本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速鑒別水中10-50微米活體生物的方法。

背景技術(shù)：

國際海事組織(IMO)在2004年頒發(fā)的《國際船舶壓載水及其沉積物控制和管理公約》中明確規(guī)定了壓載水排放時最大允許的存活生物密度。其中，10-50微米存活生物在排放時的最大允許密度為每毫升里不超過10個細(xì)胞。

國際到港船舶壓載水的檢測難點在于到達(dá)目的港后排放時活體生物數(shù)量的快速檢測。一般意義上，人們認(rèn)為能夠運動的完整個體可以看做是一個活體。絕大多數(shù)≥50微米生物為動物，它們是可以自由活動的，因此很容易辨認(rèn)其死活。10-50微米生物(主要指浮游植物)因個體小、運動現(xiàn)象不明顯且對鑒定人員的技術(shù)要求較高等原因，一直被看作是壓載水活體生物檢測中的難點。另外，許多傳統(tǒng)的浮游植物活體計數(shù)方法為間接計數(shù)法或者檢測周期較長都不適用于壓載水中。如，放射性元素標(biāo)記法(14CO₂)是一種很好的間接方法，通過測定放射性標(biāo)記分子的產(chǎn)生換算出活體生物數(shù)量。但不同物種的換算系數(shù)不同，所以此方法僅適用于純種生物的活體計數(shù)，不適合于測定壓載水中10-50微米生物群落的數(shù)量。傳統(tǒng)的顯微鏡法在10-50微米活體生物的檢測中是必要的。有專家提出，利用葉綠素?zé)晒夥▉碛嫈?shù)細(xì)胞，但缺陷是被福爾馬林固定后的細(xì)胞也可被染色，即死細(xì)胞也可被染色。因此該方法的計數(shù)結(jié)果不完全代表活體細(xì)胞的數(shù)量，但這種利用熒光染色來計數(shù)活體的方法還是值得借鑒的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的這些問題，本發(fā)明的目的是擬利用一種細(xì)胞原生質(zhì)體染色劑(熒光素二乙酸酯(FDA))與另一種細(xì)胞核染色劑(5-氯甲基二乙酸酯(CMFDA))相結(jié)合的熒光染色方法，來檢測壓載水活體10-50微米生物的數(shù)量，以實現(xiàn)到港船舶壓載水中活體生物的快速檢測。本發(fā)明是通過如下步驟實現(xiàn)：

(1)提取壓載水樣本，并將樣本的生物密度進(jìn)行調(diào)整，制得調(diào)整后樣本；

(2)將步驟(1)中的調(diào)整后樣本搖勻，分別加入FDA和CMFDA染劑，常溫避光染色得到染色后的樣本；在熒光激發(fā)的條件可觀察到雙熒光染色法能很好的區(qū)分細(xì)胞的死活，活細(xì)胞染色后，可觀察到綠色熒光，而死細(xì)胞不發(fā)熒光。

(3)將步驟(2)中的染色后的樣本移至玻璃材質(zhì)的計數(shù)框中，利用正置熒光顯微鏡，在熒光激發(fā)下，即可觀察到的活體生物數(shù)量。

其中，所述步驟(1)將樣本的生物密度進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后的生物密度為10³-10⁴cell/mL。藻液中藻細(xì)胞密度在10³-10⁴cell/mL時，染色效果最佳，特別是細(xì)胞密度在10⁴cell/mL，各組染色率均超過95％。藻液中藻細(xì)胞密度高于或低于10⁴cell/mL，熒光染色效果均不佳，其中當(dāng)藻細(xì)胞密度達(dá)到10⁶cell/mL時，染色率最低，均低于70％，且隨著染色時間的延長染色率變動較小。

其中，所述步驟(2)染劑的最終濃度分別為4～6μmol/L和2～3μmol/L。優(yōu)選的,最終濃度分別為5μmol/L和2.5μmol/L。此濃度效果最好。

其中，所述步驟(2)染劑的常溫避光染色5-10min。染色時長為5-10min時，各組染色率最高，當(dāng)染色時間增加到15min時，染色率開始下降，并且隨著染色時間的不斷增加，染色率降低，當(dāng)染色時間增加到30min時，染色率出現(xiàn)最低值。由此可知，染色時長為5-10min是熒光染色的最佳時間。

其中，所述步驟(3)中的熒光激發(fā)的條件為，激發(fā)光為465-495nm，吸收光為515-555nm。在此條件下活細(xì)胞可觀察到綠色熒光，而死細(xì)胞不發(fā)熒光

其中，所述步驟(3)中的熒光激發(fā)的曝光時間應(yīng)為40-50ms,可根據(jù)樣本的背景熒光量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。曝光時間越長經(jīng)雙熒光染色后藻細(xì)胞熒光的淬滅越快，同時曝光時間增強還伴隨著背景熒光的增加，兩方面影響都不利于準(zhǔn)確觀察。利用雙熒光染色法觀察活體細(xì)胞時，曝光時間應(yīng)不超過50微秒，以控制背景熒光亮度和保證足夠的觀察計數(shù)時間。

其中，所述步驟(3)中的觀察記錄的時間為10-20min。

本發(fā)明的有益效果是克服現(xiàn)有方法中存在的不準(zhǔn)確、耗時長、不能準(zhǔn)確辨識細(xì)胞死活且對檢測員技術(shù)能力要求較高的問題，本方法對活體生物進(jìn)行高比例染色后，然后通過熒光顯微鏡對其進(jìn)行觀察后，測出相應(yīng)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明提供一種易操作、可快速鑒別10-50微米粒徑活體生物的方法。

附圖說明

圖1.有熒光染色和沒有經(jīng)過熒光染色效果比較結(jié)果(其中，左圖為沒有熒光染色的樣品，右圖為經(jīng)過熒光染色之后的樣本。)

圖2.不同藻類密度與染色時長條件下藻類的染色率

具體實施方式

下面結(jié)合以下實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

實施例1

1.材料與方法

1.1實驗樣本與熒光染色劑

實驗所用藻類樣本有兩種類型，分別是指數(shù)生長期的純種人工培養(yǎng)萊茵衣藻樣本和野外自然水體中藻類樣本。其中人工純種樣本用于確認(rèn)本染色方法最適染色濃度、染色時間、樣本密度等參數(shù)。野外自然樣本用于觀察和評估不同種藻類對該種染色方法的上色效果差異。

配置不同濃度梯度的藻類樣品：

C1 3.5×10⁶cells/mL

C2 3.5×10⁵cells/mL

C3 3.5×10⁴cells/mL

C4 3.5×10³cells/mL

實驗使用的染色劑FDA(二乙酸熒光素)，CMFDA(5-氯甲基二乙酸)以及有機溶劑DMSO(二甲基亞砜)均為美國Life Technologies公司Molecular Probes^TM系列產(chǎn)品。

1.2染色劑配置

根據(jù)FDA和CMFDA的最終濃度及實驗用量，將粉末狀藥品溶于DMSO溶劑，配置實驗待用染劑FDA和CMFDA的濃度為1mmol/L和250umol/L，搖勻后保存于4℃的避光環(huán)境中。

1.3樣本染色

1)雙染色：本實驗染色方法如下，將樣品搖勻后取1mL樣品，加入染色劑FDA和CMFDA劑量終濃度分別為5μmol/L和2.5μmol/L，搖勻后在避光條件下染色10分鐘。

2)FDA染色：本實驗染色方法如下，將樣品搖勻后取1mL樣品，加入染色劑FDA染劑，使得該染劑在樣品溶液中的終濃度為5μmol/L，搖勻后在避光條件下染色10分鐘。

3)CMFDA染色：本實驗染色方法如下，將樣品搖勻后取1mL樣品，加入染色劑CMFDA染劑，使得該染劑在樣品溶液中的終濃度為2.5μmol/L，搖勻后在避光條件下染色10分鐘。

1.4樣本的顯微觀察條件

觀察樣品使用OLYMPUS bx53生物顯微鏡以及DP73數(shù)碼成像系統(tǒng)。顯微鏡的所有熒光濾色鏡部件都采用了超高性能的濾色片,熒光照明器為F.N.22、8孔濾色鏡轉(zhuǎn)盤、4個安裝ND濾色鏡的位置。寬藍(lán)帶激發(fā)熒光鏡組U-FBW，激發(fā)光波長450-480nm,二向色鏡波長500nm,吸收濾光片515nm。成像系統(tǒng)實時圖像采集速度為15幅/秒,分辨率高達(dá)1600×1200像素。進(jìn)行測試分析后，確定了本實驗曝光時間應(yīng)設(shè)置在50微秒或少保持低背景熒光?？捎^察到：

1)部分藻細(xì)胞經(jīng)FDA或CMFDA單染時無熒光或熒光較弱，在熒光顯微鏡下難以辨認(rèn)其熒光，但經(jīng)過雙染時，熒光效果明顯增強。

2)雙熒光染色法能很好的區(qū)分細(xì)胞的死活，活細(xì)胞染色后，可觀察到綠色熒光，而死細(xì)胞不發(fā)熒光。見圖1。左圖為沒有熒光染色的樣品，右圖為經(jīng)過熒光染色之后的樣本?？梢娡ㄟ^熒光染色，右圖中白色的為已上色的活體藻細(xì)胞，可見，通過熒光染色的方法能夠明晰的區(qū)分出樣本中活體藻細(xì)胞。

2.不同染色時長的染色效果差異

將配置好不同濃度梯度的藻類樣品分別染色5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分，30分鐘時，其實驗樣品中藻細(xì)胞的計數(shù)后計算染色率，由不同染色時長染色率折線圖(見圖2)可得出：當(dāng)染色5-10分鐘，染色率增加至最高值；當(dāng)染色時間段為10-15分鐘，染色率幾乎不變動，但染色超過15分鐘后，染色率開始逐漸減?。挥纱丝芍?，染色時長為10-15分鐘時染色率最高，但染色10分鐘的染色率略高于15分鐘的染色率。染色時間過長染色率減小可能是由熒光自身淬滅引起的。

3.不同濃度梯度的藻類樣品的染色效果差異

由表格可見，C3和C4組當(dāng)藻細(xì)胞密度分別是10⁴cell/mL和10³cell/mL時濃度的藻類，染色效果較好。特別是C3組，藻細(xì)胞密度在10⁴cell/mL時，染色效果最佳，染色率均超過95％。

不同染色時長的染色率

Table Rates of staining under different staining time

由此可見，10³-10⁴cell/mL時濃度的藻類，特別是藻細(xì)胞密度在10⁴cell/mL時，染色時長為10-15分鐘時染色率最高，然后通過熒光顯微鏡對其進(jìn)行觀察，可觀察到綠色熒光的活細(xì)胞，并測出相應(yīng)的數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了易操作、快速鑒別10-50微米粒徑活體生物的目的。

以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。