本發(fā)明屬于單核巨噬細胞系氧化應激模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種過氧化氫誘導的小鼠單核巨噬細胞系(RAW264.7)氧化應激模型的建立方法。

背景技術(shù)：

超氧陰離子自由基是活性氧自由基中形成最早的，是氧在進行單電子還原反應中首先形成的產(chǎn)物。超氧陰離子經(jīng)酶催化后又可以形成羥自由基、脂質(zhì)過氧化物、過氧化氫和單線態(tài)氧等其他活性氧自由基，它的大量生成是機體產(chǎn)生氧化應激的重要原因。

羥自由基是目前所知活性氧中對機體毒性最強、危害最大的一種自由基，他可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式參與機體的各類反應，與多種大分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化損傷，死細胞壞死或突變。抗超氧陰離子活力和抑制羥自由基能力可以反映細胞在清除超氧陰離子和抑制羥自由基生成，保護細胞不受氧化應激損傷的能力，是反映細胞抗氧能力的重要指標。過氧化氫容易獲得，且性質(zhì)相對穩(wěn)定，作為一種重要的活性氧，過氧化氫能夠自由通過細胞膜結(jié)構(gòu)，進入細胞后與細胞內(nèi)的鐵離子通過Fenton反應形具有極強細胞毒性的·OH，引起細胞氧化應激，因此被廣泛應用于誘導氧化應激的試驗中。如：在過氧化氫誘導的A549細胞氧化應激模型中，過氧化氫能夠通過降低還原型谷胱甘肽水平誘導組蛋白乙酰化，并激活AP-1和NF-kB通路，促進IL-8的釋放，是氧化應激促炎的一種機制；過氧化氫處理BEAS-2B細胞通過降低HDAC2活性，上調(diào)組蛋白H4乙酰化水平促進炎癥發(fā)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作容易、成本較低的過氧化氫誘導的小鼠單核巨噬細胞系氧化應激模型的建立方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：過氧化氫誘導的小鼠單核巨噬細胞系氧化應激模型的建立方法，采用過氧化氫體外誘導處理小鼠單核巨噬細胞系，過氧化氫濃度為25-450μM。

上述過氧化氫誘導的小鼠單核巨噬細胞系氧化應激模型的建立方法，分別設細胞對照組和過氧化氫組，用含5％FBS的DMEM或含5％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；實驗組每孔加入經(jīng)不含血清的細胞培養(yǎng)液稀釋的過氧化氫，空白對照組加入等量不含血清的細胞培養(yǎng)液，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于第4h、8h、12h和24h時，分別收集細胞，采用MTT法檢測細胞存活率和熒光法測定細胞內(nèi)ROS水平。

小鼠單核巨噬細胞系為RAW264.7。

用于MTT法檢測細胞存活率的細胞濃度為4×10⁵個/mL，過氧化氫濃度為25-450μM，細胞孵育時間為4h。

用于熒光法測定細胞內(nèi)ROS水平的細胞濃度為5×10⁶個/mL，過氧化氫濃度為150-350μM，細胞孵育時間為30min。

發(fā)明人建立了一種過氧化氫誘導的小鼠單核巨噬細胞系氧化應激模型的建立方法，采用過氧化氫體外誘導處理小鼠單核巨噬細胞系，過氧化氫濃度為25-450μM。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次使用小鼠單核巨噬細胞系作為過氧化氫誘導氧化應激模型的造模細胞，通過考察細胞死亡率和細胞內(nèi)ROS水平確定了H₂O₂溶液的最佳使用濃度和細胞孵育時間，操作容易、成本較低，可幫助初次進行小鼠單核巨噬細胞培養(yǎng)和氧化應激模型的研究人員比較順利的完成小鼠單核巨噬細胞的培養(yǎng)和氧化應激模型的建立。

附圖說明

圖1是H₂O₂處理對RAW264.7細胞存活率的影響。

圖2是H₂O₂處理對RAW264.7細胞內(nèi)ROS水平的影響。

具體實施方式

一、實驗方法

1不同濃度過氧化氫處理對細胞存活率的影響

(1)實驗分組與處理

按照S Mueller等報道的方法，在紫外分光光度計測OD₂₄₀值后，按公式：H₂O₂(mM)＝OD₂₄₀×1000/39.4計算H₂O₂濃度。

分別設細胞對照組和不同濃度梯度過氧化氫組(25μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM)，用含5％FBS的DMEM(或含5％FBS的RPMI1640)培養(yǎng)液調(diào)整RAW264.7細胞濃度為4×10⁵個/mL，并接種于96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；實驗組加入每孔加入100μL經(jīng)不含血清的細胞培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的過氧化氫，空白對照組加入等量不含血清的細胞培養(yǎng)液，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)MTT法檢測細胞存活率

繼續(xù)培養(yǎng)第4h、8h、12h和24h時，棄去部分細胞培養(yǎng)液，每孔保留90μL，加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育4h；小心棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，搖勻使顆粒溶解后靜置10分鐘，用酶標儀測定490nm波長處吸光度值，計算細胞存活率。

2不同濃度過氧化氫處理對細胞內(nèi)ROS水平的影響

(1)實驗分組與處理

分別設細胞對照組和不同濃度梯度過氧化氫組(150μM、200μM、250μM、300μM、350μM)，用含5％FBS的DMEM(或含5％FBS的RPMI 1640)培養(yǎng)液調(diào)整RAW264.7細胞濃度為5×10⁶個/mL，接種于24孔板，每孔1000μL，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；實驗組加入500μL經(jīng)不含血清的細胞培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的過氧化氫，空白對照組加入等量不含血清的細胞培養(yǎng)液，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

(2)熒光法測定細胞內(nèi)ROS水平

繼續(xù)培養(yǎng)第4h、8h、12h和24h時收集細胞，PBS洗2次，加入稀釋好的DCFH-DA熒光探針(用不含血清的細胞培養(yǎng)液稀釋1000倍)200ul，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30min；棄去熒光探針，PBS洗3次，加入1000μL PBS緩沖液，收集細胞制成單細胞懸液，每孔取100μL至熒光酶標儀專用的黑色96孔板，用熒光酶標儀測定激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm處熒光值。

3實驗數(shù)據(jù)采用SSP18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，Duncan組間比較，結(jié)果以表示。肩標*表示與對照組相比P＜0.05，肩標**表示與對照組相比P＜0.01。

二、實驗結(jié)果

<a>不同濃度過氧化氫處理對RAW264.7細胞存活率的影響(圖1)

結(jié)果如圖1所示，隨著過氧化氫濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，且隨作用時間的增加，細胞存活率也呈下降趨勢。其中250μM過氧化氫作用RAW264.7細胞4h、8h、12h、24h均能顯著降低細胞存活率(P＜0.05)。

<b>不同濃度過氧化氫處理對RAW264.7細胞內(nèi)ROS水平的影響(圖2)

結(jié)果如圖2所示，隨著過氧化氫濃度的升高，細胞內(nèi)活性氧水平逐漸增加，且隨作用時間的增加，過氧化氫處理組細胞內(nèi)活性氧水平逐漸降低。其中250μM過氧化氫作用RAW264.7細胞4h、8h、12h、24h均能顯著升高細胞內(nèi)ROS水平(P＜0.05)。