D-葡萄糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(4)再按每100mL混合液中添加45g固體酶的比例向步驟(3)制備的混合液中加入固體葡萄糖氧化酶，在42℃反應(yīng)1h實(shí)現(xiàn)將混合液中全部的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，然后分離去除固體葡萄糖氧化酶，得到含D-果糖、葡萄糖酸和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(5)大孔苯乙烯系弱堿性陰離子交換樹(shù)脂的處理：處理方法參考GB5476-85中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)離子交換樹(shù)脂預(yù)處理方法；

①將樹(shù)脂裝入內(nèi)徑為3cm的層析柱中，柱床高度為30cm，用純水進(jìn)行反復(fù)沖洗，直至試樣中無(wú)可見(jiàn)機(jī)械雜質(zhì)并出水澄清為止；

②依次用100mL 1N鹽酸溶液、200mL純水、100mL1N氫氧化鈉溶液和200mL純水，自上而下通過(guò)樹(shù)脂層，試劑流量為2.0mL/min，純水流量為10mL/min，在每次轉(zhuǎn)換試劑時(shí)，使液面高出樹(shù)脂層1cm，保證樹(shù)脂層中無(wú)氣泡；此操作進(jìn)行2次；

③經(jīng)②處理過(guò)的樹(shù)脂用400mL1N氫氧化鈉溶液通過(guò)樹(shù)脂層，流量為10mL/min，然后用純水洗滌，直至用酚酞指示液檢驗(yàn)流出液為無(wú)色時(shí)停止洗滌；

(6)按每100mL混合液中添加90g堿性陰離子交換樹(shù)脂的比例向步驟(4)制備的混合溶液中加入堿性陰離子交換樹(shù)脂(D309)，在22℃，120rpm條件下吸附50min，利用樹(shù)脂吸附除去混合溶液中的葡萄糖酸，得到含D-果糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；葡萄糖酸的檢測(cè)使用高效液相色譜，紫外檢測(cè)器，C18分析柱，如圖2所示；

(7)將步驟(6)得到的混合溶液再次按步驟(3)(4)(6)所述方法進(jìn)行重復(fù)操作，13個(gè)循環(huán)后混合溶液中的大部分D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并利用樹(shù)脂吸附方式將其去除，即得到了含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液。結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例3含高濃度D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化液的制備方法

(1)以pH為8.0的10mM的磷酸鹽緩沖液配制終濃度為550g/L的果糖溶液；

(2)以固體D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶為催化劑，按每100mL果糖溶液中添加55g催化劑的比例向果糖溶液中加入所述催化劑，在68℃反應(yīng)5h后分離除去催化劑，得到含D-阿洛酮糖和D-果糖的轉(zhuǎn)化液；

(3)按每100mL轉(zhuǎn)化液中添加55g固體酶的比例向轉(zhuǎn)化液中加入固體葡萄糖異構(gòu)酶，在70℃反應(yīng)3h實(shí)現(xiàn)將轉(zhuǎn)化液中部分D-果糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖，然后分離去除固體葡萄糖異構(gòu)酶，得到含D-果糖、D-葡萄糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(4)再按每100mL混合液中添加55g固體酶的比例向步驟(3)制備的混合液中加入固體葡萄糖氧化酶，在36℃反應(yīng)5h實(shí)現(xiàn)將混合液中全部的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，然后分離去除固體葡萄糖氧化酶，得到含D-果糖、葡萄糖酸和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(5)按每100mL混合液中添加90g堿性陰離子交換樹(shù)脂的比例向步驟(4)制備的混合溶液中加入堿性陰離子交換樹(shù)脂，在28℃，120rpm條件下吸附30min，利用樹(shù)脂吸附除去混合溶液中的葡萄糖酸，得到含D-果糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(6)將步驟(5)得到的混合溶液再次按步驟(3)(4)(5)所述方法進(jìn)行重復(fù)操作，7個(gè)循環(huán)后混合溶液中的大部分D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并利用樹(shù)脂吸附方式將其去除，即得到了含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液。

實(shí)施例4含高濃度D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化液的制備方法

(1)以pH為8.0的10mM的磷酸鹽緩沖液配制終濃度為500g/L的果糖溶液；

(2)以固體D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶為催化劑，按每100mL果糖溶液中添加45g催化劑的比例向果糖溶液中加入所述催化劑，在65℃反應(yīng)5h后分離除去催化劑，得到含D-阿洛酮糖和D-果糖的轉(zhuǎn)化液；

(3)按每100mL轉(zhuǎn)化液中添加50g固體酶的比例向轉(zhuǎn)化液中加入固體葡萄糖異構(gòu)酶，在65℃反應(yīng)5h實(shí)現(xiàn)將轉(zhuǎn)化液中部分D-果糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖，然后分離去除固體葡萄糖異構(gòu)酶，得到含D-果糖、D-葡萄糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(4)再按每100mL混合液中添加50g固體酶的比例向步驟(3)制備的混合液中加入固體葡萄糖氧化酶，在39℃反應(yīng)3h實(shí)現(xiàn)將混合液中全部的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，然后分離去除固體葡萄糖氧化酶，得到含D-果糖、葡萄糖酸和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(5)按每100mL混合液中添加100g堿性陰離子交換樹(shù)脂的比例向步驟(4)制備的混合溶液中加入堿性陰離子交換樹(shù)脂，在25℃，120rpm條件下吸附30min，利用樹(shù)脂吸附除去混合溶液中的葡萄糖酸，得到含D-果糖和D-阿洛酮糖的混合溶液；

(6)將步驟(5)得到的混合溶液再次按步驟(3)(4)(5)所述方法進(jìn)行重復(fù)操作，11個(gè)循環(huán)后混合溶液中的大部分D-果糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并利用樹(shù)脂吸附方式將其去除，即得到了含高濃度D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化液。

實(shí)施例5阿洛酮糖的結(jié)晶

經(jīng)過(guò)實(shí)施例2處理得到的含高濃度D-阿洛酮糖的溶液，使用降溫法結(jié)晶得到D-阿洛酮糖結(jié)晶體。具體實(shí)施方式如下：

將實(shí)施例2得到的糖液利用真空干燥的方法干燥得到飽和的阿洛酮糖糖溶液，將糖液加熱至65℃后，以體積比1：4的比例加入丙酮溶液，然后加入阿洛酮糖晶種，以4℃/min的速度降溫，降至4℃，得到阿洛酮糖的結(jié)晶體。

實(shí)施例6葡萄糖酸的解吸

對(duì)于吸附了葡萄糖酸的堿性陰離子交換樹(shù)脂(例如實(shí)施例2中得到的吸附有葡萄糖酸的堿性陰離子交換樹(shù)脂)，按每100g樹(shù)脂添加50mL 0.5mol/L的鹽酸的比例加入鹽酸，常溫解吸30min，即可得到葡萄糖酸溶液。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)循環(huán)處理的轉(zhuǎn)化液果糖的去除率可達(dá)到90％以上。綜上，本發(fā)明方法成本較低，得到的阿洛酮糖成本可降低至近40元/g，遠(yuǎn)低于市場(chǎng)上阿洛酮糖的生產(chǎn)成本，并且此法易于操作，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。