本發(fā)明涉及一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于香蕉黑星病菌的快速分子檢測，同時可實現(xiàn)田間香蕉黑星病菌的早期診斷和病菌的監(jiān)測鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測和生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

香蕉是世界上產(chǎn)量最大的水果作物，也是世界著名的熱帶、亞熱帶水果，。也是中國熱帶亞熱帶的主要水果，香蕉其具有獨特的品味和較高的營養(yǎng)價值，歷來堪稱一種上乘的保健果品。中國是世界香蕉主產(chǎn)國之一，具有悠久的栽培歷史，也是世界的香蕉種植生產(chǎn)大國之一，香蕉的栽培面積和產(chǎn)量居全國水果的第四位。

香蕉黑星病又稱黑痣病、雀斑病，可為害香蕉葉片、果柄和果實，在我國各香蕉種植區(qū)普遍存在。發(fā)病時葉片及中脈產(chǎn)生許多散生或群生的突起小黑斑，直徑約l mm，其周緣淡褐色，中部稍下陷，上著生小黑粒。病斑密集成塊斑，最后導致葉片枯黃，果實發(fā)病，癥狀常在斷蕾后2～4周出現(xiàn)，多在果指彎腹部分，嚴重時全果均有，初期為紅棕色、外圍暗綠色水暈，隨著果實肉度增大，病斑密度增大，嚴重的擴展至全果，影響果實的外觀和耐貯性，近年來香蕉黑星病在我國香蕉產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且為害日益嚴重，已成為香蕉生產(chǎn)上的重要病害之一。

香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)在PDA、PSA和V8等常見培養(yǎng)基上生長很緩慢，在進行分離時菌落常常被雜菌所覆蓋，而且分生孢子器產(chǎn)生時間晚。難以在早期鑒別。到1972年還未獲得純培養(yǎng)，除此之外以癥狀為基礎(chǔ)的病害常規(guī)診斷技術(shù)，需要采用柯赫氏法則經(jīng)過病原菌分離培養(yǎng)、病原菌鑒定、接菌、癥狀分析等步驟，耗時長、效率低、準確性差，難以做到病害發(fā)生時及時檢測和有效控制病原菌的傳播和病害流行，難以滿足香蕉黑星病診斷的實際需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、結(jié)果可靠、靈敏度高的快速診斷技術(shù)。

近年來，分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速，隨著分子生物學技術(shù)在植物病理學科不斷發(fā)展和應(yīng)用，一些分子標記技術(shù)為植物病原菌的診斷檢測提供了新的途徑，其中PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)以特異性強、靈敏度高、方便快捷等特點被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點，設(shè)計特異性引物進行PCR，對病原菌進行快速檢測和鑒定的技術(shù)已受到廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)外研究人員已成功開發(fā)出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘潰瘍病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方銹病菌等多種病原菌的特異性引物和檢測方法，實現(xiàn)了快速、靈敏和準確的鑒定。但目前有關(guān)香蕉黑星病菌分子檢測的研究尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中對香蕉黑星病菌的檢測和鑒定主要基于病原形態(tài)學特征，香蕉黑星病菌生長緩慢，分離難度大，分離程序繁瑣、耗死長、對鑒定經(jīng)驗要求高、準確度低，難以滿足香蕉黑星病診斷的實際需要問題，提供了一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及其檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供了一種香蕉黑星病菌分子檢測引物，其核苷酸序列為：

上游引物BMF：5’-GCTACAACGCCGAAATGACC-3’；

下游引物BMR：5’-GACGTTGCCCAATACCAAGC-3’。

所述引物BMF和BMR對香蕉黑星病菌特異性擴增出382bp的產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種香蕉黑星病菌的快速檢測方法，包括以下步驟：

(1)從香蕉葉片或果實中提取DNA；

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA；用于檢測香蕉組織是否存在香蕉黑星病菌時，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA；

(2) 以提取香蕉葉片或果實的DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能特異性擴增出382bp的產(chǎn)物，則可判定所述的香蕉葉片或果實中存在香蕉黑星病菌，否則所述的香蕉葉片或果實中不存在香蕉黑星病菌。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）準確性高：本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點設(shè)計對香蕉黑星病菌具有特異擴增作用的PCR 引物。已經(jīng)對不同地理來源的香蕉黑星病菌、攜帶香蕉黑星病菌的植物葉片、攜帶香蕉黑星病菌的果皮和健康的香蕉組織進行了檢測驗證，只有香蕉黑星病菌和攜帶該病菌的香蕉組織能特異性地擴增出一條382 bp 的電泳條帶，說明本發(fā)明所設(shè)計的引物用于檢測香蕉黑星病菌準確可靠；

（2）特異性強：本發(fā)明所設(shè)計的引物對香蕉黑星病菌具有很強的特異性，能夠用于區(qū)別香蕉黑星病菌、香蕉炭疽病、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉磚格孢葉斑病菌及香蕉暗雙孢葉斑病菌等香蕉上常見的病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在香蕉上癥狀特征相似的病害；

（3）靈敏度高：本發(fā)明將設(shè)計的特異引物與ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）聯(lián)合起來進行巢式PCR 擴增后，對香蕉黑星病菌的檢測靈敏度在DNA 水平上可達到1fg；

（4）適用性廣、實用性好：本發(fā)明的香蕉黑星病菌的檢測方法，不僅能對病菌菌絲體進行檢測，也能對感病的香蕉葉片和果皮進行檢測，可實現(xiàn)香蕉黑星病菌的早期檢測，即在病害顯癥前進行檢測，對預(yù)防香蕉生長期和采摘后黑星病的爆發(fā)流行有重要意義。

（5）、操作簡便快速：本發(fā)明只需進行DNA 提取、PCR 擴增和瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，一般整個檢測過程可在數(shù)小時內(nèi)完成，操作簡便快捷。

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物對香蕉黑星病菌特異性擴增電泳圖：其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3為香蕉黑星病菌，泳道4-11分別為：香蕉炭疽病菌、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉磚格孢葉斑病菌、香蕉暗雙孢葉斑病菌、香蕉枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌、陰性對照。

圖2為本發(fā)明引物香蕉黑星病菌的靈敏性檢測擴增電泳圖：A：普通PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-11分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、陰性對照、陽性對照；B為巢式PCR靈敏度檢測，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-13分別為：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、陰性對照、陽性對照。

圖3為本發(fā)明香蕉葉片和香蕉果皮種黑星病菌檢測擴增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-10分別為自然發(fā)病的香蕉葉片、自然發(fā)病香蕉果實、人工接種發(fā)病的香蕉葉片、人工接種后發(fā)病初期香蕉果實、健康香蕉葉片、健康的香蕉果皮、健康的香蕉果柄、陰性對照、陽性對照。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明。

下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1 分子檢測引物設(shè)計及香蕉黑星病菌特異分子檢測方法的建立

1.香蕉黑星病菌基因組DNA的提?。?/p>

采用 CTAB 法提取本實驗室保存的6株香蕉黑星病菌的基因組 DNA，具體步驟如下：

(1)取0.1 g菌絲粉于1.5 mL 離心管中，加入900μL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；

(2)取上清液700μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（各體積比為25:24:1），溫和搖動，室溫條件下，8000 r/min離心10min ；

(3)取上清液500μL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心10min；

(4)取上清液350μL，加入1/10 體積3 mol/L NaAc 和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃條件下，8000 r/min離心5 min ；

(5)棄去上清液，加入700μL 體積濃度為70%冰乙醇，輕搖10sec，4℃條件下，8000 r/min離心10sec，晾干，加入50μL TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.香蕉黑星病菌ITS序列測定：

以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為引物對提取香蕉黑星病菌的DNA 進行PCR 擴增，擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序為：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序，并提交GenBank，獲得序列號為KX611161。

3.香蕉黑星病菌特異分子檢測引物的設(shè)計：

根據(jù)香蕉黑星病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測序得到的6 株香蕉黑星病菌的ITS 序列與GenBank 中Phyllosticta屬不同種的ITS序列、香蕉炭疽病菌ITS 序列、香蕉彎孢霉葉斑病菌ITS 序列、香蕉黑斑病菌ITS 序列、香蕉磚格孢葉斑病菌ITS 序列、香蕉暗雙孢葉斑病菌ITS 序列、香蕉枯萎病菌ITS 序列進行同源性分析和差異位點比較，用BMRimer BMRimer5軟件設(shè)計了對香蕉黑星病菌具有特異性擴增作用的一對PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物BMF：5’-GCTACAACGCCGAAATGACC-3’；

下游引物BMR：5’-GACGTTGCCCAATACCAAGC-3’

4.香蕉黑星病菌快速分子檢測方法的建立：

(1)從香蕉葉片或果實中提取DNA:

①用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用 CTAB 法提取供試菌株基因組 DNA;

②用于檢測香蕉植株組織是否存在香蕉黑星病菌時，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA，具體步驟如下：

a.稱取待檢測的植物組織0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30μL，將組織充分磨碎成糊；

b.將糊狀組織轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，12000r/min 離心6 min，取上清液5μl；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均勻，取1.0μL 作為PCR 模板進行擴增；

(2) 以提取香蕉葉片或香蕉果實DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5×TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm；根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定檢測結(jié)果，如果能特異性擴增出382bp的產(chǎn)物，則可判定所述的香蕉葉片或香蕉果實中存在香蕉黑星病菌，否則所述的香蕉葉片或香蕉果實中不存在香蕉黑星病菌。

實施例2 香蕉黑星病菌特異性擴增

1.采用CTAB 法提取2株香蕉黑星病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉磚格孢葉斑病菌、香蕉暗雙孢葉斑病菌、香蕉枯萎病菌及蘆筍莖枯病菌的基因組DNA。

2. 以提取供試菌的DNA為模板進行PCR擴增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

3.特異性擴增結(jié)果

如圖1所示，2株香蕉黑星病菌可以特異性擴增出382bp的條帶，而香蕉炭疽病菌、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉磚格孢葉斑病菌、香蕉暗雙孢葉斑病菌、香蕉枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌和陰性對照均無擴增條帶，表明本發(fā)明的分子檢測引物可以將香蕉黑星病菌與為害香蕉的其他病原菌區(qū)分開來，具有很強的特異性，本發(fā)明的檢測方法可用于香蕉黑星病菌的特異性擴增。

實施例3本發(fā)明引物對香蕉黑星病菌的靈敏性檢測

1.采用CTAB 法提取香蕉黑星病菌的基因組DNA；

2.將提取的香蕉黑星病菌的基因組DNA，經(jīng)分光光度計測定濃度后，用無菌超純水稀釋，配制成系列濃度，備用；

3. 以配制的成系列濃度DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

4. 以配制的成系列濃度DNA為模板進行巢式PCR擴增：

（1）第一輪PCR 擴增：以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 為外引物對配制的成系列濃度DNA 進行第一輪PCR 擴增，擴增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序為：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶（Takara 大連寶生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；

（2）第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增的產(chǎn)物為模板，以BMF/BMR為引物進行第二輪PCR擴增，PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

5.檢測結(jié)果

如圖2所示，以本發(fā)明引物BMF/BMR為引物進行常規(guī)PCR時，在25μL反應(yīng)體系中，10pg的香蕉黑星病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達到10pg（圖2-A）；而進一步以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 為外引物擴增的產(chǎn)物為模板，以本發(fā)明引物BMF/BMR為引物進行第二輪擴增時，在25μL反應(yīng)體系中，1fg的香蕉黑星病菌DNA可以獲得可視條帶，其檢測靈敏度可達到1fg(圖2-B)。

實施例4香蕉葉片和果實中香蕉黑星病菌的檢測

1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株組織基因組DNA。

2. 以配制的成系列濃度DNA為模板進行常規(guī)PCR擴增：PCR反應(yīng)體系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL濃度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL濃度為5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至總體積達25μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min；電泳檢測擴增產(chǎn)物。

3. 檢測結(jié)果

如圖3所示，自然發(fā)病的香蕉葉片、自然發(fā)病香蕉果實、人工接種發(fā)病的香蕉葉片、人工接種發(fā)病初期香蕉果實和陽性對照中均可產(chǎn)生382bp左右的可視條帶，而健康香蕉葉片、健康的香蕉果皮、健康的香蕉果柄、陰性對照均無任何條帶出現(xiàn)，表明本發(fā)明引物和檢測方法還可用于田間香蕉植株中香蕉黑星病菌的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所

<120> 一種香蕉黑星病菌分子檢測引物及檢測方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctacaacgc cgaaatgacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacgttgccc aataccaagc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggga acctgcgg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20