本發(fā)明涉及一種云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由革蘭氏陰性菌黃單孢水稻變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的細(xì)菌性病害是嚴(yán)重的全球性水稻病害之一。水稻是亞洲許多國家的主要糧食，因此水稻白葉枯病對亞洲國家糧食生產(chǎn)的威脅尤為嚴(yán)重(Singh et al.2001),該病害也嚴(yán)重影響了我國水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，在發(fā)病較重的年份和地區(qū)該病可使水稻減產(chǎn)50％甚至絕收(章琦等，2007)。過量使用化學(xué)藥物防治白葉枯病可能導(dǎo)致環(huán)境破壞，選育帶有主效抗病基因的品種才是控制水稻白葉枯病行之有效的方法。但是由于白葉枯病菌生理小種變異頻繁，新的抗性品種在使用幾年后抗性下降或消失(Hulbert et al.2001)。因此，不斷挖掘利用顯得抗病基因資源，研究相關(guān)抗病機(jī)理，提升和延展抗病基因功能，已成為水稻抗病育種的重要研究內(nèi)容。

在長期的自然選擇下，野生稻對環(huán)境的適應(yīng)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于栽培稻，具很多優(yōu)良性狀，如抗病、抗蟲、耐旱等。因此，野生稻已成為水稻育種中基因資源發(fā)掘的寶庫。云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill)具有較強(qiáng)的抗逆性，特別是高抗甚至是免疫白葉枯病(錢韋等，2001)，在稻屬植物中表現(xiàn)突出，已成為抗病育種的重要種質(zhì)資源，但云南疣粒野生稻的抗病機(jī)理還不清楚。目前已發(fā)掘的水稻白葉枯病抗性基因共38個(gè)，其中7個(gè)來自于野生稻，即來自于普通野生稻的Xa21、Xa23、Xa30(Song et al.1995；Zhang et al.1996；Jin et al.2007)，小粒野生稻Xa27(Wu et al.2008)，藥用野生稻Xa29(Tan et al.2004)，澳洲野生稻Xa32(苗麗麗等，2010)，僅有一個(gè)隱性基因xa32來源于疣粒野生稻的(阮輝輝等，2008)。但xa32基因?yàn)殡[性，且與SSR標(biāo)記距離較遠(yuǎn)，使得該基因很難被用于水稻育種。因此，從云南疣粒野生稻中發(fā)掘新的抗病基因資源，已成為疣粒野生稻研究的重要內(nèi)容。

本發(fā)明所述的云南疣粒野生稻抗白葉枯病基因MeXB3屬于蛋白泛素化降解過程的關(guān)鍵酶之一的E3泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)的編碼基因，是水稻XB3基因的同源基因，與XBOS31(LOC4324295)有60％相似性。E3是一個(gè)超大的蛋白家族，可以分為HECT(homologous to the E6-AP carboxyl terminus)型、RING(Really Interesting New Gene)/U-box型、Cullin-RING型、APC/C型等(Vierstra RD et al.2009；Smalle et al.2004)。其中Ring型的E3的編碼基因可以根據(jù)亞結(jié)構(gòu)域分為30個(gè)亞家族，這些亞結(jié)構(gòu)域包括BRCT、Ankyrin重復(fù)和vWA結(jié)構(gòu)域(Wendy J et al.2012)。XB3基因是一個(gè)含有RING指結(jié)構(gòu)域(Ring Finger Domain，RING)和錨蛋白重復(fù)序列區(qū)(Ankyrin Repeat Domain,ANKY)的泛素連接酶E3。水稻XB3基因所編碼的蛋白是廣譜抗病基因Xa21的錨定蛋白，XB3基因的缺失突變體中，Xa21水稻對白葉枯病的抗性降低。此外，XB3的表達(dá)量減少也導(dǎo)致了Xa21蛋白含量的減少。說明XB3對于Xa21的累積是必須的而且和Xa21調(diào)節(jié)的抗性相關(guān)(Wang et al.2006；Cheng et al.2010)。

目前還未見疣粒野生稻XB3基因研究的公開報(bào)道。因此，發(fā)明將為水稻抗病育種提供新的基因資源，為研究云南疣粒野生稻抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服云南疣粒野生稻基因發(fā)掘的不足，而提供一種云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

云南疣粒野生稻的MeXB3基因，其全長cDNA序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。MeXB3基因全長cDNA序列長2133bp(堿基對)，編碼437個(gè)氨基酸組成的蛋白，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明將云南疣粒野生稻MeXB3基因轉(zhuǎn)入水稻，在抗水稻白葉枯病中的應(yīng)用，

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明首次克隆并鑒定了云南疣粒野生稻的MeXB3基因，并獲得轉(zhuǎn)MeXB3基因植株。該基因在疣粒野生稻中屬于誘導(dǎo)型表達(dá)，對獲得的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，該基因能增強(qiáng)水稻對部分白葉枯病菌小種的抗性，從而提高水稻抗白葉枯病能力，為水稻抗病育種提供基因資源，對培育高抗白葉枯病水稻具有重要的理論及實(shí)際意義。

附圖說明

圖1.qRT-PCR法進(jìn)行MeXB3基因表達(dá)譜。

圖2.MeXB3基因結(jié)構(gòu)圖。MeXB3基因具N端和C端分別有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，含有5個(gè)Ankryin保守結(jié)構(gòu)域、1個(gè)Ring保守結(jié)構(gòu)域。

圖3.轉(zhuǎn)MeXB3基因水稻植株的PCR檢測。

圖4.轉(zhuǎn)MeXB3基因水稻植株抗白葉枯病的抗病性鑒定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。各實(shí)施例中無特殊說明的均為常規(guī)方法。

試驗(yàn)材料：云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill)，白葉枯病病原菌Y8，白葉枯病病原菌Y8為云南省典型的白葉枯病致病菌株，該菌株使用是利用其對水稻的侵染能力的共性從而導(dǎo)致水稻葉片形成白葉枯病病斑，因此，使用其它具有同樣致病能力的各種白葉枯病菌菌株都能達(dá)到本發(fā)明的效果。以下各實(shí)施例所用試劑均為市售。

實(shí)施例1云南疣粒野生稻抗白葉枯病相關(guān)基因MeXB3的克隆及分析

(1)材料的培養(yǎng)及處理

云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill)栽于溫室內(nèi)，直至開花期。用NA培養(yǎng)基活化白葉枯病病原菌Y8，28℃培養(yǎng)2-3d，用無菌蒸餾水洗下菌苔，配制成OD₆₀₀為0.6的菌液。在溫室溫度升至28℃時(shí)以剪葉法接種云南疣粒野生稻葉片，對照組用無菌水模擬接種，接菌后分別于2h、4h、8h、24h、48h、72h等量取樣，對照即無菌水剪葉的云南疣粒野生稻也同時(shí)等量取樣，取樣后立即把樣品放入液氮中速凍，并放-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)總RNA的提取、定量及檢測

分別取接菌后2h、4h、8h、24h、48h、72h的云南疣粒野生稻葉片100mg采用E.Z.N.A.Plant RNA Kit(美國OMEGA公司)試劑盒提取總RNA，操作方法按公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。抽提完后，取0.5μL總RNA用Nanodrop2000分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定總RNA濃度，并用OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值確認(rèn)RNA純度。取3μl總RNA在1％瓊脂糖凝膠上分離總RNA，檢測總RNA的完整性。

(3)Real time PCR(qRT-PCR)法分析MeXB3基因表達(dá)普

取接菌后不同時(shí)間的1ug總RNA做反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，具體方法按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書操作。根據(jù)MeXB3的EST序列設(shè)計(jì)qRT-PCR擴(kuò)增引物，以水稻β-Actin基因作為內(nèi)參基因，按照Premix Ex Taq^TM II試劑盒(寶生物工程大連有限公司)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，分析云南疣粒野生稻受白葉枯病菌脅迫后不同時(shí)期的表達(dá)情況。

MeXB3的EST序列上游引物MeXB3-QF的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，MeXB3的EST序列下游引物MeXB3-QR的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

圖1是MeXB3基因的qRT-PCR結(jié)果，結(jié)果顯示MeXB3基因在疣粒野生稻中受白葉枯病菌表達(dá)，且在8h內(nèi)隨著接菌時(shí)間的增長表達(dá)量也隨著增加，這說明MeXB3與疣粒野生稻抗白葉枯病有重要的關(guān)聯(lián)。

(4)MeXB3基因全長cDNA的克隆

本發(fā)明中MeXB3基因全長cDNA的獲得是通過3’RACE和5’RACE的方法實(shí)現(xiàn)的。3’RACE以(2)中提取的總RNA為模板，按照RACE 5’/3’Kit試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書進(jìn)行操作。5’RACE引物MeXB3-GSPS5序列如SEQ ID NO.5所示3’RACE引物MeXB3-GSPS3序列如SEQ ID NO.6所示。最后將MeXB3基因的5’端序列、3’端序列進(jìn)行融合，拼接成一個(gè)完整的MeXB3基因的cDNA全長序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

云南疣粒野生稻抗白葉枯病基因MeXB3的EST序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

MeXB3基因EST序列的獲得是通過對受白葉枯病菌誘導(dǎo)云南疣粒野生稻轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)庫中獲得的，轉(zhuǎn)錄組測序是在北京百邁客生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。得到的序列在在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)上進(jìn)行Blast比對分析，得到與水稻XB3基因同源性達(dá)到94％的EST序列MeXB3。

(5)MeXB3基因結(jié)構(gòu)分析

將(4)中獲得的MeXB3基因全長cDNA核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示)用BioXM 2.6翻譯為氨基酸序列后提交到SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。經(jīng)分析MeXB3基因含有5個(gè)Ankryin保守結(jié)構(gòu)域、1個(gè)Ring保守結(jié)構(gòu)域和2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，如圖2所示。

實(shí)施例2云南疣粒野生稻MeXB3基因增強(qiáng)對水稻白葉枯病抗性的運(yùn)用。

(1)MeXB3基因的表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)云南疣粒野生稻抗白葉枯病基因MeXB3的cDNA全長序列設(shè)計(jì)包含完整開放閱讀框的引物，設(shè)計(jì)時(shí)加入限制性內(nèi)切酶NcoI和BaglⅡ的酶切位點(diǎn)，用于將MeXB3基因重組到表達(dá)載體pCAMBIA2301中。MeXB3的ORF序列上游引物MeXB3-OF的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，MeXB3的ORF序列下游引物MeXB3-OR的堿基序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。

(2)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

取-80℃保存的LBA4404根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)，置冰上融解。取1μL含有MeXB3-F基因的表達(dá)載體pCAMBIA2301-MeXB3的質(zhì)粒加入到100μL感受態(tài)中，混勻，加入到處理好的電擊杯中。設(shè)置220V電壓，點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化。電擊完成加入900μl的液體YEP培養(yǎng)基，28℃，200rpm搖床培養(yǎng)1.5h，菌液涂布在含50μg/mL卡那霉素(Kan)和100μg/mL利福平(Rif)平板上，28℃培養(yǎng)至形成單菌落。

(3)陽性克隆的鑒定與保存

挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50μg/mL Kan和100μg/mL Rif的液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm搖床培養(yǎng)16h，取1μL菌液進(jìn)行PCR檢測，檢測引物為MeXB3-OF和MeXB3-OR。取檢測結(jié)果為陽性的菌液，混合30％甘油，置于離心管中，于-80℃超低溫冰箱中保存，備用。

(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

本發(fā)明是利用水稻模式品種日本晴的幼胚進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化，具體操作過程如下：

①水稻愈傷的誘導(dǎo)和繼代

取栽培稻日本晴幼胚去殼后用75％乙醇消毒30sec，無菌蒸餾水洗滌2-3次后，用15％的NaClO并加入一滴吐溫20滅菌20min，消毒完之后用無菌蒸餾水漂洗5-6次，從無菌蒸餾水中取出幼胚置于無菌濾紙上吸干水分，然后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿20-30粒。28℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)兩周后，將長出來的愈傷組織切下接到繼代培養(yǎng)基上，繼代一周以后用于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2,4-D 3.0mg/L+KT 0.4mg/L，pH＝5.8；所述的繼代培養(yǎng)基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2,4-D 2.0mg/L+KT 0.4mg/L，pH＝5.8。

②含目的MeXB3基因的表達(dá)載體pCAMBIA2301-MeXB3的農(nóng)桿菌懸浮菌液的制備。

取出保存于-80℃的含有目的MeXB3基因的表達(dá)載體pCAMBIA2301-MeXB3的根癌農(nóng)桿菌重組菌株LBA4404，劃線接種于添加了50μg/ml Kan和25μg/ml Rif的LB平板上，在28℃下倒置暗培養(yǎng)2-3d。從平板上挑取單菌落，接種于30ml添加了50μg/ml Kan和25μg/ml Rif YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm震蕩培養(yǎng)16-20h進(jìn)行活化?；罨蟮玫胶康腗eXB3基因的表達(dá)載體pCAMBIA2301-MeXB3的農(nóng)桿菌懸浮菌液(以下簡稱：懸浮菌液)，用于浸泡栽培稻日本晴的愈傷組織。

③水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

將繼代的質(zhì)量較好的栽培稻日本晴愈傷組織切割成直徑2-5mm的小塊并轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基，然后將懸浮菌液注入共培養(yǎng)基直至使每個(gè)愈傷組織都能被菌液充分浸泡，1min后將多余菌液吸出，28℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)2-3天。所述的共培養(yǎng)基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2，4-D 2.0mg/L+乙酰丁香酮(As)20mg/L，pH＝5.2。

④抗性水稻愈傷組織的篩選

首先將共培養(yǎng)的愈傷組織用加有250mg/L頭孢拉定的無菌蒸餾水清洗5-6次，每次2-3min，再用MS液體培養(yǎng)基+500mg/L頭孢拉定震蕩清洗并過夜，重復(fù)2-3次，直至洗液清澈。將愈傷組織置于無菌濾紙上，在超凈臺(tái)將其吹干。吹干的愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)兩周，一些褐化的愈傷組織邊緣長出乳白色的新的抗性愈傷組織，將這些新長出的愈傷組織轉(zhuǎn)到新鮮配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選15-20d，之后繼續(xù)生長的乳黃色質(zhì)地緊密的愈傷組織即為抗性愈傷。所述的篩選培養(yǎng)基的配方是：MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+2,4-D 2.0mg/L+頭孢拉定250mg/L+50mg/L潮霉素，pH＝5.8。

⑤抗性水稻愈傷組織的分化、生根及煉苗

從篩選培養(yǎng)基上挑選抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，置于28℃，16h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過10-15d有綠點(diǎn)出現(xiàn)，20-40d進(jìn)一步分化出小苗。

待幼苗在分化培養(yǎng)基長至2-3cm后，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，置于28℃，16h/d的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼苗根系比較發(fā)達(dá)苗高約10cm時(shí)進(jìn)行煉苗。

將已長出根的幼苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈后放入大試管(30mm×180mm)中，加入自來水，放在光照培養(yǎng)架上，每2-3天換一次水。在室內(nèi)煉苗7-8d后移栽至溫室土壤環(huán)境條件下，每2d澆一次水，水面以不淹沒小苗為度，如果天晴，需要遮蔭到小苗成活(以吐水為準(zhǔn))即得到轉(zhuǎn)基因再生植株。

所述的分化培養(yǎng)基的配方是：MS+蔗糖30g/L+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 1.5mg/L+頭孢拉定150mg/L，pH＝5.8。所述的生根培養(yǎng)基的配方是：1/2MS+蔗糖15g/L+NAA 0.5mg/L，pH＝5.8。

(5)轉(zhuǎn)基因再生植株的分子生物學(xué)檢測

①PCR檢測

待步驟(4)所獲得的轉(zhuǎn)基因再生植株生長旺盛時(shí)，取其嫩葉，提取葉片中的DNA。DNA的提取采用AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒(美國AXYGEN公司)按照說明書進(jìn)行提取。

以提取的水稻總DNA為模板，非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照(NC)，MeXB3基因的表達(dá)載體pCAMBIA2301-MeXB3為陽性對照(C)，以MeXB3-OF和MeXB3-OR為引物，進(jìn)行PCR檢測。檢測結(jié)果如圖3所示，其中標(biāo)記為S1、S2、S3、S4、S7、S8、S9、S10的泳道處存在與陽性對照相同大小的基因片段，表明這幾株再生植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。

②MeXB3基因的亞細(xì)胞定位

由于MeXB3基因的表達(dá)載體pCAMBIA2301-MeXB3帶有綠色熒光蛋白(GFP)，因此?、僦需b定為陽性轉(zhuǎn)基因植株的根尖1-2mm置于載玻片上加一滴清水再蓋上蓋玻片，輕輕壓碎根尖，在萊卡(Leica SP8)激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位情況，根GFP的激發(fā)波長將觀察波長設(shè)置為480nm-550nm。觀察結(jié)果顯示MeXB3定位于細(xì)胞膜上。

③轉(zhuǎn)基因再生植株抗白葉枯病鑒定

白葉枯病菌株Y8(本實(shí)驗(yàn)室保存)在NA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2-3天，配制成OD₆₀₀處值為0.6的菌液。在孕穗期使用剪葉法對PCR鑒定的陽性轉(zhuǎn)基因植株接種白葉枯病菌Y8生理小種，以同期栽培的非轉(zhuǎn)基因日本晴為對照(共接種10株)，每株剪5片完全伸展的葉子的葉尖1-3cm。接種15天后，當(dāng)病斑長度明顯且穩(wěn)定時(shí)調(diào)查病情，分別測量每片葉片的病斑長度，并統(tǒng)計(jì)每株植株病斑長度的平均值，根據(jù)方中達(dá)提出的抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行如下分級(jí)：

0級(jí)(I)：病斑長度0-0.2cm；

1級(jí)(HR)：病斑長度0.2-1.5cm；

3級(jí)(MR)：病斑長度1.5-3.0cm；

5級(jí)(MS)：病斑長度3.0-5.0cm；

7級(jí)(S)：病斑長度5.0-10.0cm；

9級(jí)(HS)：病斑長度大于10.0cm。

基因MeXB3轉(zhuǎn)化植株對白葉枯病菌的抗病性鑒定結(jié)果見圖4，表明本發(fā)明云南疣粒野生稻基因MeXB3轉(zhuǎn)化植株對白葉枯病菌的抗性較非轉(zhuǎn)基因植株有顯著提升，表明本發(fā)明基因MeXB3為抗白葉枯病的新基因。

SEQUENCE LISTING 1

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2133

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-2133

<222> (1)..(2133)

<400> 1

cctttgctac ttgtgtatgt acaaaaggca cgcttggttg tacttgtaca gccagctttg 60

ggagaacagt taagagtagt tgaagaagaa aacgaagtag actttgaaga gaaataaaaa 120

ggatgcatgg aaaaagtaag gaaagggact gtaaagtagt agtatactat atctaaggat 180

catcgatatt gaaatgcggt actactaaca acaataaaac catctgttta aaattatttg 240

tcattttagt tttttctcag gtcctttaaa tatttgtatc tttataggat ggaaatgaaa 300

aaattagagt ggagaaatag aagagctttg aatgaaaaaa gaacaacgca agtggtttga 360

ggatgaaaga aacatccaat cgaccaatcc aatggcaatg ctctttcgtg tgtgtgtgta 420

tataaacaga gagagagaga cccaagtgtc ccgtcctctg ccgcctcctt gatcaccggc 480

ggccatcgcc tacctagcgg tggctatggg gcacggcctc agctgcagcc gcgacaccga 540

cgagcaccac ttgttccgcg cggcgcaggt gggcgacatc tacgcactgg gcgacctcct 600

cgccgccgac cccgcgctcg ctcgccgcgc aaccatatac ggccgcttca ccgctctgca 660

catcgccgcc ggcaatggca gcctccaggt ggtgtccatg ttgctggatc gcggtgttat 720

gccggacgtg ttgaaccgga agaggcagac gccgctgatg ctggcggcca tgcatggcaa 780

caccgactgc gtgctcgtcc tcctccacgc cggcgccaac atcctcacct tcgactcgcc 840

gcgcgccagg acgtgcctcc accacgccgc ctactgcggc cacgccgact gcctgcaggc 900

catcctcgcc gcctcctggg gcttcgcgcg cttcgtcaac gtcagggacg agcagggcgc 960

cacgccgctg catctcgccg ccaggcaggg ccgcccggcc tgcgtgcgcc tgctgctcga 1020

caagggcgcc atcgtctccg ccgccaccgg cgcctacggc ttccccggga gcacgccact 1080

gcacctggcc gcccgcgcgg gcaacctgga ctgcatccgg gagctgctcg cctggggggc 1140

ggaccgcctc cagagggact cggccggcag gatcgcgtac ggtgtcgcgc tcaggcgggg 1200

ccatcgcgcg tgcgccgcgc tgctcaaccc tgcggcggcg gagcccattg tgtggccgtc 1260

cccgctcaag ttcatcgccg agctcgaggc ggacgccaag gctctgctgg aggcggcgct 1320

catggaggcc aacagggaga gggagaagag gatcctccta ctgaaggagg gaagcgggta 1380

ctgtccgccg tcaccggctc actccgccgg cgcggacgag gaggaagctt gcaacatctg 1440

cttcgagcag gcgtgcagca tggaggtgaa ggagtgcggg caccagatgt gcgcggcgtg 1500

cacgctggcg ctctgctgcc acagcaagcc caaccccaag acactcctcc tgcacccgcc 1560

ggcctgcccc ttctgccgca ccaccatctc ccgcctcgtc gtcgccacca aggccgccgc 1620

cgacaggccg gcgtcaccgc gcctaagccg gcggcggtcg aggcgatctc gcgatgggag 1680

cagcagcttc aaggggctct cgtcggccat ggggtcattt tccaagatag ggcgcggctc 1740

cggccgattg gttgacggag gcgagctcgc ggacaagcct gatcacgacc tctcttctgt 1800

cgtcgtcggt gtcatgtgat ttgaaagcca aaaacccaga gacgcctgcc tgcattgcca 1860

ttaatttaat cttgttagag cttgggtaat caatcctcca gcaagctcaa ccaaggttga 1920

ctaattacca ttagcagcgt tactagtata tatacaccta ccatgttaat tgatacttga 1980

ccatacaccg atagctaggg caaataggaa tcaaataata ttgtattgca ttgaatttgt 2040

gcttgtagca ttttgttaca gtgccacctc cctggctagt tatttttggc ttgtcatact 2100

catagtaaat aaatactcct ccctatttac tgc 2133

SEQUENCE LISTING 2

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 437

<212> PRT

<213> Oryza meyeriana Baill

<400> 1

Met Gly His Gly Leu Ser Cys Ser Arg Asp Thr Asp Glu His His Leu

1 5 10 15

Phe Arg Ala Ala Gln Val Gly Asp Ile Tyr Ala Leu Gly Asp Leu Leu

20 25 30

Ala Ala Asp Pro Ala Leu Ala Arg Arg Ala Thr Ile Tyr Gly Arg Phe

35 40 45

Thr Ala Leu His Ile Ala Ala Gly Asn Gly Ser Leu Gln Val Val Ser

50 55 60

Met Leu Leu Asp Arg Gly Val Met Pro Asp Val Leu Asn Arg Lys Arg

65 70 75 80

Gln Thr Pro Leu Met Leu Ala Ala Met His Gly Asn Thr Asp Cys Val

85 90 95

Leu Val Leu Leu His Ala Gly Ala Asn Ile Leu Thr Phe Asp Ser Pro

100 105 110

Arg Ala Arg Thr Cys Leu His His Ala Ala Tyr Cys Gly His Ala Asp

115 120 125

Cys Leu Gln Ala Ile Leu Ala Ala Ser Trp Gly Phe Ala Arg Phe Val

130 135 140

Asn Val Arg Asp Glu Gln Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg

145 150 155 160

Gln Gly Arg Pro Ala Cys Val Arg Leu Leu Leu Asp Lys Gly Ala Ile

165 170 175

Val Ser Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Gly Phe Pro Gly Ser Thr Pro Leu

180 185 190

His Leu Ala Ala Arg Ala Gly Asn Leu Asp Cys Ile Arg Glu Leu Leu

195 200 205

Ala Trp Gly Ala Asp Arg Leu Gln Arg Asp Ser Ala Gly Arg Ile Ala

210 215 220

Tyr Gly Val Ala Leu Arg Arg Gly His Arg Ala Cys Ala Ala Leu Leu

225 230 235 240

Asn Pro Ala Ala Ala Glu Pro Ile Val Trp Pro Ser Pro Leu Lys Phe

245 250 255

Ile Ala Glu Leu Glu Ala Asp Ala Lys Ala Leu Leu Glu Ala Ala Leu

260 265 270

Met Glu Ala Asn Arg Glu Arg Glu Lys Arg Ile Leu Leu Leu Lys Glu

275 280 285

Gly Ser Gly Tyr Cys Pro Pro Ser Pro Ala His Ser Ala Gly Ala Asp

290 295 300

Glu Glu Glu Ala Cys Asn Ile Cys Phe Glu Gln Ala Cys Ser Met Glu

305 310 315 320

Val Lys Glu Cys Gly His Gln Met Cys Ala Ala Cys Thr Leu Ala Leu

325 330 335

Cys Cys His Ser Lys Pro Asn Pro Lys Thr Leu Leu Leu His Pro Pro

340 345 350

Ala Cys Pro Phe Cys Arg Thr Thr Ile Ser Arg Leu Val Val Ala Thr

355 360 365

Lys Ala Ala Ala Asp Arg Pro Ala Ser Pro Arg Leu Ser Arg Arg Arg

370 375 380

Ser Arg Arg Ser Arg Asp Gly Ser Ser Ser Phe Lys Gly Leu Ser Ser

385 390 395 400

Ala Met Gly Ser Phe Ser Lys Ile Gly Arg Gly Ser Gly Arg Leu Val

405 410 415

Asp Gly Gly Glu Leu Ala Asp Lys Pro Asp His Asp Leu Ser Ser Val

420 425 430

Val Val Gly Val Met

435

SEQUENCE LISTING 3

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-20

<222> (1)..(20)

<400> 1

ggccatgggg tcattttcca 20

SEQUENCE LISTING 4

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-20

<222> (1)..(20)

<400> 1

gacaccgacg acgacagaag 20

SEQUENCE LISTING 5

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-25

<222> (1)..(25)

<400> 1

gcgcgacacc gtacgcgatc ctgcc 25

SEQUENCE LISTING 6

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-25

<222> (1)..(25)

<400> 1

cgcgcttcgt caacgtcagg gacca 25

SEQUENCE LISTING 7

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1321

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-480

<222> (1)..(480)

<400> 1

tggctatggg gcacggcctc agctgcagcc gcgacaccga cgagcaccac ttgttccgcg 60

cggcgcaggt gggcgacatc tacgcactgg gcgacctcct cgccgccgac cccgcgctcg 120

ctcgccgcgc aaccatatac ggccgcttca ccgctctgca catcgccgcc ggcaatggca 180

gcctccaggt ggtgtccatg ttgctggatc gcggtgttat gccggacgtg ttgaaccgga 240

agaggcagac gccgctgatg ctggcggcca tgcatggcaa caccgactgc gtgctcgtcc 300

tcctccacgc cggcgccaac atcctcacct tcgactcgcc gcgcgccagg acgtgcctcc 360

accacgccgc ctactgcggc cacgccgact gcctgcaggc catcctcgcc gcctcctggg 420

gcttcgcgcg cttcgtcaac gtcagggacg agcagggcgc cacgccgctg catctcgccg 480

ccaggcaggg ccgcccggcc tgcgtgcgcc tgctgctcga caagggcgcc atcgtctccg 540

ccgccaccgg cgcctacggc ttccccggga gcacgccact gcacctggcc gcccgcgcgg 600

gcaacctgga ctgcatccgg gagctgctcg cctggggggc ggaccgcctc cagagggact 660

cggccggcag gatcgcgtac ggtgtcgcgc tcaggcgggg ccatcgcgcg tgcgccgcgc 720

tgctcaaccc tgcggcggcg gagcccattg tgtggccgtc cccgctcaag ttcatcgccg 780

agctcgaggc ggacgccaag gctctgctgg aggcggcgct catggaggcc aacagggaga 840

gggagaagag gatcctccta ctgaaggagg gaagcgggta ctgtccgccg tcaccggctc 900

actccgccgg cgcggacgag gaggaagctt gcaacatctg cttcgagcag gcgtgcagca 960

tggaggtgaa ggagtgcggg caccagatgt gcgcggcgtg cacgctggcg ctctgctgcc 1020

acagcaagcc caaccccaag acactcctcc tgcacccgcc ggcctgcccc ttctgccgca 1080

ccaccatctc ccgcctcgtc gtcgccacca aggccgccgc cgacaggccg gcgtcaccgc 1140

gcctaagccg gcggcggtcg aggcgatctc gcgatgggag cagcagcttc aaggggctct 1200

cgtcggccat ggggtcattt tccaagatag ggcgcggctc cggccgattg gttgacggag 1260

gcgagctcgc ggacaagcct gatcacgacc tctcttctgt cgtcgtcggt gtcatgtgat 1320

t 1321

SEQUENCE LISTING 8

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-20

<222> (1)..(20)

<400> 1

ttgctggatc gcggtgttat 20

SEQUENCE LISTING 9

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 云南疣粒野生稻MeXB3基因及其應(yīng)用

<130> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill

<220>

<221> 1-20

<222> (1)..(20)

<400> 1

ccgacgacga cagaagagag 20