本發(fā)明屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于氟硼吡咯的Cys熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)以及谷胱甘肽(GSH)統(tǒng)稱為生物硫醇，他們?cè)谏顒?dòng)中發(fā)揮著重要的作用(Z.A.Wood,E.Schroder,J.R.Harris and L.B.Poole,Trends.Biochem.Sci.,2003,28,32-40.)。這些硫醇在生物體內(nèi)的濃度的變化與某些生命過(guò)程正常與否息息相關(guān)(Y.Murata,T.Shimamura and J.Hamuro,Int.Immunol.,2002,14,201-212.)。研究表明，過(guò)高的Cys濃度是心血管疾病以及阿爾茨海默氏癥的一大誘因，并且血漿中的Cys濃度與出生缺陷和老年癡呆癥有很大關(guān)系(S.E.Vollset,H.Refsum,L.MIrgens,B.M.Emblem,A.Tverdal,H.K.Gjessing,A.L.B.Monsen,and P.M.Ueland,Am.J.Clin.Nutr.,2000,71,962-968.)。因此，找到一種準(zhǔn)確、高效的在生物樣品內(nèi)檢測(cè)Cys含量的方法有著重要的意義。

熒光檢測(cè)方法以其高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，并且可應(yīng)用于細(xì)胞成像等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注(文獻(xiàn)1:A.P.de Silva,H.Q.N.Gunaratne,T.Gunnlaugsson,A.J.M.Huxley,C.P.McCoy,J.T.Rademacher and T.E.Rice,Chem.Rev.,1997,97,1515-1566；文獻(xiàn)2:G.Aragay,J.Pons and A.Merkoci,Chem.Rev.,2011,111,3433-3458；文獻(xiàn)3:K.P.Carter,A.M.Young and A.E.Palmer,Chem.Rev.,2014,114,4564-4601.)。近年來(lái)，報(bào)道了一些用于檢測(cè)生物硫醇的熒光分子探針(文獻(xiàn)1:H.S.Jung,X.Chen,J.S.Kim and J.Yoon,Chem.Soc.Rev.,2013,42,6019-6031；文獻(xiàn)2:L.Y.Niu,Y.Z.Chen,H.R.Zheng,L.Z.Wu,C.H.Tung and Q.Z.Yang,Chem.Soc.Rev.,2015,DOI:10.1039/c5cs00152h；文獻(xiàn)3:Q.Miao,Q.Li,Q.Yuan,L.Li,Z.Hai,S.Liu,and G.Liang,Anal.Chem.2015,87,3460-3466；文獻(xiàn)4:F.Kong,R.Liu,R.Chu,X.Wang,K.Xu and B.Tang,Chem.Commun.,2013,49,9176-9178；文獻(xiàn)5:W.Lin,L.Long,L.Yuan,Z.Cao,B.Chen,and W.Tan,Org.Lett.,2008,10,5577-5580.)，其中不乏對(duì)Cys有高選擇性的熒光分子探針(文獻(xiàn)1:H.Li,J.Fan,J.Wang,M.Tian,J.Du,S.Sun,P.Sun and X.Peng,Chem.Commun.,2009,39,5904-5906；文獻(xiàn)2:J.Zhang,J.Wang,J.Liu,L.Ning,X.Zhu,B.Yu,X.Liu,X.Yao and H.Zhang,Anal.Chem.,2015,87,4856-4863；文獻(xiàn)3:Y.Liu,D.Yu,S.Ding,Q.X.,J.Guo and G.Feng,ACS Appl.Mater.Interfaces,2014,6,17543-17550；文獻(xiàn)4:B.Liu,J.Wang,G.Zhang,R.Bai and Y.Pang,ACS Appl.Mater.Interfaces,2014,6,4402-4407；文獻(xiàn)5:L.Wang,J.Du and D.Cao,Sens.Actuators B,2014,205,281-288；文獻(xiàn)6:Y.Liu,Y.Liu,W.Liu and S.Liang,Spectrochim.Acta A,2015,137,509-515.)。但由于Hcy與Cys結(jié)構(gòu)上的相似性，大部分探針不能顯著區(qū)分Hcy與Cys(文獻(xiàn)1:H.Chen,Q.Zhao,Y.Wu,F.Li,H.Yang,T.Yi and C.Huang,Inorg.Chem.,2007,46,11075-11081；文獻(xiàn)2:H.Y.Lee,Y.P.Choi,S.Kim,T.Yoon,Z.Guo,S.Lee,K.M.K.Swamy,G.Kim,J.Y.Lee,I.Shin and J.Yoon,Chem.Commun.,2014,50,6967-6969；文獻(xiàn)3:A.Barve,M.Lowry,J.O.Escobedo,K.T.Huynh,L.Hakuna and R.M.Strongin,Chem.Commun.,2014,50,8219-8222；文獻(xiàn)4:H.Peng,K.Wang,C.Dai,S.Williamson and B.Wang,Chem.Commun.,2014,50,13668-13671.)。因此合成一個(gè)高選擇性、高靈敏度并可應(yīng)用于檢測(cè)生物體Cys的熒光分子仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。

氟硼吡咯(BODIPY)化合物，以其在水相中高的熒光量子產(chǎn)率、pH影響小、可見(jiàn)激發(fā)與可見(jiàn)發(fā)射以及優(yōu)良的耐光性等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)常被用作熒光探針?lè)肿拥睦硐肴玖?文獻(xiàn)1:N.Boens,V.Leen and W.Dehaen,Chem.Soc.Rev.,2012,41,1130-1172；文獻(xiàn)2:J.J.Shie,Y.C.Liu,Y.M.Lee,C.Lim,J.M.Fang and C.H.Wong,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,9953-9961；)。據(jù)報(bào)道，一些氟硼吡咯衍探針被用于檢測(cè)生物硫醇(文獻(xiàn)1:Y.Zhang,X.Shao,Y.Wang,F.Pan,R.Kang,F.Peng,Z,Huang,W.Zhang and W.Zhao,Chem.Commun.,2015,51,4245-4248；文獻(xiàn)2:M.Y.Jia,L,Y,Niu,Y.Zhang,Q.Z.Yang,C.H.Tung,Y.F.Guan and L.Feng,ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7,5907-5914；文獻(xiàn)3:J.Shao,H.Sun,H.Guo,S.Ji,J.Zhao,W.Wu,X.Yuan,C.Zhang and T.D.James,Chem.Sci.,2012,3,1049-1061；)。但是，目前為止，還沒(méi)有用于直接快速檢測(cè)Cys的氟硼吡咯類熒光分子探針。因此合成一個(gè)基于氟硼吡咯類的可直接檢測(cè)Cys的高選擇性、高靈敏度的熒光分子探針具有重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)所提出的要求，本發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了深入研究，在付出了大量創(chuàng)造性勞動(dòng)后，提供了一種高靈敏度，高選擇性的基于氟硼吡咯衍生物結(jié)構(gòu)新穎的Cys熒光探針。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種基于氟硼吡咯衍生物的Cys熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

一種基于氟硼吡咯衍生物的Cys熒光探針的制備方法。步驟如下：1)在100mL圓底燒瓶中，依次加入4-羥基苯甲醛和2,4-二甲基吡咯，其比例為1:2.2，加入30mL二氯甲烷作為溶劑，室溫下磁力攪拌，在N₂保護(hù)的環(huán)境下滴加1滴三氟乙酸作為催化劑，繼續(xù)攪拌4～6h后，將溶解在5mL二氯甲烷中的二氯二氰基苯醌溶液逐滴加入到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌約0.5～1h，然后，向反應(yīng)液中依次加入0.2mL三乙胺以及0.2mL三氟化硼乙醚，當(dāng)有黃綠色熒光物產(chǎn)生時(shí)，反應(yīng)完成。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，粗產(chǎn)品以二氯甲烷/己烷1:1(體積比)為淋洗劑，柱層析色譜分離提純得紅色固體(化合物2)。

2)將化合物2溶解在二氯甲烷中，在0℃條件下，攪拌下逐滴滴加丙烯酰氯(1:1)和催化量的三乙胺，在該溫度下攪拌90分鐘以后，繼續(xù)在室溫條件下繼續(xù)攪拌十二小時(shí)，反應(yīng)完成。減壓蒸餾除去溶劑，粗產(chǎn)品用二氯甲烷/己烷為1:3(體積比)的洗脫劑柱層析分離得紅色固體(化合物1)。一種基于氟硼吡咯衍生物的熒光探針的性能研究。制備反應(yīng)式如下：

本發(fā)明的有益效果是：首先，研究了探針的選擇性，檢測(cè)了探針與Cys、Hcy、GSH和其他19種氨基酸(Ala,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Trp,Val,Asn,Gln,Gly,Ser,Thr,Tyr,Asp,Glu,Arg,His,Lys)的熒光響應(yīng)情況。加入Hcy和GSH及其它19種氨基酸，熒光強(qiáng)度都沒(méi)有明顯的改變，就連與Cys結(jié)構(gòu)極為相似的Hcy，熒光也沒(méi)有明顯的變化；而相同的條件下加入Cys，在517nm處熒光發(fā)射峰明顯增強(qiáng)，由此可見(jiàn)，熒光探針對(duì)Cys有較好的選擇性。接著，研究了該探針的熒光光譜性質(zhì)，加入Cys之前，熒光探針在517nm基本上無(wú)熒光；隨著Cys的加入，在517nm處熒光出現(xiàn)明顯的大幅度的增強(qiáng)，并且隨著Cys濃度的增大，探針?lè)肿拥臒晒鈴?qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)加入3當(dāng)量的Cys時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)23倍，說(shuō)明該探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys高靈敏的檢測(cè)。其次，還研究了探針的紫外吸收光譜，在沒(méi)有加入Cys時(shí)，探針在500處有較弱的吸收峰，加入Cys之后，在500nm處出現(xiàn)吸收峰的大幅度的增強(qiáng)。最后，研究了pH值對(duì)熒光探針測(cè)定Cys的影響和熒光探針對(duì)Cys的響應(yīng)時(shí)間，當(dāng)pH值在6.0到8.0之間時(shí)，不影響熒光探針對(duì)Cys的測(cè)定。此外，該熒光探針響應(yīng)迅速，響應(yīng)時(shí)間在6分鐘以內(nèi)。

一種基于氟硼吡咯衍生物的熒光探針的應(yīng)用，將該熒光探針應(yīng)用于細(xì)胞成像中，細(xì)胞內(nèi)的Cys含量非常豐富，因此直接向細(xì)胞內(nèi)加入探針，能檢測(cè)到強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)。但是，當(dāng)在加入探針之前加入一定量的硫醇抑制劑NEM時(shí)，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有熒光信號(hào)。然而，當(dāng)再向此細(xì)胞中加入Cys時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)又出現(xiàn)了很強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)。這些現(xiàn)象表明該熒光探針可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Cys含量，為進(jìn)一步監(jiān)控、檢測(cè)人體的一些病變提供一種可靠的方法。

附圖說(shuō)明

圖1為熒光探針的合成路線。

圖2為熒光探針與不同濃度的Cys作用后的熒光光譜圖。

橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。熒光探針的濃度均為10μM，Cys濃度分別為：0,0.2,0.8,2,5,10,15,20,25,30μM。熒光激發(fā)波長(zhǎng)為480nm。插圖為探針對(duì)Cys濃度的線性響應(yīng)圖。

圖3為熒光探針的選擇性圖。

橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。熒光探針的濃度均為10μM，Cys濃度為30μM，Hcy、GSH及其它19種氨基酸的濃度均為1mM。

圖4為熒光探針與Cys作用后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。

橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為吸光度。熒光探針的濃度均為10μM，Cys濃度為30μM。

圖5為pH對(duì)熒光探針的影響圖。

圖6為熒光探針在不同Cys濃度(0.2,5,10,20μM)下，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線圖。

圖7為細(xì)胞毒性試驗(yàn)。橫坐標(biāo)為熒光探針的濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞的存活率。

圖8為Cys的細(xì)胞成像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不限于此。

實(shí)施例1：

熒光探針的合成

合成路線如圖1所示。

化合物2的合成：在100mL的圓底燒瓶中，依次加入4-羥基苯甲醛(2.0mmol,0.36g)和2,4-二甲基吡咯(4.4mmol,0.42g)，再加入30mL二氯甲烷作為溶劑。室溫下磁力攪拌，在N₂保護(hù)的環(huán)境下滴加1滴三氟乙酸作為催化劑。繼續(xù)攪拌約6h后，將溶解在5mL二氯甲烷中的二氯二氰基苯醌(2.0mmol,0.46g)逐滴加入到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌約0.5h。然后，向反應(yīng)液中依次加入0.4mL三乙胺以及0.4mL三氟化硼乙醚。當(dāng)有黃綠色熒光物產(chǎn)生時(shí)，反應(yīng)完成。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，二氯甲烷/己烷1:1(體積比)為淋洗劑，柱層析色譜分離提純得紅色固體0.38g，產(chǎn)率為56.0％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.94(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(d,J＝7.7Hz,2H),5.97(s,2H),5.06(s,1H)，2.49(s,6H),1.36(s,6H).MS(TOF)m/z 340.1.

Cys探針(化合物1)的合成：在100mL的圓底燒瓶中，將化合物2(1.0mmol,0.34g)溶解在25mL二氯甲烷中，在0℃條件下，攪拌下逐滴滴加丙烯酰氯(1.2mmol,0.10g)和三乙胺(0.1mL)，在該溫度下攪拌90分鐘以后，繼續(xù)在室溫條件下繼續(xù)攪拌12小時(shí)，反應(yīng)完成。減壓蒸餾除去溶劑，粗產(chǎn)品用二氯甲烷/己烷為1:3(體積比)的洗脫劑柱層析分離得紅色固體0.25g，產(chǎn)率為64.0％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.03(d,J＝8.0Hz,2H),7.51(d,J＝7.4Hz,2H),6.66(d,J＝12.0Hz,1H),6.48-6.40(m,1H),6.23(d,J＝7.5Hz,1H),6.10(s,2H),2.56(s,6H),1.35(s,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):191.5,164.3,156.3,142.8,141.4,139.7,136.7,130.8,130.4,129.2,121.6,14.7,14.6.MS(TOF)m/z 394.2.Anal.calcd.for C₂₂H₂₁BF₂N₂O₂(1):C,68.21；H,5.44；N,7.59.Found:C,68.25；H,5.43；N,7.58.結(jié)果表明，所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例2：

熒光探針與Cys作用的溶液配制

將一定量的熒光探針溶解在EtOH中，得到濃度為1.0×10^-4mol·L^-1探針的備用溶液。將一定量的Cys用水溶解后，轉(zhuǎn)移到500mL的容量瓶中，加水至刻度線，得到濃度為1.0×10^-2mol·L^-1的Cys。將1.0×10^-2mol·L^-1的Cys溶液用水逐漸稀釋，得到1.0×10^-3-1.0×10^-8mol·L^-1的Cys水溶液。將1.0mL探針的備用溶液和1.0mL的Cys水溶液加入到10mL的容量瓶中，用緩沖溶液定容后，得到濃度為1.0×10^-5mol·L^-1的熒光探針和1.0×10^-3-1.0×10^-8mol·L^-1的Cys混合待測(cè)溶液。

實(shí)施例3：

熒光探針與Cys作用的熒光光譜的測(cè)定

用pH值為7.4的緩沖溶液為溶劑測(cè)定了熒光探針與Cys作用的熒光光譜，結(jié)果如圖2。熒光探針的濃度為10μM，Cys的濃度依次為0,0.2,0.8,2,5,10,15,20,25,30μM，激發(fā)波長(zhǎng)固定為480nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為500～600nm，狹縫寬度為5.0nm/5.0nm。從圖3可以看出，加入Cys之前，熒光探針在517nm處有較弱的熒光發(fā)射峰。隨著Cys的加入，在517nm處發(fā)射峰大幅度的增強(qiáng)，并且隨著Cys濃度的增大，探針的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)加入30μM的Cys時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)至未加入Cys時(shí)的23倍。這是因?yàn)樘结樂(lè)肿拥娜┗cCys反應(yīng)生成七元環(huán)化合物。如圖3的插圖所示，熒光強(qiáng)度跟Cys的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性范圍是2.0×10^-7～3.0×10^-5M，檢測(cè)限是2×10^-8M。所用的熒光測(cè)定儀器為Perkin Elmer LS 55熒光分光光度計(jì)。

實(shí)施例4：

熒光探針對(duì)Cys測(cè)定的選擇性

在濃度為10μM的熒光探針溶液中加入Hcy、GSH及其它19種氨基酸(1mM)前后的熒光強(qiáng)度變化。從圖3中可以看出，加入其它的生物硫醇和氨基酸，熒光強(qiáng)度都沒(méi)有明顯的改變，就連與Cys結(jié)構(gòu)極為相似的Hcy，熒光也沒(méi)有變化；而相同的條件下加入Cys，在517nm處出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。這些結(jié)果表明，熒光探針對(duì)Cys有較好的選擇性。

實(shí)施例5：

熒光探針與Cys作用的紫外可見(jiàn)吸收光譜性質(zhì)的測(cè)定

圖4為熒光探針與Hcy作用后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖，Cys的加入量為30μM。從圖4中可以看出，沒(méi)有加入Cys時(shí)，探針在500nm處有較弱的吸收峰，加入Cys之后，在該處的吸收峰大幅度增強(qiáng)。紫外可見(jiàn)吸收光譜測(cè)定用的儀器為Perkin Elmer Lambda 25型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

實(shí)施例6：

溶液pH值對(duì)熒光探針測(cè)定Cys的熒光性質(zhì)的影響

我們考察了pH值對(duì)熒光探針測(cè)定Cys的熒光強(qiáng)度的影響。我們研究的pH范圍為2.0～12.0，熒光探針的濃度為10μM，Cys的濃度為30μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，熒光探針隨著pH的變化，熒光強(qiáng)度基本不變，說(shuō)明pH對(duì)探針本身沒(méi)有很大的影響。然而，加入Hcy之后，在pH<6范圍內(nèi)隨pH的降低，熒光強(qiáng)度逐漸降低。在pH>8范圍內(nèi)，隨pH的增大，熒光強(qiáng)度逐漸降低。pH在6～8的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度基本不變。綜上所述，當(dāng)pH值在6.0到8.0之間時(shí)，不影響熒光探針對(duì)Hcy的測(cè)定，這非常有利于該探針用于實(shí)際樣品中Cys的測(cè)定。

實(shí)施例7：

熒光探針與Cys作用的響應(yīng)時(shí)間的測(cè)定

為了研究熒光探針對(duì)Hcy的響應(yīng)時(shí)間，我們考察了熒光探針在不同Cys濃度下(0.2,5,10,20μM)的熒光光譜的變化情況，其結(jié)果如圖6。從圖中可以看出，該探針對(duì)Cys的響應(yīng)時(shí)間不到6分鐘，滿足在實(shí)際樣品中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)對(duì)響應(yīng)時(shí)間的要求。從圖6我們還可以看出，熒光強(qiáng)度一旦達(dá)到最大值后，在之后的時(shí)間里，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)，這表明此熒光探針光穩(wěn)定性好。

實(shí)施例8：

熒光探針在活細(xì)胞中的應(yīng)用

首先，我們做了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，如圖7所示，當(dāng)加入0～20μM Cys探針，20min之后，細(xì)胞的成活率均在97％以上，因此可以說(shuō)明，該熒光探針可應(yīng)用于檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的Cys，并且毒性較小。

一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的Cys含量非常豐富，因此直接向細(xì)胞內(nèi)加入探針，也能檢測(cè)到強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，如圖8a所示。但是，當(dāng)在加入探針之前加入一定量的硫醇抑制劑NEM時(shí)，如圖8b所示，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有熒光信號(hào)。然而當(dāng)再向此細(xì)胞中加入Cys時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)又出現(xiàn)了很強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，如圖8c所示。這表明該探針具有細(xì)胞穿透性，能夠?qū)崿F(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)Cys濃度的檢測(cè)。