本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體涉及GRP78截短體及其應用。

背景技術：

II型糖尿病是一種常見病，多發(fā)病，在我國以及全世界都具有很高的發(fā)病率，在我國，II型糖尿病已經(jīng)成為發(fā)病率增長最快的疾病。最新資料表明，我國糖尿病患者已超過6000萬，占全球糖尿病患者的五分之一。預計截止到2025年我國糖尿病患者總數(shù)將接近1億。

II型糖尿病是一種多病因的代謝疾病，除內在的遺傳因素外，還與人們生活環(huán)境、生活方式及行為有很大的關系，特別是過度肥胖引起的一些代謝紊亂易導致II型糖尿病。II型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，是指肌肉和脂肪組織對胰島素產(chǎn)生抗性，作為補償，胰島β細胞則分泌更多的胰島素，但仍不能把血糖維持在正常范圍內。另外，過量的胰島素分泌使胰島β細胞功能受到損傷，導致胰島素分泌不足。胰島素抵抗是指機體靶組織對胰島素的反應性低于正常的一種病理生理狀態(tài)，經(jīng)常與肥胖，II型糖尿病早期階段等臨床疾病相伴隨，是這些疾病的一個重要的特征，也是導致這些疾病發(fā)生的重要因素。但是造成胰島素抵抗以及由此導致的肥胖，II型糖尿病等相關疾病的分子機制并不是很清楚。這就導致了其防治的困難。

葡萄糖調節(jié)蛋白78(Glucose Regulated Protein，GRP78)，它位于內質網(wǎng)的管腔，是與細胞防御系統(tǒng)有關的內質網(wǎng)分子伴侶。GRP78是內質網(wǎng)應激的標志性蛋白。在正常情況下，內質網(wǎng)膜上的三種跨膜蛋白雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶，活化轉錄因子6和肌醇需求激酶與GRP78結合，并處于無活性狀態(tài)；當未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)腔內蓄積時，GRP78與之解離得到激活，進入胞質，其表達及穩(wěn)定性明顯增加，并通過不同的途徑來介導不同的蛋白處理程序，參與內質網(wǎng)應激過程。

有研究表明，相比于雄性GRP78^+/+小鼠，雄性GRP78^+/-小鼠可增加其體內能量消耗水平，從而緩解高脂飲食(High-fat Induced Diet，HFD)所誘導的肥胖，并對飲食所誘導的高血糖，高胰島素血癥，肝脂肪變性有抵抗作用，從而緩解胰島素抵抗以及II型糖尿病。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供GRP78截短體，具有改善胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)的重要功能。本發(fā)明的另一目的是提供GRP78截短體的應用。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

GRP78截短體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

編碼所述的GRP78截短體的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的GRP78截短體的編碼基因的DNA序列的載體。

所述的載體，將GRP78截短體的DNA序列連接進p3*flag-cmv-13-14真核表達載體，構建出重組表達質粒。

所述的GRP78截短體在制備改善IR藥物中的應用。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明利用生物工程技術，基因重組一段GRP78截短體多肽對應的DNA序列到p3*flag-cmv-13-14真核表達載體。經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后，將此真核表達重組多肽轉染到HepG2細胞中，免疫印跡證明多肽的蛋白表達，實現(xiàn)了多肽的重組。接著對多肽改善IR進行了研究，細胞學實驗表明此多肽具有改善IR的重要功能，在制備改善IR藥物中的將具有廣泛的應用。

附圖說明

圖1是GRP78截短體多肽對應的DNA序列免疫印跡蛋白表達結果圖，大小為40KD；

圖2是免疫印跡分析檢測胰島素抵抗指標p-AKT、p-GSK3β的蛋白表達水平圖；

圖3是免疫印跡分析檢測內質網(wǎng)應激相關通路分子的蛋白表達水平圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第四版，M.R.格林，J.薩姆布魯克著，科學出版社，2013年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。

實施例1

1)GRP78截短體多肽重組

提取人的mRNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，應用PCR技術(引物序列：5'-AAG CTT ATG GAG GTA GAA AAG GCC AAA CG-3'，5'-CTC GAG CAA CTC ATC TTT TTC TGC TGT-3'，反應條件：95℃，5min→95℃，30s→55℃，20s→72℃，1min(共30循環(huán))→72℃，1min/kb)成功擴增出GRP78截短體(SEQ ID NO.1所示)對應的1092bp的mRNA序列(SEQ ID NO.2所示)。擴增得到的片段與p3*flag-cmv-13-14載體連接，將連接產(chǎn)物轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質粒后，以ECOR1酶切鑒定并測序，驗證結果正確。

2)多肽類似物真核表達載體構建及其表達檢測

將含有GRP78截短體多肽核酸片段的p3*flag-cmv-13-14質粒經(jīng)ECOR1酶切后，利用回收試劑盒獲得該片段，同時用相同的酶處理質粒p3*flag-cmv-13-14，然后將回收多肽核酸片段和經(jīng)酶切的載體p3*flag-cmv-13-14在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜。酶切鑒定重組體。將正確連接的364aa多肽真核表達載體轉染HepG2細胞，48小時后搜集樣品，RIPA細胞裂解液裂解，免疫印跡結果如圖1所示，證明了多肽的表達。

實施例2重組肽改善胰島素抵抗功能的檢測

1)分析IR的HepG2細胞中AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β的表達變化

①細胞模型：HepG2細胞先置于含0.25mm/L PA不含血清的DMEM培養(yǎng)基中孵育24小時；接著置于含100nmol/L胰島素的培養(yǎng)液中孵育15分鐘后提取蛋白。

②將細胞棄去培養(yǎng)基，冰浴PBS洗滌后在培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液(以一個80-90％融合度的6cm培養(yǎng)皿加入1mL的裂解液為準)刮取細胞，提取蛋白，利用western blot實驗手段檢測胰島素信號通路相關分子(AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β)的蛋白表達水平，結果如圖2所示，在肝癌細胞HepG2中轉染364aa多肽后，胰島素抵抗標記：p-AKT、p-GSK3β的表達量上升。

2)分析IR的HepG2細胞中GRP78、CHOP的表達變化

①細胞模型構建同上。

②將細胞棄去培養(yǎng)基，冰浴PBS洗滌后在培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液(以一個80-90％融合度的6cm培養(yǎng)皿加入1ml的裂解液為準)刮取細胞，提取蛋白，利用western blot實驗手段檢測內質網(wǎng)應激相關通路(GRP78、CHOP)的蛋白表達水平，結果如圖3所示，在肝癌細胞HepG2中轉染364aa多肽后，內質網(wǎng)應激下游CHOP的表達量下降。