本發(fā)明涉及一種香蕉炭疽病菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于香蕉炭疽病菌的快速分子檢測，同時可實現(xiàn)田間香蕉炭疽病菌的潛伏侵染期的診斷和病菌的監(jiān)測鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測和生物技術領域。

背景技術：

香蕉是世界著名的熱帶、亞熱帶水果，其特點是:高熱量、低脂肪，富含人體所必須的碳水化合物、蛋白質、礦物質等，其中K的含量為水果之最。世界上有50多個國家生產(chǎn)香蕉，年產(chǎn)銷量達4千多萬噸，中國年產(chǎn)量在150-190萬噸。

香蕉炭疽病(Anthracnose)是一種嚴重的世界性病害，由芭蕉炭疽菌(Colletotrich mmusae)侵染引起，可為害香蕉植株的地上各部位，以為害果實最重要，葉片上病斑長橢圓形或不規(guī)則形，大小不等，邊緣褐色稍深，分生孢子盤為黑色小粒狀，香蕉生長后期小黑點布滿葉片；為害青果時，病斑長橢圓形，黑褐色，上生許多小黑點，為害成熟果實時，黑褐色，有時有圓心輪紋，常中央縱列；為害果柄常引起落果。果實一旦發(fā)病，擴展迅速，表現(xiàn)為果皮褐變，果肉逐漸腐爛，嚴重影響果品價值，不數(shù)日便全果爛掉，我國香蕉采后病害以炭疽病發(fā)生最普遍，給生產(chǎn)、貯運及銷售造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重影響著我國香蕉的北運和出口。

香蕉炭疽病菌侵染香蕉果實有一個重要的特性，即潛伏侵染特性，目前以癥狀為基礎的病害常規(guī)診斷技術，需要采用柯赫氏法則經(jīng)過病原菌分離培養(yǎng)、病原菌鑒定、接菌、癥狀分析等步驟，耗時長、效率低、準確性差，難以做到病害發(fā)生時及時檢測和有效控制病原菌的傳播和病害流行，而香蕉炭疽菌潛伏侵染特性使得人們無法通過癥狀來診斷香蕉果實是否染病及染病的程度，迫切需要一種快速、準確的分子檢測方法。

近年來，分子生物學技術發(fā)展迅速，隨著分子生物學技術在植物病理學科不斷發(fā)展和應用，一些分子標記技術為植物病原菌的診斷檢測提供了新的途徑，分子生物技術的應用使重要病原真菌的檢測、診斷與鑒定上升到新的水平，而實際應用層面及輔助分類鑒定診斷與檢測為植物病理學做出了重要貢獻。其中PCR（polymerase chain reaction）技術以特異性強、靈敏度高、方便快捷等特點被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點，設計特異性引物進行PCR，對病原菌進行快速檢測和鑒定的技術已受到廣泛的應用，國內(nèi)外研究人員已成功開發(fā)出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘潰瘍病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方銹病菌等多種病原菌的特異性引物和檢測方法，實現(xiàn)了快速、靈敏和準確的鑒定。但目前有關香蕉炭疽病菌快速分子檢測的研究尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中對香蕉炭疽病的檢測主要基于癥狀特征，香蕉炭疽病菌鑒定主要基于病原形態(tài)學特征，程序繁瑣、耗死長、對鑒定經(jīng)驗要求高、準確度低，難以診斷具有潛伏侵染特性的香蕉炭疽病的問題，提供了一種香蕉炭疽病菌分子檢測引物及其檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術方案：

本發(fā)明首先提供了一種香蕉炭疽病菌分子檢測引物，其核苷酸序列為：

上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’；

下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’。

所述引物BCMF和BCMR對香蕉炭疽病菌特異性擴增出406bp的產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種香蕉炭疽病菌的快速檢測方法，包括以下步驟：

(1)從香蕉葉片或香蕉果皮中提取DNA；

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；用于檢測香蕉植株組織是否存在香蕉炭疽病菌時，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA；

(2) 以提取香蕉葉片或香蕉果皮DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出406bp的產(chǎn)物，則可判定所述的香蕉葉片或香蕉果皮中存在香蕉炭疽病菌，否則所述的香蕉葉片或香蕉果皮中不存在香蕉炭疽病菌。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）準確性高：本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點設計對香蕉炭疽病菌具有特異擴增作用的PCR 引物。已經(jīng)對不同地理來源的香蕉炭疽病菌、攜帶香蕉炭疽病菌的葉片、攜帶香蕉炭疽病菌的果實和健康的香蕉組織進行了檢測驗證，只有香蕉炭疽病菌和攜帶該病菌的組織中能特異性地擴增出一條406 bp 的電泳條帶，說明本發(fā)明所設計的引物用于檢測香蕉炭疽病菌準確可靠；

（2）特異性強：本發(fā)明所設計的引物對香蕉炭疽病菌具有很強的特異性，能夠用于區(qū)別香蕉炭疽病菌(Colletotrich mmusae)、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)等香蕉上常見的病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在香蕉上癥狀特征相似的病害；

（3）靈敏度高：本發(fā)明將設計的特異引物與ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）聯(lián)合起來進行巢式PCR 擴增后，對香蕉炭疽病菌的檢測靈敏度在DNA 水平上可達到1fg；

（4）適用性廣、實用性好：本發(fā)明的香蕉炭疽病菌的檢測方法，不僅能對病菌菌絲體進行檢測，也能對感病的香蕉組織進行檢測，可實現(xiàn)香蕉炭疽病菌的潛伏侵染期檢測，即在病害顯癥前進行檢測，防治采后香蕉炭疽病的爆發(fā)流行。

（5）、操作簡便快速：本發(fā)明只需進行DNA 提取、PCR 擴增和瓊脂糖電泳后即可判定結果，一般整個檢測過程可在數(shù)小時內(nèi)完成，操作簡便快捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對香蕉炭疽病菌特異性擴增電泳圖：其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3為香蕉炭疽病菌，泳道4-10分別為：香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)陰性對照。

圖2為本發(fā)明引物香蕉炭疽病菌的靈敏性檢測擴增電泳圖：A：普通PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、陰性對照、陽性對照；B為巢式PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-13分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、陰性對照、陽性對照。

圖3為本發(fā)明香蕉葉片和果實中炭疽病菌檢測擴增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-10分別為自然發(fā)病的香蕉葉片、自然發(fā)病的香蕉果實、人工接種發(fā)病的香蕉果實、人工接種潛伏期的香蕉果實、健康香蕉葉片、健康的香蕉果實、健康香蕉果柄、陰性對照、陽性對照。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術方案做進一步的說明。

下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1 分子檢測引物設計及香蕉炭疽病菌特異分子檢測方法的建立

1.香蕉炭疽病菌基因組DNA的提?。?/p>

采用 CTAB 法提取本實驗室保存的5株香蕉炭疽病菌的基因組 DNA，具體步驟如下：

(1)取0.1 g菌絲粉于1.5 mL 離心管中，加入900 μL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；

(2)取上清液700μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（各體積比為25:24:1），溫和搖動，室溫條件下，8000 r/min離心10min ；

(3)取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心10min；

(4)取上清液350 μL，加入1/10 體積3 mol/L NaAc 和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃條件下，8000 r/min離心5 min ；

(5)棄去上清液，加入700μL 體積濃度為70%冰乙醇，輕搖10sec，4℃條件下，8000 r/min離心10sec，晾干，加入50 μL TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.香蕉炭疽病菌ITS序列測定：

以真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為引物對提取香蕉炭疽病菌的DNA 進行PCR 擴增，擴增反應體系和反應程序為：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。

3.香蕉炭疽病菌特異分子檢測引物的設計：

根據(jù)香蕉炭疽病菌核糖體內(nèi)轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測序得到的5株香蕉炭疽病菌的ITS 序列與GenBank 中Colletotrichum屬不同種的ITS序列、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae) ITS序列、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae) ITS序列、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae) ITS序列、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum) ITS序列、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum) ITS序列、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae) ITS序列進行同源性分析和差異位點比較，用Primer Primer5軟件設計了對香蕉炭疽病菌具有特異性擴增作用的一對PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’；

下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’

4.香蕉炭疽病菌快速分子檢測方法的建立：

(1)從香蕉葉片或香蕉果皮中提取DNA:

①用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA;

②用于檢測香蕉植株組織是否存在香蕉炭疽病菌時，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA，具體步驟如下：

a.稱取待檢測的植物組織0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30 μL，將組織充分磨碎成糊；

b.將糊狀組織轉入1.5 mL 離心管中，12000r/min 離心6 min，取上清液5 μL ；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，取1.0μL 作為PCR 模板進行擴增；

(2) 以提取香蕉葉片或香蕉果皮DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出406bp的產(chǎn)物，則可判定所述的香蕉葉片或香蕉果皮中存在香蕉炭疽病菌，否則所述的香蕉葉片或香蕉果皮中不存在香蕉炭疽病菌。

實施例2 香蕉炭疽病菌特異性擴增

1.采用CTAB 法提取2株香蕉炭疽病菌、香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)的基因組DNA。

2. 以提取供試菌的DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

3.特異性擴增結果

如圖1所示，2株香蕉炭疽病菌可以特異性擴增出406bp的條帶，而香蕉焦腐病菌 (Botryodiplodia theobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorpora oryzae)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum)、香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)、輪枝菌冠腐病菌(Verticillium theobromae)和陰性對照均無擴增條帶，表明本發(fā)明的分子檢測引物可以將香蕉炭疽病菌與其他病原菌區(qū)分開來，具有很強的特異性，本發(fā)明的檢測方法可用于香蕉炭疽病菌的特異性擴增。

實施例3本發(fā)明引物對香蕉炭疽病菌的靈敏性檢測

1.采用CTAB 法提取香蕉炭疽病菌的基因組DNA；

2.將提取的香蕉炭疽病菌的基因組DNA，經(jīng)分光光度計測定濃度后，用無菌超純水稀釋，配制成系列濃度，備用；

3. 以配制的成系列濃度DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

4. 以配制的成系列濃度DNA為模板進行巢式PCR擴增：

（1）第一輪PCR 擴增：以真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 為外引物對配制的成系列濃度DNA 進行第一輪PCR 擴增，擴增反應體系和反應程序為：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

（2）第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增的產(chǎn)物為模板，以BCMF/BCMR為引物進行第二輪PCR擴增，PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

5.檢測結果

如圖2所示，以本發(fā)明引物BCMF/BCMR為引物進行常規(guī)PCR時，在25μL反應體系中，10pg的香蕉炭疽病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達到10pg（圖2-A）；而進一步以真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為外引物擴增的產(chǎn)物為模板，以本發(fā)明引物BCMF/BCMR為引物進行第二輪擴增時，在25μL反應體系中，1fg的香蕉炭疽病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達到1fg(圖2-B)。

實施例4香蕉植株中香蕉炭疽病菌的檢測

1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA。

2. 以配制的成系列濃度DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增：PCR反應體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

3. 檢測結果

如圖3所示，自然發(fā)病的香蕉葉片、自然發(fā)病香蕉果實、人工接種發(fā)病的香蕉葉片、人工接種處于侵染期的香蕉果實、陽性對照中均可產(chǎn)生406bp左右的可視條帶，而健康香蕉葉片、健康的香蕉果實、健康香蕉果柄、陰性對照均無任何條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明引物和檢測方法還可用于田間香蕉植株中香蕉炭疽病菌的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所

<120> 一種香蕉炭疽病菌分子檢測引物及檢測方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ataactgttg cttcggcggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccagtgcga gacgtaaagt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggga acctgcgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20