本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地說，特別涉及體外擴增腫瘤干細胞的方法。

背景技術(shù)：

腫瘤干細胞是具有“自我復(fù)制”(Self-Renewal)以及“具有多細胞分化”(Differentiation)等能力的細胞，通常這類的細胞被認為有形成腫瘤，發(fā)展成癌癥的潛力，特別是隨著癌癥轉(zhuǎn)移出去后，產(chǎn)生新型癌癥的來源，由于腫瘤干細胞的存在數(shù)量極少，因此很難被發(fā)現(xiàn)，抗癌藥物也很難對其產(chǎn)生效果，因此為了能夠盡早攻克腫瘤，需要對腫瘤干細胞進行研究，體外擴增腫瘤干細胞的技術(shù)也就應(yīng)運而生。

目前，公開號為CN103571792A的中國專利公開了一種體外擴增腫瘤干細胞的方法及其加工方法，其首先確定所需體外擴增腫瘤干細胞于生物體內(nèi)所處環(huán)境的基質(zhì)剛度，然后利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴增腫瘤細胞，使包埋后的凝膠支架的基質(zhì)剛度為上步中所確定的腫瘤干細胞所處環(huán)境的基質(zhì)剛度的90-110％，最后進行包埋后腫瘤細胞的體外三維培養(yǎng)，以實現(xiàn)腫瘤干細胞的體外擴增，但是由于腫瘤干細胞在培養(yǎng)的過程中發(fā)生分化，從而形成干性較小的其他細胞，并且通過腫瘤干細胞分化出來的細胞能夠在培養(yǎng)基中進行正常的生長，所以最終所得到的細胞群中就會包括有一定的分化細胞，并使得腫瘤干細胞的質(zhì)量較差。

因此，需要提出一種新的方案來解決上述問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供體外擴增腫瘤干細胞的方法，通過除去分化出來的細胞而使得腫瘤干細胞的質(zhì)量更高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種體外擴增腫瘤干細胞的方法，包括有以下步驟：

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向無血清培養(yǎng)基中添加20-35mg/L的B27，10-25mg/L的IFO以及1-3mg/L的MPF；

步驟2：將培養(yǎng)基升溫至37℃，并通過紫外線進行殺菌；

步驟3：在無菌條件下將腫瘤組織移入到培養(yǎng)基中并同向攪拌；

步驟4：向步驟3中添加0.5mg/L的Accutase，并且每隔四小時添加一次，每次比上次多0.1mg/L，每添加一次Accutase攪拌的方向反向調(diào)節(jié)；

步驟5：培養(yǎng)時間在20-35h后進行離心分離，得到腫瘤干細胞。

通過上述技術(shù)方案，在培養(yǎng)基中添加的MPF能夠?qū)δ[瘤干細胞產(chǎn)生生產(chǎn)促進作用，并使得干細胞能夠以更快的速度進行有絲分裂，從而首先加大了可用于培養(yǎng)的細胞總數(shù)，然后由于在培養(yǎng)基中添加了Accutase，如此就使得細胞間能夠相互分離，從而能夠首先經(jīng)已經(jīng)分化的細胞從干細胞上剝離，并使得每一個細胞都能夠充分接觸于培養(yǎng)基中，然后由于在培養(yǎng)基中包含有IFO，通過IFO能夠?qū)δ[瘤細胞產(chǎn)生殺死作用，并使得一部分細胞失活，由于腫瘤干細胞具有較強的抵抗外界有害物質(zhì)的作用，因而通過IFO對細胞群進行選擇之后，就能夠使得剩余的細胞中，干細胞的比率大大增加，同時由于培養(yǎng)液是無血清培養(yǎng)基，那么分化出來的細胞就更難以生存，并最后都被消除殆盡，從而大大提高了腫瘤干細胞的質(zhì)量，同時通過B27以及MPF使得干細胞的生長速度得到了有效的提高，所以同時也加快的干細胞培養(yǎng)的速度，培養(yǎng)效率高。

本發(fā)明進一步設(shè)置為，所述步驟4中在培養(yǎng)時間8h后添加10-15mg/L的N2。

通過上述技術(shù)方案，B27能夠提供一部分腫瘤干細胞在生長過程中所需的營養(yǎng)物質(zhì)，但是當(dāng)在培養(yǎng)基中存在Accutase并進行反復(fù)的攪拌的時候，就會對腫瘤干細胞產(chǎn)生一定的損壞，但是由于N2中具有更多的添加成分，并能夠促進損傷的腫瘤干細胞從打擊中恢復(fù)，從而保證了腫瘤干細胞具有更多的量。

本發(fā)明進一步設(shè)置為，所述步驟1中還添加有1-3mg/L的ADM。

通過上述技術(shù)方案，ADM又稱阿霉素，ADM的抗瘤譜較廣，能夠?qū)δ[瘤細胞產(chǎn)生損傷，并殺死一部分腫瘤細胞，如此從腫瘤干細胞中分化出來的細胞就難以生存，加多了分化細胞的死亡的同時，使得干細胞所占有的比率再次升高，調(diào)高了培養(yǎng)出的腫瘤干細胞的質(zhì)量。

本發(fā)明進一步設(shè)置為，所述步驟1中還添加有0.5-2mg/L的MMC。

通過上述技術(shù)方案，MMC又稱絲裂霉素，對分化出來的腫瘤細胞產(chǎn)生損壞，并能夠提高干細胞的質(zhì)量。

本發(fā)明進一步設(shè)置為，向所述步驟2中的培養(yǎng)基中添加20-35mg/L的蜂王漿。

通過上述技術(shù)方案，通過蜂王漿使得培養(yǎng)基更具有營養(yǎng)，腫瘤干細胞也能夠更加快速的進行增值，同時也使得腫瘤干細胞在IFO環(huán)境中能夠生長。

本發(fā)明的有益效果：通過無血清培養(yǎng)基以及MPF對腫瘤組織進行培養(yǎng)，在這個培養(yǎng)過程中，首先是通過Accutase將組織細胞分散開來，并使得每一個細胞都與培養(yǎng)基之間充分接觸，然后通過IFO、ADM以及MMC等成分將組織上已經(jīng)分化的細胞以及后期培養(yǎng)過程中從腫瘤干細胞中分化出來的細胞進行殺死，同時由于腫瘤干細胞具有較強的抗性，所以能夠在惡劣的環(huán)境中存活下來，如此在經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)之后，就能夠使得培養(yǎng)的細胞中腫瘤干細胞占有非常大的比重，提高了干細胞的數(shù)量，同時也提高了干細胞的質(zhì)量；不僅如此，由于在培養(yǎng)基中還加入有B27，N2以及蜂王漿等，所以還能夠為干細胞的生長提供充足的營養(yǎng)成分，并使得干細胞能夠健康生長。

具體實施方式

實施例1的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取普通細胞培養(yǎng)基并向培養(yǎng)基中添加肺癌組織細胞，在37℃下無菌條件下培養(yǎng)30h。

實施例2的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中添加肺癌組織細胞；

步驟2：向培養(yǎng)基中投加20mg/L的IFO，在37℃無菌條件下培養(yǎng)25h。

實施例3的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中投加10mg/L的IFO以及2mg/L的MPF；

步驟2：將肺癌組織細胞放入到培養(yǎng)基中，同時加入0.5mg/L的Accutase，并進行攪拌，然后每隔四小時進行一次添加，并且改變攪拌的方向；

步驟3：將培養(yǎng)基放入到37℃下的無菌條件下培養(yǎng)28h。

實施例4的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中投加22mg/L的IFO以及1.3mg/L的MPF；

步驟2：將肺癌組織細胞放入到培養(yǎng)基中，同時加入0.5mg/L的Accutase，并進行攪拌，然后每隔四小時進行一次添加，并且改變攪拌的方向，同時在攪拌八小時之后添加10mg/L的N2；

步驟3：將培養(yǎng)基放入到37℃下的無菌條件下培養(yǎng)26h。

實施例5的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中投加16mg/L的IFO，2mg/L的ADM以及1.7mg/L的MPF；

步驟2：將肺癌組織細胞放入到培養(yǎng)基中，同時加入0.5mg/L的Accutase，并進行攪拌，然后每隔四小時進行一次添加，并且改變攪拌的方向，同時在攪拌八小時之后添加15mg/L的N2；

步驟3：將培養(yǎng)基放入到37℃下的無菌條件下培養(yǎng)20h。

實施例6的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中投加23mg/L的IFO，3mg/L的ADM，1mg/L的MMC以及2.7mg/L的MPF；

步驟2：將肺癌組織細胞放入到培養(yǎng)基中，同時加入0.5mg/L的Accutase，并進行攪拌，然后每隔四小時進行一次添加，并且改變攪拌的方向，同時在攪拌八小時之后添加11mg/L的N2；

步驟3：將培養(yǎng)基放入到37℃下的無菌條件下培養(yǎng)33h。

實施例7的體外擴增腫瘤干細胞的方法的加工方法

步驟1：取無血清培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中投加2mg/L的IFO，1.2mg/L的ADM，0.5mg/L的MMC以及2.4mg/L的MPF；

步驟2：將肺癌組織細胞放入到培養(yǎng)基中，同時加入0.5mg/L的Accutase和30mg/L的蜂王漿，并進行攪拌，然后每隔四小時進行一次添加，并且改變攪拌的方向，同時在攪拌八小時之后添加13mg/L的N2；

步驟3：將培養(yǎng)基放入到37℃下的無菌條件下培養(yǎng)35h。

產(chǎn)物性能表征取70只NOD/SCID小鼠，并且隨機的分成十組，在面的每組細胞培養(yǎng)完成之后，消化成但細胞懸液，接種一定數(shù)量的細胞至每組小鼠的背部皮下，在第15周后，觀察每只小鼠的腫瘤的形成，并記錄，所得結(jié)果如下：

通過上述這些數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中，同時通過IFO以及MPF進行處理的時候，能夠很好的將腫瘤干細胞從腫瘤組織中提取出來并且進行較好的篩選以及培養(yǎng)，從而得到高質(zhì)量的腫瘤干細胞，并且在加入了ADM以及MMC之后，使得對腫瘤干細胞的選擇更加具有取向性，使得干細胞的選出更為優(yōu)質(zhì)，而且通過B27，N2和蜂王漿也為干細胞的生長提供了充分的資源，并使得干細胞能夠健康的生長。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。