本發(fā)明涉及一種基因組編輯系統(tǒng)及其用途，特別涉及一種通過II型啟動子驅(qū)動的CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其用途。
背景技術(shù)：
：CRISPR是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。涉及Cas9蛋白和sgRNA的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)是代表性的，在sgRNA的引導下，Cas9蛋白首先與sgRNA結(jié)合成復合物，然后通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結(jié)構(gòu)，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂，利用細胞自身的非同源性末端接合和同源重組修復機制實現(xiàn)錯誤修復或者引入改變，造成DNA序列改變，從而實現(xiàn)基因的定向修飾操作。在植物中，通常使用的CRISPR/Cas系統(tǒng)包含sgRNA和Cas9兩個獨立的表達盒，并分別由III型啟動子(如水稻U3或U6啟動子等)和II型啟動子(如花椰菜花葉病毒35S啟動子或泛素蛋白1啟動子等)驅(qū)動表達。該系統(tǒng)主要存在如下缺陷：(1)sgRNA一般由水稻U3或U6啟動子驅(qū)動表達，但二者要求轉(zhuǎn)錄的第一個堿基分別是A和G，因此其對靶點的選擇具有一定的限制。(2)水稻U3和U6啟動子均為組成型啟動子，無法實現(xiàn)在特異組織中對不同的基因進行編輯。(3)如果Cas9表達盒的啟動子與選擇性標記(如Hpt或PMI等)表達盒的啟動子相同，在某些品種的農(nóng)桿菌中便容易發(fā)生因重組而導致的Cas9元件丟失的現(xiàn)象，導致農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后獲得的轉(zhuǎn)基因植株基本上沒有突變體，進而影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基因組編輯系統(tǒng)及其用途，有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中III型啟動子對轉(zhuǎn)錄起始位點的堿基限制、不能在特異組織中對不同的基因進行編輯、由于重組而導致元件丟失導致無法獲得突變體等技術(shù)缺陷。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種嵌合序列，包含sgRNA序列和可剪切序列，所述sgRNA序列插入間插序列的內(nèi)部。進一步地，所述sgRNA序列插入所述間插序列內(nèi)部的位置兩側(cè)各至少保留長度為12bp的所述間插序列。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述嵌合序列還包括靶點序列。具體地，所述間插序列為內(nèi)含子序列。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種基因組編輯系統(tǒng)，包括a)和b)：a)所述嵌合序列；b)Cas9蛋白。進一步地，所述嵌合序列與編碼所述Cas9蛋白的核酸序列有效連接。所述嵌合序列有效連接于調(diào)控序列。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述調(diào)控序列包括II型啟動子和/或定位結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述II型啟動子包括組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。具體地，所述組成型啟動子包括花椰菜花葉病毒35S啟動子或泛素啟動子。所述組織特異性啟動子包括花粉特異性表達啟動子、根特異性表達啟動子、綠色組織特異性表達啟動子或胚乳特異性表達啟動子。所述誘導型啟動子包括化學誘導型啟動子、冷誘導型啟動子、熱誘導型啟動子或病毒誘導型啟動子。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)，包括a)、b)和c)：a)II型啟動子；b)所述嵌合序列；c)Cas9蛋白。進一步地，所述嵌合序列與編碼所述Cas9蛋白的核酸序列有效連接。所述嵌合序列有效連接于所述II型啟動子。優(yōu)選地，所述II型啟動子包括組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。具體地，所述組成型啟動子包括花椰菜花葉病毒35S啟動子或泛素啟動子。所述組織特異性啟動子包括花粉特異性表達啟動子、根特異性表達啟動子、綠色組織特異性表達啟動子或胚乳特異性表達啟動子。所述誘導型啟動子包括化學誘導型啟動子、冷誘導型啟動子、熱誘導型啟動子或病毒誘導型啟動子。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種表達盒，包含編碼所述基因組編輯系統(tǒng)的核酸序列或編碼所述由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)的核酸序列。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種重組表達載體，包含編碼所述基因組編輯系統(tǒng)的核酸序列或或編碼所述由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)的核酸序列或所述表達盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種實現(xiàn)基因組編輯的方法，包括在生物體中表達所述基因組編輯系統(tǒng)或所述由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種編輯靶位點序列的方法，包括將所述基因組編輯系統(tǒng)導入包含靶位點序列的生物體中。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生基因組編輯的植物的方法，包括向植物基因組中引入編碼所述基因組編輯系統(tǒng)的核酸序列或編碼所述由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)的核酸序列。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生基因組編輯植物種子的方法，包括將所述方法產(chǎn)生的基因組編輯的植物自交，從而獲得具有基因組編輯植物種子。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種培育基因組編輯植物的方法，包括：種植至少一粒所述方法產(chǎn)生的所述基因組編輯植物種子；使所述種子長成植株。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種所述基因組編輯系統(tǒng)或所述由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)在獲得基因組突變生物中的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種試劑盒，包括所述基因組編輯系統(tǒng)或所述由II型啟動子驅(qū)動的基因組編輯系統(tǒng)，用于實現(xiàn)基因組編輯。本發(fā)明中所述的CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，是指成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列，含有多個短同向重復的基因座，其被發(fā)現(xiàn)存在于約40％測序細菌的基因組中和90％測序古細菌的基因組中。CRISPR作為原核的免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能，其賦予對外來遺傳元件例如質(zhì)粒和噬菌體的抵抗性。CRISPR系統(tǒng)提供了一種獲得性免疫形式。外源DNA的短片段(稱為間隔區(qū))整合在CRISPR重復序列之間的基因組中，然后CRISPR間隔區(qū)以類似于真核生物中RNAi的方式用于識別和沉默外來遺傳元件。在細菌及古細菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。本發(fā)明所述Cas蛋白的非限制性實例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也稱為Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修飾形式。這些酶是已知的；例如，化膿鏈球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可見于SwissProt數(shù)據(jù)庫登錄號Q99ZW2下。在一些實施例中，未修飾的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些實施例中，該CRISPR酶是Cas9，并且可以是來自化膿鏈球菌或肺炎鏈球菌的Cas9。本發(fā)明中所述的Cas9，Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)中一種重要的蛋白質(zhì)成分，可以從生物體如鏈球菌屬物種(Streptococcussp.)，優(yōu)選釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中分離得到。當Cas9與稱為CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(TracrRNA)的兩個RNA復合時，形成活性核酸內(nèi)切酶，從而切斷入侵噬菌體或質(zhì)粒中的外源遺傳元件，以保護宿主細胞。crRNA從宿主基因組中的CRISPR元件轉(zhuǎn)錄，其中該CRISPR元件之前自外源入侵物捕獲。研究表明通過融合crRNA和tracrRNA的必要部分產(chǎn)生的單鏈嵌合RNA可以取代Cas9/RNA復合體中的兩個RNA以形成功能性核酸內(nèi)切酶。Cas9蛋白質(zhì)的變體可以是Cas9的突變體形式，其中催化性天冬氨酸殘基改變?yōu)槿魏纹渌被?。?yōu)選地，所述其它氨基酸可以是丙氨酸。本發(fā)明中所述的向?qū)NA或引導RNA(guideRNA，gRNA)，也稱為小向?qū)NA(smallguideRNA，sgRNA)，作用于動質(zhì)體(kinetoplastid)體內(nèi)一種稱為RNA編輯(RNAediting)的后轉(zhuǎn)錄修飾過程中，也是一種小型非編碼RNA。可與pre-mRNA配對，并在其中插入一些尿嘧啶(U)，產(chǎn)生具有作用的mRNA。向?qū)NA編輯的RNA分子，長度大約是60-80個核苷酸，是由單獨的基因轉(zhuǎn)錄的，在gRNA的5’末端有一段錨定區(qū)，以特殊的G-U配對方式與非編輯的pre-mRNA序列互補，錨定序列促進gRNA與pre-mRNA中的編輯區(qū)互補，特異結(jié)合；在gRNA分子的中間部位有一個編輯區(qū)負責在被編輯的pre-mRNA分子中插入U的位置，其與被編輯mRNA精確互補；在gRNA分子的3’末端，有一段轉(zhuǎn)錄后加入的由大約15個非編碼的PolyU序列，功能為把gRNA鏈接到pre-mRNA的編輯區(qū)的5’上游富含嘌呤堿基的核苷酸序列上。在編輯時，形成一個編輯體(editosome)，以gRNA內(nèi)部的序列作為模板進行轉(zhuǎn)錄物的校正，同時產(chǎn)生編輯的mRNA。有三種類型CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中涉及Cas9蛋白質(zhì)和crRNA、tracrRNA的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)是代表性的。Cas9蛋白質(zhì)通過人工修飾的向?qū)NA的導向作用可以打靶DNA序列的5’-N20-NGG-3’(N代表任何脫氧核苷酸堿基)，N20是與gRNA的5’序列相同的20個堿基，NGG是PAM區(qū)(原型間隔子鄰近基序，Protospacer-adjacentmotif)。Cas9剪切的位點就是PAM附近的區(qū)域。相對于鋅指和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物DNA結(jié)合蛋白提供了優(yōu)勢-因為在核苷酸結(jié)合CRISPR-Cas蛋白中的位點特異性由RNA分子調(diào)控而不是DNA結(jié)合蛋白調(diào)控。本發(fā)明中所述重組，當用于例如細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)、或改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或該細胞源自此修飾的細胞。本發(fā)明中向?qū)NA可以以編碼該向?qū)NA的RNA或DNA的形式轉(zhuǎn)移到細胞或生物體中。向?qū)NA可以是分離的RNA、并入病毒載體的RNA的形式、或者在載體中編碼。優(yōu)選地，載體可以是病毒載體、質(zhì)粒載體、或農(nóng)桿菌載體。編碼向?qū)NA的DNA可以是包含編碼向?qū)NA序列的載體。例如，可以通過用分離的向?qū)NA或包含編碼向?qū)NA的序列和啟動子的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞或生物體，將向?qū)NA轉(zhuǎn)染到細胞或生物體。本發(fā)明中所述切割或剪切是指核苷酸分子共價骨架的斷裂。向?qū)NA可以制備為特異于任何待切割的靶，通過向?qū)NA的靶特異性部分切割任何靶DNA。本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。如本申請，包括權(quán)利要求中使用的，除非上下文中清楚地另有說明，否則單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語，例如“一”、“一個”和“該”，包括復數(shù)指代物。因此，例如“植物”、“該植物”或“一個植物”也指示多個植物。并且根據(jù)上下文，使用術(shù)語“植物”還可指示該植物在遺傳上相似或相同的后代。類似地，術(shù)語“核酸”可以指核酸分子的許多拷貝。類似地，術(shù)語“探針”可以指代相同或相似的探針分子。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字，并明確地包括所限定的范圍內(nèi)的每個整數(shù)和非整數(shù)分數(shù)。除非另外指出，否則本文所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。本發(fā)明中，術(shù)語“核酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，它們是指具有任何長度的核苷酸的聚合形式，根據(jù)上下文含義，可指代DNA或RNA、或其類似物。其中DNA包括但不限于cDNA、基因組DNA、合成DNA(例如人工合成)和含核酸類似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行已知或未知的任何功能。核酸可為雙鏈或單鏈(既有義鏈或反義單鏈)。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物、以及核酸類似物。本發(fā)明中，術(shù)語“間插序列”是指基因間或基因內(nèi)的非編碼序列。大多數(shù)真核結(jié)構(gòu)基因中的間插序列或不編碼序列可以轉(zhuǎn)錄，但在基因轉(zhuǎn)錄后，由這些間插序列轉(zhuǎn)錄的部分經(jīng)加工被從初級轉(zhuǎn)錄本中準確除去，才產(chǎn)生有功能的RNA。本發(fā)明中，術(shù)語“內(nèi)含子(Intron)”是真核生物細胞DNA中的間插序列，是阻斷基因線性表達的序列。這些序列被轉(zhuǎn)錄在前體RNA中，但RNA上的內(nèi)含子會在RNA離開細胞核進行轉(zhuǎn)譯前被剪除，最終不存在于成熟RNA分子中。在成熟mRNA被保留下來的基因部分被稱為外顯子。內(nèi)含子有時也叫內(nèi)顯子，與外顯子相對。內(nèi)含子和外顯子的交替排列構(gòu)成了割裂基因。在前體RNA中的內(nèi)含子常被稱作“間插序列”。在轉(zhuǎn)錄后的加工中，它比外顯子有更多的突變。“內(nèi)含子”也指編碼相應(yīng)RNA內(nèi)含子的DNA中的區(qū)域。真核基因所含內(nèi)含子的數(shù)目、位置和長度不盡相同。內(nèi)含子是一段特殊的DNA序列，其可以實現(xiàn)自剪切。本發(fā)明使用的內(nèi)含子來源于蓖麻(Ricinuscommunis)。在植物中，內(nèi)含子可以穩(wěn)定和增加基因的表達量。來源于細菌的GUS基因是沒有內(nèi)含子的，故在一般情況下，當在植物中表達GUS時，會在該GUS基因序列內(nèi)部加入來源于蓖麻的內(nèi)含子(如pCambia系列的載體)，以穩(wěn)定和增加在植物中的表達。具有內(nèi)含子功能并在嚴格條件下與本發(fā)明內(nèi)含子序列或其片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40％-50％同源，大約60％、65％或70％同源，甚至至少大約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40％-50％、大約60％、65％或70％同源，甚至至少大約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。本發(fā)明中，“嵌合序列”是指利用基因重組技術(shù)將來源不同的DNA/RNA序列重組而成的人工序列。本發(fā)明中“野生型”表示生物、菌株、基因的典型形式或者當它在自然界存在時區(qū)別于突變體或變體形式的特征。本發(fā)明中“突變體”或“變體”是指發(fā)生突變的個體，其具有與野生型不同的序列，可能會導致其中序列的至少部分功能已丟失的序列，例如，在啟動子或增強子區(qū)域中序列的變化將至少部分地影響生物體中編碼序列的表達。術(shù)語“突變”是指可由諸如缺失、添加、取代或重排引起的核酸序列中序列的任何變化。突變還可影響該序列參與的一個或多個步驟。例如，DNA序列中的變化可導致有活性的、有部分活性的或無活性的改變的mRNA和/或蛋白的合成。本發(fā)明中“非天然存在的”表明人工的參與。當指核酸分子或多肽時，表示該核酸分子或多肽至少基本上從它們在自然界中或如發(fā)現(xiàn)于自然界中的與其結(jié)合的至少另一種組分游離出來。本發(fā)明中“表達”指感興趣的序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生對應(yīng)mRNA并且該mRNA翻譯產(chǎn)生對應(yīng)產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白。調(diào)節(jié)元件控制或調(diào)整感興趣的序列表達，所述調(diào)節(jié)元件包括5’調(diào)節(jié)元件如啟動子。本發(fā)明中“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，是指具有任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可以包含修飾的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中斷。這些術(shù)語還涵蓋已經(jīng)被修飾的氨基酸聚合物；這些修飾例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化、或任何其他操作，如與標記組分的結(jié)合。術(shù)語“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光異構(gòu)體、以及氨基酸類似物和肽模擬物。本發(fā)明中術(shù)語“載體”是指能夠在宿主細胞內(nèi)復制的DNA分子。質(zhì)粒和粘粒是示例性載體。此外，術(shù)語“載體”和“媒介”可互換使用以指將DNA片段從一種細胞轉(zhuǎn)移至另一種細胞的核酸分子，因此細胞不必要屬于相同的生物(例如將DNA片段從農(nóng)桿菌細胞轉(zhuǎn)移至植物細胞)。本發(fā)明中術(shù)語“表達載體”是指含有所需要的編碼序列和在特定宿主生物中表達有效連接的編碼序列所需要的適宜核酸序列的重組DNA分子。本發(fā)明中術(shù)語“重組表達載體”指來自任何來源、能夠整合入基因組或自主復制的任何因子如質(zhì)粒、粘粒、病毒、BAC(細菌人工染色體)、自主復制型序列、噬菌體、或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，包括其中一種或多種DNA序列使用眾所周知的重組DNA技術(shù)以功能性可操作方式連接的DNA分子。本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子、增強子、前導序列以及其它可操作地連接到所述嵌合序列的調(diào)節(jié)序列。在本發(fā)明中，“定位結(jié)構(gòu)域”可任選地添加為蛋白部分的部分，定位結(jié)構(gòu)域可將蛋白部分或編程的蛋白部分或組裝的復合物定位至活細胞中特定細胞或亞細胞定位。定位結(jié)構(gòu)域可通過將蛋白部分的氨基酸序列融合到摻入包括以下結(jié)構(gòu)域的氨基酸來構(gòu)建：核定位信號(NLS)；線粒體前導序列(MLS)；葉綠體前導序列；和/或被設(shè)計以將蛋白運輸或引導或定位至含有核酸的細胞器、細胞區(qū)室或細胞的任何細分部分的任何序列。在一些實施方案中，生物體是真核生物，且定位結(jié)構(gòu)域包括允許蛋白進入細胞核和基因組DNA內(nèi)的核定位結(jié)構(gòu)域(NLS)。所述NLS的序列可包括帶正電荷序列的任何功能NLS。在另一些實施方案中，定位結(jié)構(gòu)域可包括使蛋白部分或編程的核蛋白進入細胞器的前導序列，使細胞器DNA被修飾成為可能。本發(fā)明中，真核生物有3類RNA聚合酶，負責轉(zhuǎn)錄3類不同的啟動子。由RNA聚合酶I負責轉(zhuǎn)錄的rRNA基因，啟動子(I型)比較單一，由轉(zhuǎn)錄起始位點附近的兩部分序列構(gòu)成：第一部分是核心啟動子(corepromoter)，由-45—+20位核苷酸組成，單獨存在時就足以起始轉(zhuǎn)錄；另一部分由-170—-107位序列組成，稱為上游調(diào)控元件，能有效地增強轉(zhuǎn)錄效率。由RNA聚合酶Ⅲ負責轉(zhuǎn)錄的是5SrRNA、tRNA和某些核內(nèi)小分子RNA(snRNA)，其啟動子(Ⅲ型)組成較復雜，又可被分為兩個亞類：一類屬于結(jié)構(gòu)基因內(nèi)啟動子，一類屬于結(jié)構(gòu)基因外啟動子。內(nèi)啟動子的有效啟動依賴于基因內(nèi)部包含的兩個不連續(xù)的DNA片段，這兩個DNA片段包括一些不同的連續(xù)DNA序列A、B或C區(qū)，兩個區(qū)之間被隔開。根據(jù)兩個區(qū)的不同組合，可以分為I類和II類兩種：I類包括A和C區(qū)，目前發(fā)現(xiàn)其僅存在于5SrRNA的基因中；II類包括A和B區(qū)，存在于tRNA的基因、7SLRNA的基因、腺病毒VAI與VAII的RNA中。A、B或A、C內(nèi)部DNA序列是轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA和TFⅢC轉(zhuǎn)錄啟動結(jié)合部位。在多數(shù)情況下，5’端還會有其它調(diào)節(jié)或關(guān)鍵元件，這些元件對RNA的高效轉(zhuǎn)錄是必需的。這些序列的存在與否之間影響著轉(zhuǎn)錄效率。這些序列呈現(xiàn)復雜的多樣性，不過大多數(shù)啟動子5’端-30到-20處存在著TATA盒樣序列，與外啟動子相似。外啟動子缺乏相應(yīng)的內(nèi)部序列，僅在5’端有順式作用元件，在基因的末端有一組由4個或更多胸腺嘧啶組成的終止信號，如脊椎動物U6核小RNA和7SKRNA啟動子，這些啟動子都高度相似或完全相同，其位置和堿基序列高度保守，其結(jié)構(gòu)與polII啟動子也有一定的相似性。它們的5’端順式作用元件包括幾個控制元件，在其上游約-30處存在一個TATA樣序列，近-60處有一個snRNAPSE(snRNA近似序列)和一個或多個被稱為OCT的修飾序列5’-ATGCAAAT-3’。TATA樣序列是polIII對snRNA基因進行轉(zhuǎn)錄特異的。TATA樣元件和PSE元件共同決定了轉(zhuǎn)錄起始位點的選擇和轉(zhuǎn)錄效率。TATA樣元件和PSE元件之間的距離決定了RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的特異性，但似乎TATA樣元件更重要，因為在PSE缺失的U6RNA和7SKRNA基因轉(zhuǎn)錄中，只有轉(zhuǎn)錄效率的下降。而且，PSE元件可能和B盒(boxB)相關(guān)，B盒在一定程度上可以替代PSE元件。這些序列對下游基因的轉(zhuǎn)錄具有決定性的作用，而且它們與起始位點相距較遠，往往超過150bp，而對polIII內(nèi)啟動子來說，一般在80bp以內(nèi)；與polIII外啟動子相比，polII啟動子5’端各順式作用元件的作用剛好相反，如果TATA樣元件缺失，PSE則可以履行TATA樣元件功能，決定轉(zhuǎn)錄的起始部位。在PSE上游，外啟動子還有一個遠端控制序列，其結(jié)構(gòu)與polII增強子OCT骨架相似，但較其復雜。而在-223處還有一個CACC序列與OCT骨架相連。這些遠端控制序列的存在可大大提高U6RNA和7SKRNA的表達效率。由RNA聚合酶II負責轉(zhuǎn)錄的II型基因包括所有蛋白質(zhì)編碼基因和部分snRNA基因，后者的啟動子結(jié)構(gòu)與III型基因啟動子中的第三亞類相似，編碼蛋白質(zhì)的II型基因啟動子在結(jié)構(gòu)上有共同的保守序列。轉(zhuǎn)錄起始位點沒有廣泛的序列同源性，但第一個堿基為腺嘌呤，而兩側(cè)是嘧啶堿基。這個區(qū)域被稱為起始子(initiator，Inr)，序列可表示為Py2CAPy5。Inr元件位于-3—+5。僅由Inr元件組成的啟動子是具有可被RNA聚合酶II識別的最簡單啟動子形式。多數(shù)II型啟動子有一個被稱為TATA盒的共有序列，通常處于-30區(qū)，相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的位置比較固定。TATA盒存在于所有真核生物中，TATA盒是一個保守的七堿基對，也有一些II型啟動子不含有TATA盒，這樣的啟動子稱為無TATA盒啟動子。本發(fā)明中術(shù)語“啟動子”是指DNA調(diào)節(jié)區(qū)。本發(fā)明所述“組成型啟動子”是指在該類啟動子的控制下，目的異源核苷酸序列的表達大體恒定在一定水平上，在植物的不同組織和/或不同生長發(fā)育階段表達水平?jīng)]有明顯差異。所述組織為植物體中由來源相同和執(zhí)行同一功能的一種或多種類型細胞集合而成的結(jié)構(gòu)單位，例如保護組織、輸導組織、營養(yǎng)組織、機械組織、分生組織，幾種不同的組織有機配合、緊密聯(lián)系，形成不同的器官(organ)，不同的器官之間互相配合，更有效地完成有機體的整個生命活動過程。所述生長發(fā)育階段可根據(jù)植物形態(tài)、機能的差異劃分為胚胎階段、幼苗階段、成熟階段和衰老階段。本發(fā)明中術(shù)語“組成型的表達”是指目的異源核苷酸序列在植物的不同組織和/或不同生長發(fā)育階段都以大體上一致的水平進行表達。指導植物內(nèi)組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米ubi啟動子、水稻GOS2基因的啟動子等?？色@得的植物相容性啟動子的范圍包括組織特異性啟動子和誘導型啟動子。誘導型調(diào)控元件是能應(yīng)答于誘導劑直接或間接激活一條或多條DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄的元件。不存在誘導劑時，DNA序列或基因?qū)⒉荒鼙晦D(zhuǎn)錄。典型地，與誘導型調(diào)控元件特異結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性形式存在，其再通過誘導劑直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導劑可以是化學試劑，例如蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、生長調(diào)控因子、除草劑或酚類化合物或直接通過熱、冷、鹽或毒性元素施加或通過病原體肌動蛋白或疾病劑(例如病毒)間接施加的生理脅迫。含有誘導型調(diào)控元件的植物細胞可暴露于誘導劑，通過噴霧、澆水、加熱或類似方法將誘導劑應(yīng)用到細胞或植物上。任何誘導型啟動子均可用于本發(fā)明。示例性的誘導型啟動子包括蛻皮素受體啟動子；來自ACE1系統(tǒng)的應(yīng)答于銅的啟動子；來自玉米的In2-1和In2-2基因，其應(yīng)答于苯磺酰胺除草劑安全劑；玉米GST啟動子，其由用作為前緊急除草劑的疏水親電化合物激活；和煙草PR-1a啟動子，其由水楊酸激活。其它受化學調(diào)控的啟動子包括甾醇應(yīng)答型啟動子以及四環(huán)素誘導型和四環(huán)素遏制型啟動子。本發(fā)明所述“組織特異性啟動子”又稱為器官特異性啟動子，可用于靶向特定的植物組織中增強的轉(zhuǎn)錄和/或表達。啟動子可在目標組織中表達也在其它植物組織中表達，可在目標組織中強烈表達以及比其它組織程度低得多的表達，或者可高度優(yōu)選在目標組織中表達。根據(jù)啟動子調(diào)控的基因表達組織的不同，可分為根特異性啟動子、花特異性啟動子、胚特異性啟動子等。Koehorst-vanPutten等分析GBSSI啟動子，發(fā)現(xiàn)該啟動子可以驅(qū)動基因在木薯塊狀根中的表達，但不能在其余組織中表達，表明該啟動子具有組織特異性表達的特性。呂山花等利用GUS穩(wěn)定表達系統(tǒng)分析了pyk10啟動子在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達情況，發(fā)現(xiàn)該啟動子驅(qū)動的基因在根中特異性表達。房孝良等研究了水稻OsESP1啟動子，發(fā)現(xiàn)該啟動子驅(qū)動的GUS基因只在胚中表達，說明該啟動子為胚特異性啟動子。還如在綠色組織中指導編碼序列的表達水平高于植物的其他組織，如PEP羧化酶啟動子。本發(fā)明中所述“有效連接”或“可操作地連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示：啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。本發(fā)明中，所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子，增強子，前導序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到CRISPR系統(tǒng)的一個或多個元件，從而驅(qū)動該CRISPR系統(tǒng)的所述一個或多個元件的表達。一般而言，CRISPR(規(guī)律間隔成簇短回文重復)，也稱為SPIDR(Spacer間隔開的同向重復)，構(gòu)成通常對于特定細菌物種而言特異性的DNA基因座的家族。該CRISPR座位包含在大腸桿菌中被識別的間隔開的短序列重復(SSR)的一個不同類、以及相關(guān)基因。類似的間隔開的SSR已經(jīng)鑒定于地中海富鹽菌、化膿鏈球菌、魚腥草屬和結(jié)核分枝桿菌中。這些CRISPR座位典型地不同于其它SSR的重復結(jié)構(gòu)，這些重復已被稱為規(guī)律間隔的短重復(SRSR)。一般而言，這些重復是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定長度的獨特間插序列規(guī)律地間隔開。雖然重復序列在菌株之間是高度保守的，許多間隔開的重復和這些間隔區(qū)的序列一般在菌株與菌株之間不同，已經(jīng)在40種以上的原核生物中鑒定出CRISPR座位。本發(fā)明中，“靶點”、“靶位點”或“靶點序列”、“靶位點序列”是指被作用的任何期望的預定的核酸序列，包括但不限于編碼或非編碼序列、基因、外顯子或內(nèi)含子、調(diào)節(jié)序列、基因間序列、合成序列和細胞內(nèi)寄生物序列。在一些實施方案中，靶點序列存在于靶細胞、組織、器官或生物體內(nèi)。靶點序列包括靶位點，包括靶點序列內(nèi)的一個或多個核苷酸，其可通過本發(fā)明公開的內(nèi)容被修飾至任何程度。例如，靶點序列可包含一個核苷酸。例如，靶點序列可包含1-300個核苷酸。例如，靶點序列可包含約1-100個核苷酸。例如，靶點序列可包含1-50個核苷酸。例如，靶點序列可包含約1-35個核苷酸。在一些實施方案中，靶點序列可包括不止一個靶位點，其可以是相同的或不同的。引物的長度一般是11個多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個多核苷酸或更多，更優(yōu)選的是24個多核苷酸或更多，最優(yōu)選的是30個多核苷酸或更多。這種引物在高度嚴格雜交條件下與目標序列特異性地雜交。盡管不同于目標DNA序列且對目標DNA序列保持雜交能力的引物是可以通過常規(guī)方法設(shè)計出來的，但是，優(yōu)選的，本發(fā)明中的引物與目標序列的連續(xù)核酸具有完全的DNA序列同一性。本發(fā)明的引物在嚴格條件下與目標DNA序列雜交。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。如本發(fā)明使用的，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。如本發(fā)明使用的，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如本發(fā)明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50℃條件下用2.0×SSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0×SSC、50℃到高度嚴格條件的約0.2×SSC、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明的一個核酸分子可以在中度嚴格條件下，例如在約2.0×SSC和約65℃下與SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中一個或多個核酸分子或其互補序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。更優(yōu)選地，本發(fā)明的一個核酸分子在高度嚴格條件下與SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中一個或多個核酸分子或其互補序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。本發(fā)明中，優(yōu)選的標記物核酸分子具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或其互補序列，或者上述序列的任一片段。本發(fā)明另一優(yōu)選的標記物核酸分子與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或其互補序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQIDNO:1或SEQIDNO:2可以用作植物育種方法中的標記物以鑒定遺傳雜交的后代。探針與目標DNA分子的雜交可以通過任何一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進行檢測，這些方法包括但不限于，熒光標記、放射性標記、抗體類標記和化學發(fā)光標記。關(guān)于使用特定的擴增引物對目標核酸序列進行的擴增(例如，通過PCR)，“嚴格條件”指的是在DNA熱擴增反應(yīng)中僅允許引物對目標核酸序列發(fā)生雜交的條件，具有與目標核酸序列相應(yīng)的野生型序列(或其互補序列)的引物，能夠與所述目標核酸序列結(jié)合，并且優(yōu)選產(chǎn)生唯一的擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物即擴增子。術(shù)語“特異性結(jié)合(目標序列)”是指在嚴格雜交條件下引物僅與包含目標序列的樣品中的目標序列發(fā)生雜交。表達盒可另外含有可選擇的標記基因。一般地，表達盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的選擇性標記基因。所述選擇性標記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細胞或組織。所述選擇性標記基因包括但不限于，編碼抗生素抗性的基因(如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPT))和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的基因，以及賦予除草劑抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D)。本發(fā)明中，“試劑盒”可包括本發(fā)明描述的基因組修飾系統(tǒng)與以下的任一種或全部：測定試劑、緩沖液、探針和/或引物、和無菌鹽水或另一種藥學上可接受的乳劑和懸液基底。此外，試劑盒可包括含有用于實踐本發(fā)明描述的方法的用法說明(例如，操作方案)的說明性材料。轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞類型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導入植物細胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導的DNA導入。已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞可按照常規(guī)的方式生長成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征?？膳嘤蚨啻员ＷC穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達的種子。本發(fā)明提供了一種基因組編輯系統(tǒng)及其用途，具有以下優(yōu)點：1、轉(zhuǎn)錄起始位點無限制：使用II型啟動子驅(qū)動sgRNA表達，消除了對于轉(zhuǎn)錄起始位點的堿基限制。2、指導切割特異組織：大多數(shù)特異表達的啟動子屬于II型啟動子，若使用該類型啟動子驅(qū)動sgRNA的表達，有利于實現(xiàn)特異組織的基因編輯。3、拓寬sgRNA可利用的啟動子范圍：使用II型啟動子轉(zhuǎn)錄sgRNA，拓寬了sgRNA可利用的啟動子范圍，同時消除了對于靶點第一位堿基的限制，擴大了靶點選擇范圍。4、簡化載體：通過將sgRNA和Cas9整合在一個表達盒中，不僅可以減少載體構(gòu)建過程中表達盒的數(shù)量、簡化載體，還能避免在某些品種農(nóng)桿菌中由于多個表達盒使用相同的啟動子而發(fā)生重組導致部分元件的丟失的問題。5、編輯效率較高：本發(fā)明提供的由II型啟動子驅(qū)動的基因編輯系統(tǒng)獲得的編輯效率與常規(guī)體系相當，并且可以直接應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。附圖說明圖1為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組克隆載體DBN02-T構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN100677構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的sgRNA與內(nèi)含子不同嵌合方式的玉米懸浮細胞團的GUS染色效果圖；圖4為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組克隆剪刀載體DBN04-T構(gòu)建流程圖；圖5為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN100777構(gòu)建流程圖；圖6為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN100775構(gòu)建流程圖；圖7為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的II型啟動子驅(qū)動Cas9/sgRNA的玉米懸浮細胞團的GUS染色效果圖；圖8為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN100000載體結(jié)構(gòu)圖；圖9為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的靶點1載體DBN-A載體結(jié)構(gòu)圖；圖10為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的靶點2載體DBN-B載體結(jié)構(gòu)圖；圖11為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN100778構(gòu)建流程圖；圖12為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的靶點3載體DBN-C載體結(jié)構(gòu)圖；圖13為本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的靶點4載體DBN-D載體結(jié)構(gòu)圖。具體實施方式下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明基因組編輯系統(tǒng)及其用途的技術(shù)方案。第一實施例、sgRNA與內(nèi)含子嵌合方式的篩選一、sgRNA與內(nèi)含子在不同嵌合方式下組成的嵌合序列的獲得和合成1、獲得sgRNA與內(nèi)含子在不同連接方式下組成的嵌合序列GUS蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，編碼相應(yīng)于所述GUS蛋白的氨基酸序列的GUS-01核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，其中內(nèi)含子iGUS-01序列如序列表中SEQIDNO:3所示；將sgRNA序列(如序列表中SEQIDNO:4所示)插入到所述內(nèi)含子iGUS-01內(nèi)部形成的嵌合序列iGUS-02(含酶切位點BsaI)，如序列表中SEQIDNO:5所示，包含所述嵌合序列iGUS-02的GUS-02核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示；將所述內(nèi)含子iGUS-01序列部分替換為sgRNA(如序列表中SEQIDNO:4所示)后形成的嵌合序列iGUS-03(含酶切位點BsaI)，如序列表中SEQIDNO:7所示，包含所述嵌合序列iGUS-03的GUS-03核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:8所示。2、合成上述核苷酸序列所述GUS-01核苷酸序列(如序列表中SEQIDNO:2所示)、所述GUS-02核苷酸序列(如序列表中SEQIDNO:6所示)和所述GUS-03核苷酸序列(如序列表中SEQIDNO:8所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述GUS-01核苷酸序列的5’端還連接有KpnI酶切位點，所述GUS-01核苷酸序列的3’端還連接有SpeI酶切位點；合成的所述GUS-02核苷酸序列的5’端還連接有KpnI酶切位點，所述GUS-02核苷酸序列的3’端還連接有SpeI酶切位點；合成的所述GUS-03核苷酸序列的5’端還連接有KpnI酶切位點，所述GUS-03核苷酸序列的3’端還連接有SpeI酶切位點。二、重組表達載體的構(gòu)建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1、構(gòu)建重組克隆載體將合成的GUS-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN02-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；GUS-02為GUS-02核苷酸序列(SEQIDNO:6)；MCS為多克隆位點)。然后將重組克隆載體DBN02-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN02-T)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預冷的溶液I(25mMTris-HCl、10mMEDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)懸?。患尤?00μl新配制的溶液II(0.2MNaOH、1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(3M醋酸鉀、5M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mMTris-HCl、1mMEDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆?。提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和SpeI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN02-T中插入的所述GUS-02核苷酸序列為序列表中SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，即GUS-02核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN02-T的方法，將合成的所述GUS-01核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN01-T，其中，GUS-01為GUS-01核苷酸序列(SEQIDNO:3)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN01-T中所述GUS-01核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN02-T的方法，將合成的所述GUS-03核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，GUS-03為GUS-03核苷酸序列(SEQIDNO:8)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述GUS-03核苷酸序列正確插入。2、構(gòu)建重組表達載體將pCAMBIA2300(CAMBIA機構(gòu)可以提供)載體進行改造，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通過點突變?nèi)サ魀CAMBIA2300載體上的BsaI位點，同時將卡那霉素表達盒去掉，得到pDBN骨架載體。向所述pDBN骨架載體引入花椰菜花葉病毒35S啟動子和終止子以及PMI表達盒(prUbi+PMI+tNos)，得到表達載體DBN-PMI，用于下述載體構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBN02-T和表達載體DBN-PMI，將切下的GUS-02核苷酸序列片段插到表達載體DBN-PMI的KpnI和SpeI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100677，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S-01：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:9)；GUS-02：GUS-02核苷酸序列(SEQIDNO:6)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQIDNO:12)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；LB：左邊界)。將重組表達載體DBN100677用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體DBN100677)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體DBN100677在KpnI和SpeI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQIDNO:6所示核苷酸序列，即GUS-02核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100677的方法，將KpnI和SpeI酶切重組克隆載體DBN01-T切下的所述GUS-01核苷酸序列插入表達載體DBN-PMI，得到重組表達載體DBN100774。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100774中的核苷酸序列含有為序列表中SEQIDNO:3所示核苷酸序列，即GUS-01核苷酸序列，所述GUS-01核苷酸序列可以連接所述pr35S啟動子和t35S終止子。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100677的方法，將KpnI和SpeI酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述GUS-03核苷酸序列插入表達載體DBN-PMI，得到重組表達載體DBN100678。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100678中的核苷酸序列含有為序列表中SEQIDNO:8所示核苷酸序列，即GUS-03核苷酸序列，所述GUS-03核苷酸序列可以連接所述pr35S啟動子和t35S終止子。3、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組載體DBN100677、DBN100678和DBN100774用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌LBA4404、3μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10min，37℃溫水浴10min；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對重組表達載體DBN100677、DBN100678和DBN100774酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100677、DBN100678和DBN100774結(jié)構(gòu)完全正確。三、轉(zhuǎn)化的玉米懸浮細胞系的獲得1、玉米幼胚的剝?nèi)⒂衩灼贩N齊319(Q319)的種子播種于溫室或大田中，待玉米植株長成授粉后7-12天，收獲玉米雌穗，用濃度為75％(v/v)的酒精浸泡5min后剝?nèi)∮着?，挑選長度為0.6-1.2mm的透明幼胚備用。2、初生愈傷組織的獲得將上述剝?nèi)〉挠衩子着呓臃N到愈傷誘導培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.2g/L、蔗糖30g/L、麥草畏(Dicamba)2mg/L、2,4-D1.5mg/L、毒莠定(Picloram)2.2mg/L、激動素(KT)0.3mg/L、芐氨基嘌呤(BAP)0.02mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上進行愈傷組織的誘導，于溫度28℃的條件下暗培養(yǎng)10-14天，優(yōu)選為14天，獲得表面突起明顯、顏色鮮嫩、生長速度提高的初生愈傷組織。3、制備玉米懸浮細胞系玉米懸浮細胞系的起始：將獲得的所述初生愈傷組織轉(zhuǎn)移至裝有75ml懸浮培養(yǎng)液SUS-1(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖45g/L、Dicamba1.5mg/L、2,4-D1mg/L、Picloram5mg/L，pH5.8)的無菌三角瓶(150ml)中，每個三角瓶中接種5-8粒所述初生愈傷組織，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的上述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)。玉米懸浮細胞系的獲得：所述初生愈傷組織懸浮培養(yǎng)10-25天后進行第一次繼代，優(yōu)選為20天，繼代時剔除褐化死亡的愈傷組織，在原三角瓶中保留生長旺盛、質(zhì)地堅硬、色澤鮮黃的新生愈傷組織，且在保留一半原有懸浮培養(yǎng)液SUS-1的基礎(chǔ)上，加入新的玉米懸浮培養(yǎng)液SUS-1至三角瓶75ml刻度處，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的上述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)，以便獲得大量的愈傷組織；之后每周繼代一次，每次繼代均需剔除褐化死亡的愈傷組織，保留新生愈傷組織，且每次繼代均保留一半原有懸浮培養(yǎng)液SUS-1，并加入新的懸浮培養(yǎng)液SUS-1至三角瓶75ml刻度處，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將所述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)。所述初生愈傷組織懸浮培養(yǎng)35-45天后，優(yōu)選為40天，逐漸產(chǎn)生結(jié)構(gòu)松散的多個懸浮細胞團，將所述懸浮細胞團轉(zhuǎn)移至裝有75ml懸浮培養(yǎng)液SUS-2(MS鹽4.3g/L、MS維生素、脯氨酸3g/L、水解酪蛋白1.5g/L、蔗糖30g/L、Dicamba1.5mg/L，pH5.8)新的無菌三角瓶(150ml)中，每個三角瓶中接種20-30粒所述懸浮細胞團，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下，將密封的上述三角瓶置于轉(zhuǎn)速為100-150r/min恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)5-7天后，多個所述懸浮細胞團即可形成分散良好、增值迅速的玉米懸浮細胞系。4、農(nóng)桿菌介導的玉米懸浮細胞系遺傳轉(zhuǎn)化預培養(yǎng)：將所述玉米懸浮細胞系中制備的所述懸浮細胞團接種到PRE培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、水解酪蛋白0.1g/L、天冬氨酸0.79g/L、蔗糖30g/L、2,4-D2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，在溫度為28-30℃暗培養(yǎng)條件下預培養(yǎng)4-7天備用，優(yōu)選為5天。預處理：將預培養(yǎng)后的所述玉米懸浮細胞團進行農(nóng)桿菌侵染前預處理，即60℃烘箱熱處理5分鐘后超聲波處理5分鐘，預處理后的所述玉米懸浮細胞團用于后續(xù)農(nóng)桿菌侵染。農(nóng)桿菌菌液的制備：分別挑取含有DBN100677、DBN100678和DBN100774的農(nóng)桿菌單菌落，用槍頭分別在含有50mg/L卡那霉素的固體YP培養(yǎng)板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl5g/L、卡那霉素50mg/L、瓊脂粉15g/L)上劃線，在溫度28℃黑暗條件下培養(yǎng)2-3天。刮取所述固體YP培養(yǎng)板上的菌斑，在新的固體YP培養(yǎng)板上再培養(yǎng)1天，刮取共計培養(yǎng)3-4天的菌落，懸浮在5mL液體INF侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、Dicamba1.5mg/L、脯氨酸0.5mg/L、蔗糖30g/L、肌醇0.1g/L、乙酰丁香酮(AS)50mg/L，pH5.4)中，將農(nóng)桿菌菌液混勻，將其濃度調(diào)整為OD660＝0.5-0.6。農(nóng)桿菌侵染玉米懸浮細胞團：將上述預處理后的所述玉米懸浮細胞團分別浸泡于所述農(nóng)桿菌菌液(20-30ml)中5-25min，優(yōu)選25min；侵染結(jié)束后將農(nóng)桿菌菌液吸出，然后將所述玉米懸浮細胞團分別轉(zhuǎn)移至濾紙上，并在超凈工作臺中風干5-20min。農(nóng)桿菌與玉米懸浮細胞團共培養(yǎng)：將侵染風干后的所述玉米懸浮細胞團分別轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、N6維生素、脯氨酸0.5g/L、蔗糖30g/L、2,4-D2mg/L、乙酰丁香酮50mg/L、山梨醇36g/L、植物凝膠3g/L，pH5.4)上，在溫度20-28℃條件下暗培養(yǎng)至少2天，優(yōu)選為5天。由上述步驟獲得轉(zhuǎn)入DBN100677的玉米懸浮細胞系、轉(zhuǎn)入DBN100678的玉米懸浮細胞系和轉(zhuǎn)入DBN100774的玉米懸浮細胞系。四、sgRNA與內(nèi)含子嵌合方式的功能驗證分別取轉(zhuǎn)入DBN100678的玉米懸浮細胞團和轉(zhuǎn)入DBN100677的玉米懸浮細胞團作為樣品，參照Jefferson等(JeffersonR.A.,BurgessS.M.,HirshD.Beta-glucuronidasefromEscherichiacoliasagenefusionmarker.Proc.Natl.Acad.Sci.,1986,83:8447-8454)的方法，通過在染色溶液中37℃密封染色兩天，從組織化學上檢驗GUS的表達方式。所述染色溶液的主要成分為：0.1MNaPO4、0.01MEDTA(pH8.0)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀、0.5mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸(X-gluc)，其中X-gluc可以被轉(zhuǎn)基因細胞中產(chǎn)生的GUS蛋白原位分解并生成藍色沉淀，從而可以定位GUS蛋白的表達。染色后的玉米懸浮細胞團在解剖顯微鏡下檢查和照相。同時以轉(zhuǎn)入DBN100774的玉米懸浮細胞團作為對照，按照上述方法進行檢測分析，以上實驗設(shè)3次重復。玉米懸浮細胞團的GUS染色的實驗結(jié)果如圖3所示。實驗結(jié)果表明作為對照的轉(zhuǎn)入DBN100774的玉米懸浮細胞團染色面積最大，表明GUS蛋白表達完全；轉(zhuǎn)入GUS-02的玉米懸浮細胞團染色面積較小，表明以sgRNA插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式，有部分GUS蛋白可以表達，僅降低了GUS蛋白表達的強度，但并不影響部分內(nèi)含子剪切；轉(zhuǎn)入GUS-03的玉米懸浮細胞團基本上不顯色，表明將內(nèi)含子序列部分替換為sgRNA的嵌合方式，影響了內(nèi)含子的剪切從而使GUS蛋白完全不表達。上述篩選結(jié)果表明：sgRNA插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式(GUS-02核苷酸序列)不影響部分內(nèi)含子剪切，sgRNA能夠被轉(zhuǎn)錄，且可以由II型啟動子驅(qū)動表達。第二實施例、II型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性檢測一、II型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體構(gòu)建1、構(gòu)建重組克隆剪刀載體iGUS-02-Cas9核苷酸序列(如序列表中SEQIDNO:14所示，其中Cas9核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:15所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。將合成的iGUS-02-Cas9核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說明書進行，得到重組克隆剪刀載體DBN04-T，其構(gòu)建流程如圖4所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；iGUS-02-Cas9為嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:14；Cas9氨基酸序列如SEQIDNO:16所示)；MCS為多克隆位點)。按照第一實施例二中1的方法，將重組克隆剪刀載體DBN04-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，并對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆剪刀載體DBN04-T中插入的所述iGUS-02-Cas9核苷酸序列為序列表中SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，即iGUS-02-Cas9核苷酸序列正確插入。2、構(gòu)建無靶點重組表達載體向按照第一實施例二中2所述表達載體DBN-PMI引入GUUS表達盒(pr35S-02+GUUS+tNos)，得到表達載體DBN-PMI-GUUS，用于下述載體構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI分別酶切重組克隆剪刀載體DBN04-T和表達載體DBN-PMI-GUUS，將切下的iGUS-02-Cas9核苷酸序列片段插到表達載體DBN-PMI-GUUS中，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100777，其構(gòu)建流程如圖5所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S-01：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:9)；iGUS-02-Cas9：嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:14)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；pr35S-02：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:17)；GUUS：含有45CS1靶點序列的GUS基因(如SEQIDNO:18所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQIDNO:12)；LB：左邊界)。按照第一實施例二中2的方法，將重組表達載體DBN100777用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，堿法提取其質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI酶切后鑒定，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100777中插入的所述iGUS-02-Cas9核苷酸序列為序列表中SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，即iGUS-02-Cas9核苷酸序列正確插入。3、靶點的引物設(shè)計與靶點載體構(gòu)建根據(jù)Cas9蛋白識別PAM序列(NGG/NGGNG)的原則，在CRISPRDirect網(wǎng)站(http://crispr.dbcls.jp/)篩選到來源于玉米的一個靶點序列(20bp)，即45CS1靶點序列，如SEQIDNO:19所示。45CS1正向引物：ggtctccaaacCCCAAGAGCGGGCGAGGTAG，如SEQIDNO:20所示；45CS1反向引物：ggtctcgaaaacCTACCTCGCCCGCTCTTGGG，如SEQIDNO:21所示；其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護堿基，斜體小寫字母為酶切位點BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點BsaI的粘性末端，正常字體大寫字母為45CS1靶點序列或其反向互補序列。所述45CS1正向引物和所述45CS1反向引物分別包括45CS1靶點序列，二者反向互補，互為模板，用Pfu酶(NEB)進行PCR擴增，PCR體系如下：PCR反應(yīng)條件為：98℃預變性30s，然后進入下列循環(huán)：98℃變性10s，56-60℃退火30s，72℃延伸30s/kb，共30-32個循環(huán)，最后72℃延伸5-10min；于4℃保存。使用過柱純化試劑盒(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)對上述PCR產(chǎn)物過柱純化，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；BsaI酶切PCR產(chǎn)物和表達載體DBN100777，切膠回收對應(yīng)酶切產(chǎn)物后，將酶切后的表達載體DBN100777產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物按照1:10的比例用T4連接酶于溫度16℃下連接30min，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成靶點載體DBN100775，其構(gòu)建流程圖如圖6所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S-01：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:9)；45CS1：45CS1靶位點序列(SEQIDNO:19)；45CS1+iGUS-02-Cas9：包含45CS1靶點序列的嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:22)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；pr35S-02：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:17)；GUUS：含有45CS1靶點序列的GUS基因(如SEQIDNO:18所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQIDNO:12)；LB：左邊界)。按照第一實施例二中2的方法，將重組表達載體DBN100775用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，堿法提取其質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和AscI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明靶點載體DBN100775中GUS靶位點序列正確插入。4、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體DBN100777和DBN100775用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌LBA4404、3μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10min，37℃溫水浴10min；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對重組表達載體DBN100777和DBN100775酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100777和DBN100775結(jié)構(gòu)完全正確。二、瞬時轉(zhuǎn)化的玉米懸浮細胞系的獲得玉米懸浮細胞系的獲得及農(nóng)桿菌介導的玉米懸浮細胞系的遺傳轉(zhuǎn)化如第一實施例三中所述。由此獲得轉(zhuǎn)入DBN100777的玉米懸浮細胞系、轉(zhuǎn)入DBN100775的玉米懸浮細胞系和轉(zhuǎn)入DBN100774的玉米懸浮細胞系。三、II型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性檢測按照第一實施例四中所述的方法，檢測轉(zhuǎn)入DBN100775的玉米懸浮細胞系的GUS活性，同時以轉(zhuǎn)入DBN100777的玉米懸浮細胞團作為陰性對照，以轉(zhuǎn)入DBN100774的玉米懸浮細胞團作為陽性對照，按照上述方法進行檢測分析，以上實驗設(shè)3次重復。玉米懸浮細胞團的GUS染色的實驗結(jié)果如圖7所示：轉(zhuǎn)入DBN100775的玉米懸浮細胞團染色面積較大，基本上與陽性對照染色程度相當，而陰性對照則完全不顯色。上述實驗結(jié)果表明：轉(zhuǎn)入DBN100775的玉米懸浮細胞團中Cas9蛋白能夠被正常翻譯且sgRNA能夠被轉(zhuǎn)錄，兩者相互作用，剪切GUUS之間的45CS1靶點，使得GUUS恢復為GUS蛋白，并可以被染色。由此可見，當靶點和sgRNA采用插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式，并有效連接于Cas9蛋白時，在II型啟動子的驅(qū)動下，Cas9蛋白能夠被正常翻譯且sgRNA能夠被轉(zhuǎn)錄，兩者相互作用，剪切靶點位置，即II型啟動子驅(qū)動下的Cas9/sgRNA(靶點和sgRNA插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式)系統(tǒng)能夠正常行使剪切和/或編輯功能。第三實施例、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后驗證組成型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性一、水稻基因組靶點的選擇根據(jù)Cas9蛋白識別PAM序列(NGG/NGGNG)的原則，在CRISPR-Plant網(wǎng)站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)篩選到來源于水稻的2個靶點序列，具體信息如下：靶點1序列：TTTACTGGGAGTTATGAAAC，如SEQIDNO:23所示；靶點2序列：GGACGAGTCCAGATGCACCG，如SEQIDNO:24所示。二、組成型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體構(gòu)建1、構(gòu)建無靶點重組表達載體向按照第一實施例二中2所述pDBN骨架載體引入花椰菜花葉病毒35S啟動子和終止子以及Hpt表達盒(prUbi+Hpt+tNos)，得到表達載體DBN-Hpt，用于下述載體構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶KpnI和SpeI分別酶切第二實施例一中1所述重組克隆剪刀載體DBN04-T和表達載體DBN-Hpt，將切下的iGUS-02-Cas9核苷酸序列片段插到表達載體DBN-Hpt中，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100000，其載體結(jié)構(gòu)如圖8所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S-01：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:9)；iGUS-02-Cas9：嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:14)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；Hpt：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(SEQIDNO:25)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；LB：左邊界)。按照第一實施例二中2的方法，將重組表達載體DBN100000用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，堿法提取其質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI和AscI酶切后鑒定，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100000中插入的所述iGUS-02-Cas9核苷酸序列為序列表中SEQIDNO:14所示的核苷酸序列，即iGUS-02-Cas9核苷酸序列正確插入。2、靶點的引物設(shè)計與靶點載體構(gòu)建選擇靶點1序列，如SEQIDNO:23所示；因此靶點1正向引物：ggtctccaaacTTTACTGGGAGTTATGAAAC，如SEQIDNO:26所示；靶點1反向引物：ggtctcgaaaacGTTTCATAACTCCCAGTAAA，如SEQIDNO:27所示；選擇靶點2序列，如SEQIDNO:24所示；因此靶點2正向引物：ggtctccaaacGGACGAGTCCAGATGCACCG，如SEQIDNO:28所示；靶點2反向引物：ggtctcgaaaacCGGTGCATCTGGACTCGTCC，如SEQIDNO:29所示；其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護堿基，斜體小寫字母為酶切位點BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點BsaI的粘性末端，正常字體大寫字母為靶點序列或其反向互補序列。按照第二實施例一中3的方法，構(gòu)建成靶點1載體DBN-A，其載體結(jié)構(gòu)如圖9所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S-01：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:9)；靶點1：靶點1序列(SEQIDNO:23)；靶點1+iGUS-02-Cas9：包含靶點1序列的嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:30)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；Hpt：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(SEQIDNO:25)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；LB：左邊界)。按照第二實施例一中3的方法，構(gòu)建成靶點2載體DBN-B，其載體結(jié)構(gòu)如圖10所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S-01：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:9)；靶點2：靶點2序列(SEQIDNO:24)；靶點2+iGUS-02-Cas9：包含靶點2序列的嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:31)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；Hpt：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(SEQIDNO:25)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；LB：左邊界)。按照第一實施例二中2的方法，將靶點1載體DBN-A和靶點2載體DBN-B分別用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，堿法提取其質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)KpnI和AscI酶切鑒定后，分別對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明靶點1載體DBN-A和靶點2載體DBN-B中靶點1序列和靶點2序列均正確插入。3、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的靶點1載體DBN-A和靶點2載體DBN-B用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌LBA4404、3μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10min，37℃溫水浴10min；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對靶點1載體DBN-A和靶點2載體DBN-B酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明靶點1載體DBN-A和靶點2載體DBN-B結(jié)構(gòu)完全正確。三、獲得轉(zhuǎn)化的水稻植株對于農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化，簡要地，把水稻品種華占種子(華占水稻材料由北京金色農(nóng)華種業(yè)有限公司提供)接種在誘導培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、麥芽糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，從水稻成熟胚誘導出愈傷組織(步驟1：愈傷誘導步驟)，之后，優(yōu)選愈傷組織，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸愈傷組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⑺霭悬c1載體DBN-A和所述靶點2載體DBN-B分別傳遞至愈傷組織上的至少一個細胞(步驟2：侵染步驟)。在此步驟中，愈傷組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD660＝0.3，侵染培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、pH5.4))中以啟動接種。愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟3：共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素150-250mg/L)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟4：恢復步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的愈傷組織在含選擇劑(潮霉素)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟5：選擇步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、潮霉素50mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟6：再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(N6分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述N6分化培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、潮霉素50mg/L、6-芐氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)。在溫室中，每天于28℃下培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化的T0水稻植株。四、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后組成型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能驗證測序結(jié)果如表1所示，獲得靶點1突變體DBN-A水稻T0植株數(shù)為25株，其突變效率(突變效率＝對應(yīng)突變體數(shù)量/突變體T0植株總數(shù)×100％)為35.2％；獲得靶點2突變體DBN-B水稻T0植株數(shù)為21株，其突變效率為29.5％。表1、組成型啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后的水稻基因組上應(yīng)用的實驗結(jié)果載體/項目對應(yīng)突變體數(shù)(株)突變效率(％)DBN-A(靶點1)2516.2DBN-B(靶點2)2170常規(guī)CRISPR/Cas9載體(靶點1)3219常規(guī)CRISPR/Cas9載體(靶點2)2581上述實驗結(jié)果表明：穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述靶點1載體DBN-A和所述靶點2載體DBN-B的水稻植株中，sgRNA能夠通過組成型啟動子轉(zhuǎn)錄，并可與Cas9蛋白結(jié)合行使編輯功能以獲得突變體，且突變效率與常規(guī)CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)相當。由此可見，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化體中，當靶點和sgRNA采用插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式，并有效連接于Cas9蛋白時，在II型組成型啟動子的驅(qū)動下，Cas9蛋白能夠被正常翻譯且sgRNA能夠被轉(zhuǎn)錄，兩者相互作用，剪切靶點位置，即II型組成型啟動子驅(qū)動下的Cas9/sgRNA(靶點和sgRNA插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式)系統(tǒng)能夠正常行使剪切和/或編輯功能，且突變效率與常規(guī)CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)相當。第四實施例、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后驗證特異性啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性一、玉米基因組靶點的選擇根據(jù)Cas9蛋白識別PAM序列(NGG/NGGNG)的原則，在CRISPR-Plant網(wǎng)站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)篩選到來源于玉米一個基因上的2個靶點序列，具體信息如下：靶點3：ATCATACCTGAGCAGCCTCC，如SEQIDNO:32所示；靶點4：CGAACGACCTCGATGTGCAC，如SEQIDNO:33所示。二、特異性啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體構(gòu)建1、構(gòu)建無靶點重組表達載體將第二實施例一中2所述DBN100777的花椰菜花葉病毒啟動子pr35S-01更換為花粉特異表達啟動子prAmy，構(gòu)建成重組表達載體DBN100778，其載體結(jié)構(gòu)如圖11所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；prAmy：玉米α淀粉酶基因啟動子(SEQIDNO:34)；iGUS-02-Cas9：嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:14)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；pr35S-02：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:17)；GUUS：含有45CS1靶點序列的GUS基因(如SEQIDNO:18所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQIDNO:12)；LB：左邊界)。按照第一實施例二中2的方法，將重組表達載體DBN100778用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，堿法提取其質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI酶切后鑒定，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100778構(gòu)建正確。2、靶點的引物設(shè)計與靶點載體構(gòu)建選擇靶點3序列，如SEQIDNO:32所示；因此靶點3正向引物：ggtctccaaacATCATACCTGAGCAGCCTCC，如SEQIDNO:35所示；靶點3反向引物：ggtctcgaaaacGGAGGCTGCTCAGGTATGAT，如SEQIDNO:36所示；選擇靶點4序列，如SEQIDNO:33所示；因此靶點4正向引物：ggtctccaaacCGAACGACCTCGATGTGCAC，如SEQIDNO:37所示；靶點4反向引物：ggtctccaaaacGTGCACATCGAGGTCGTTCG，如SEQIDNO:38所示；其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護堿基，斜體小寫字母為酶切位點BsaI，帶下劃線的小寫字母為酶切位點BsaI的粘性末端，正常字體小寫字母為靶點序列或其反向互補序列。按照第二實施例一中3的方法，構(gòu)建成靶點3載體DBN-C，其載體結(jié)構(gòu)如圖12所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；prAmy：玉米α淀粉酶基因啟動子(SEQIDNO:34)；靶點3：靶點3序列(SEQIDNO:32)；靶點3+iGUS-02-Cas9：包含靶點3序列的嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:39)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；pr35S-02：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:17)；GUUS：含有45CS1靶點序列的GUS基因(如SEQIDNO:18所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQIDNO:12)；LB：左邊界)按照第二實施例一中3的方法，構(gòu)建成靶點4載體DBN-D，其載體結(jié)構(gòu)如圖13所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；prAmy：玉米α淀粉酶基因啟動子(SEQIDNO:34)；靶點4：靶點4序列(SEQIDNO:33)；靶點4+iGUS-02-Cas9：包含靶點4序列的嵌合序列iGUS-02+Cas9核苷酸序列(SEQIDNO:40)；t35S：花椰菜花葉病毒35S終止子(SEQIDNO:10)；pr35S-02：花椰菜花葉病毒35S啟動子(SEQIDNO:17)；GUUS：含有45CS1靶位點序列的GUS基因(如SEQIDNO:18所示)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDNO:13)；prUbi：玉米泛素(Ubiquitin)基因啟動子(SEQIDNO:11)；PMI：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQIDNO:12)；LB：左邊界)按照第一實施例二中2的方法，將靶點3載體DBN-C和靶點4載體DBN-D分別用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，堿法提取其質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)BamHI和KpnI酶切鑒定后，分別對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明靶點3載體DBN-C和靶點4載體DBN-D中靶點3序列和靶點4序列均正確插入。3、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的靶點3載體DBN-C和靶點4載體DBN-D用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌LBA4404、3μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10min，37℃溫水浴10min；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶對靶點3載體DBN-C和靶點4載體DBN-D酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明靶點3載體DBN-C和靶點4載體DBN-D結(jié)構(gòu)完全正確。三、獲得轉(zhuǎn)化的玉米植株可以采用下述方法嗎？按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31(Z31)的幼胚與第四實施例二中3所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第四實施例二中1和2構(gòu)建的重組表達載體DBN100778、DBN-C和DBN-D中的T-DNA轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入DBN100778的玉米植株、轉(zhuǎn)入DBN-C的玉米植株和轉(zhuǎn)入DBN-D的玉米植株。對于農(nóng)桿菌介導的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⒛軌驅(qū)⒅亟M表達載體DBN100778、DBN-C和DBN-D中的T-DNA傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1：侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD660＝0.4-0.6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2：共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復”步驟。在“恢復”步驟中，恢復培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3：恢復步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4：選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5：再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于28℃下培養(yǎng)16小時，再于20℃下培養(yǎng)8小時。四、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后特異性啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能驗證由上述方法分別獲得19個株系轉(zhuǎn)入DBN-C的T0玉米植株和21個株系轉(zhuǎn)入DBN-D的T0玉米植株。在溫室中培養(yǎng)T0植株，分別收獲每個株系的T1種子。將19個株系轉(zhuǎn)入DBN-C的T0玉米植株和21個株系轉(zhuǎn)入DBN-D的T0玉米植株的T1種子(每個株系播種20粒種子)在溫室中進行小盆種植，播種后10天，獲得19個株系轉(zhuǎn)入DBN-C的T1玉米植株和21個株系轉(zhuǎn)入DBN-D的T1玉米植株，分別提取T1玉米植株的葉片DNA并通過測序進行突變效率的檢測。測序結(jié)果如表2所示，3個株系轉(zhuǎn)入DBN-C的T0玉米植株發(fā)生了突變，其突變效率(突變效率＝對應(yīng)突變的轉(zhuǎn)入DBN-C的T0玉米植株的株系數(shù)/轉(zhuǎn)入DBN-C的T0玉米植株的株系總數(shù)×100％)為21％；2個株系轉(zhuǎn)入DBN-D的T0玉米植株發(fā)生了突變，其突變效率為9.5％。表2、特異性啟動子驅(qū)動CRISPR/Cas9系統(tǒng)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后的玉米基因組上應(yīng)用的實驗結(jié)果載體/項目對應(yīng)突變體數(shù)(株系)總數(shù)(株系)突變效率(％)DBN-C(靶點3)41921DBN-D(靶點4)2219.5上述實驗結(jié)果表明：穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述靶點3載體DBN-C和所述靶點4載體DBN-D的玉米植株中，sgRNA能夠通過特異性啟動子轉(zhuǎn)錄，并可與Cas9蛋白結(jié)合行使編輯功能以獲得突變體。由此可見，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化體中，當靶點和sgRNA采用插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式，并有效連接于Cas9蛋白時，在II型特異性啟動子的驅(qū)動下，Cas9蛋白能夠被正常翻譯且sgRNA能夠被轉(zhuǎn)錄，兩者相互作用，剪切靶點位置，即II型特異性啟動子驅(qū)動下的Cas9/sgRNA(靶點和sgRNA插入到內(nèi)含子內(nèi)部的嵌合方式)系統(tǒng)能夠正常行使剪切和/或編輯功能。綜上所述，本發(fā)明將靶點和sgRNA與Cas9蛋白整合在一個表達盒中，并使用II型啟動子驅(qū)動表達，不僅拓寬了sgRNA可利用的啟動子范圍，有利于實現(xiàn)特異組織的基因編輯，同時消除了對于靶點第一位堿基的限制，擴大了靶點選擇范圍，而且可以減少載體構(gòu)建過程中表達盒的數(shù)量、簡化載體，還能避免由于多個表達盒使用相同的啟動子而發(fā)生重組導致部分元件的丟失的問題；本發(fā)明提供的由II型啟動子驅(qū)動的基因編輯系統(tǒng)獲得的編輯效率與常規(guī)體系相當，并且可以直接應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。當前第1頁1 2 3