本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高效幾丁質(zhì)酶突變體的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：幾丁質(zhì)(Chitin)是以N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)為基本單位在自然界大量存在的天然線性直鏈多糖。幾丁質(zhì)降解后的多種產(chǎn)物如GlcNAc、(GlcNAc)2、幾丁寡糖等可用于食品、保健品和化妝品的生產(chǎn)，且研究表明GlcNAc及其衍生物在人體免疫系統(tǒng)、癌癥研究中起著很重要的作用。自然界中，幾丁質(zhì)主要存在于節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼中，如蝦殼、蟹殼，但是傳統(tǒng)的化學(xué)方法處理這些廢棄物得到的副產(chǎn)物種類繁多，其分子大小難以控制、去乙酰化程度不一致，并且化學(xué)方法會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，所以這些廢棄物常常得不到充分的利用。相對(duì)于化學(xué)方法，利用純化后的幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)得到的產(chǎn)物比較均一且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，是一種應(yīng)用前景良好的方法。但是就目前的酶法水解而言還存在水解效率低，酶的利用率低等缺點(diǎn)和不足。針對(duì)這些缺點(diǎn)和不足的改進(jìn)方法大致分為兩種：1.發(fā)現(xiàn)和探索催化效率更高的天然酶；2.基于現(xiàn)有的酶，利用酶工程的改造得到具有更好催化效果的突變體。已知粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)是研究較為深入的一種高效的幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)，其中SmChiA是一種進(jìn)程性的幾丁質(zhì)外切酶。SmChiA結(jié)合幾丁質(zhì)單鏈依靠的主要是底物結(jié)合裂縫中芳香族氨基酸與糖基之間的疏水相互作用。但是現(xiàn)有的幾丁質(zhì)酶SmChiA，當(dāng)其水解天然底物如蝦蟹粉、真菌菌絲體等的時(shí)候，會(huì)表現(xiàn)出水解效率低等缺陷。而基于其水解機(jī)理，則有很大的改進(jìn)空間。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了提高SmChiA對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行酶解的效率，本發(fā)明提供了一種對(duì)酶活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基進(jìn)行突變以提高其水解幾丁質(zhì)效率的方法。首先，本發(fā)明公開(kāi)一種編碼幾丁質(zhì)酶突變體的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。還公開(kāi)一種幾丁質(zhì)酶突變體，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。以上，經(jīng)過(guò)對(duì)SmChiA(F232W/F396W)活性位點(diǎn)兩個(gè)關(guān)鍵殘基的增益突變后，無(wú)論是對(duì)底物的結(jié)合能力還是對(duì)復(fù)雜底物的水解能力都有相應(yīng)的增強(qiáng)。本發(fā)明的另一方面，在于公開(kāi)一種重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)質(zhì)粒包含核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因，所述重組表達(dá)質(zhì)粒所用的質(zhì)粒載體為pET-22(b)、pET-28a,pET-14b、pET-15b、pET-20b(+)、pET-23(+)、pET-16b、pET-32a、pET-41a、pET-19b、pET-25b、pET-26b、pET-27b或pET-31b中的一種。還公開(kāi)一種表達(dá)幾丁質(zhì)酶突變體的重組菌，所述重組菌包含上文所述的重組表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)于前文所述的表達(dá)幾丁質(zhì)酶突變體的重組菌，其中，所述重組菌體為大腸桿菌BL21(DE3)、Origami(DE3)、OrigamiB(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的一種。本發(fā)明的另一方面，在于公開(kāi)一種幾丁質(zhì)酶突變體的制備方法，其包括，發(fā)酵上文所述的表達(dá)幾丁質(zhì)酶突變體的重組菌，發(fā)酵條件為：以加入了氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素加入的比例為1:1000)為培養(yǎng)基，在37℃，180-220rpm下振蕩培養(yǎng)3-4h后，再加入終濃度為0.5mM的IPTG，在16℃下誘導(dǎo)表達(dá)12-16h。本發(fā)明的另一方面，在于公開(kāi)上文所述的幾丁質(zhì)酶突變體在水解幾丁質(zhì)方面的應(yīng)用，具體的，研究SmChiA(F232W/F396W)與SmChiB、SmChiC的協(xié)同作用并與SmChiA進(jìn)行比較。結(jié)果表明，SmChiA(F232W/F396W)與SmChiB協(xié)同作用提高了19.1％；SmChiA(F232W/F396W)與SmChiC協(xié)同作用提高了30.4％。SmChiA(F232W/F396W)與α-幾丁質(zhì)的結(jié)合能力高于SmChiA。水解天然復(fù)雜底物時(shí)，SmChiA(F232W/F396W)水解黑曲霉的能力較SmChiA提高了3.47％，水解超微蟹粉的能力提高了47.62％。附圖說(shuō)明圖1是幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖；圖2是幾丁質(zhì)酶SmChiA與其突變體SmChiA(F232W/F396W)水解α-幾丁質(zhì)后產(chǎn)生的還原糖的量的示意圖；圖中橫坐標(biāo)表示兩種幾丁質(zhì)酶SmChiA和SmChiA(F232W/F396W)，縱坐標(biāo)表示它們水解α-幾丁質(zhì)的反應(yīng)速率(min-1)。圖3是顯示幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)與SmChiA和其他幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用比較的示意圖；圖中橫坐標(biāo)表示SmChiA，SmChiA(F232W/F396W)，SmChiB，SmChiC單酶和兩兩的協(xié)同反應(yīng)，縱坐標(biāo)表示反應(yīng)所產(chǎn)生的還原糖(mM)。圖4是幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)與SmChiA結(jié)合幾丁質(zhì)能力的比較示意圖；.圖中橫坐標(biāo)表示兩種幾丁質(zhì)酶SmChiA和SmChiA(F232W/F396W)，縱坐標(biāo)表示它們水解黑曲霉菌絲體產(chǎn)生的還原糖(mM)。圖5、圖6是幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)與SmChiA水解復(fù)雜底物黑曲霉菌絲體和超微蟹粉產(chǎn)生還原糖的量的示意圖。.圖中橫坐標(biāo)表示兩種幾丁質(zhì)酶SmChiA和SmChiA(F232W/F396W)，縱坐標(biāo)表示它們水解超微蟹粉產(chǎn)生的還原糖(mM)。具體實(shí)施方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行等同替換或改變均屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。為了方便表述，在以下實(shí)施例中，“mM”表示mmol/L；“μM”表示“μmol/L”；Am表示SmChiA(F232W/F396W)；B表示SmChiB；C表示SmChiC；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自Takara)；滅菌的條件為121℃下高壓滅菌20min。實(shí)施例1SmChiA(F232W/F396W)酶的制備SmChiA(F232W/F396W)的基因序列是以粘質(zhì)沙雷氏菌SmChiA的基因?yàn)槟０?，?jīng)三輪次的PCR的方法進(jìn)行點(diǎn)突變，即每一輪次的PCR產(chǎn)物作為下一輪次的模板。三輪次的引物分別為SmChiA(F232W/F396W)-mutF1和SmChiA(F232W/F396W)-mutR1，SmChiA(F232W/F396W)-mutF2和SmChiA(F232W/F396W)-mutR2，SmChiA(F232W/F396W)-F1和SmChiA(F232W/F396W)-R1，如表1所示。將獲得的基因(本發(fā)明涉及到的兩個(gè)突變位點(diǎn)F232W和F396W表示的含義是：將野生型SmChiA的第232和第396兩個(gè)位置上的苯丙氨酸突變成色氨酸，反映在核酸序列上的信息就是將相應(yīng)位置編碼苯丙氨酸的密碼子TTC突變成編碼色氨酸的TGG)(核苷酸序列為SEQIDNO.1)連接至pMD18-T載體，并測(cè)序，確定序列的正確性，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。之后，將基因連接至pET22(b)，酶切位點(diǎn)為NcoI和XhoI，獲得質(zhì)粒Pet22(b)-SmChiA(F232W/F396W)。重組表達(dá)質(zhì)粒Pet22(b)-SmChiA(F232W/F396W)熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。表達(dá)菌在37℃生長(zhǎng)至OD600為1.8時(shí)，添加0.5mMIPTG。隨后，細(xì)胞在37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h。在4℃條件下，8000rpm離心5min收集菌體，并重懸在BufferA(20mM磷酸二氫鈉，500mM氯化鈉，pH7.4)中。采用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎菌體，壓力為800bar。在4℃條件下，10000rpm離心10min，去除未破碎的菌體以及包涵體，0.22μm濾器過(guò)濾上清。采用金屬螯合層析分離純化蛋白，蛋白在BufferE(20mM磷酸二氫鈉，500mM氯化鈉，50mM咪唑，pH7.4)下洗脫雜質(zhì)蛋白，蛋白在BufferF(20mM磷酸二氫鈉，500mM氯化鈉，150mM咪唑，pH7.4)下洗脫并收集。以考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，使用SDS-PAGE檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)蛋白的純度。結(jié)果表明，得到的SmChiA(F232W/F396W)酶的濃度為1.7mg/mL(即，29.8μM)，(SmChiA(F232W/F396W)酶的產(chǎn)量約為13mg/L)，具有較高的純度，如圖1所示。圖1是幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖。表1引物序列(5′-3′)SmChiA(F232W/F396W)-mutF1GATCCGTGGGCCGCGCTGCAAAAAGCGCAGSmChiA(F232W/F396W)-mutR1TGCAGCGCGGCCCACGGATCGTGGATCGAGACSmChiA(F232W/F396W)-mutF2TATGGCGCCTGGGATCTGAAGAACCTGGGGCATCAGSmChiA(F232W/F396W)-mutR2AGGTTCTTCAGATCCCAGGCGCCATAGAAGTCGTSmChiA(F232W/F396W)-F1CGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGSmChiA(F232W/F396W)-R1TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTG實(shí)施例21)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以幾丁二糖為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度(分別為0、0.5、1、1.5、2mM)的樣品，取60μL樣品加180μL鐵氰化鉀溶液(2g/L)，沸水浴15min，取200μL測(cè)吸光度值A(chǔ)405，制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。2)酶解實(shí)驗(yàn)反應(yīng)設(shè)置三組平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和一組空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為6μM的SmChiA(F232W/F396W)或SmChiA，對(duì)照組加入相同濃度通過(guò)沸水浴變性后的SmChiA(F232W/F396W)或SmChiA：反應(yīng)均在1.5mL離心管中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)體系為60μL，α-幾丁質(zhì)底物濃度為3mg/mL，兩種酶的終濃度均為6μM，然后用20mM磷酸鹽緩沖液將體積補(bǔ)足到60μL；對(duì)照組的反應(yīng)體系為60μL，兩種酶的終濃度均為6μM，沸水浴5min使酶失去活性，然后用20mM磷酸鹽緩沖液將體積補(bǔ)足到60μL。放入30℃水浴鍋中反應(yīng)15h；加入180μL2g/L鐵氰化鉀溶液，然后沸水浴煮沸15min，取出放入離心機(jī)中12000rpm離心5min；最后吸取200μL上清液加到酶標(biāo)板，測(cè)量405nm處的吸光值A(chǔ)405。結(jié)果如圖2所示。圖2是幾丁質(zhì)酶SmChiA與其突變體SmChiA(F232W/F396W)水解α-幾丁質(zhì)后產(chǎn)生的還原糖的量的示意圖。結(jié)果表明，以α-幾丁質(zhì)為底物，SmChiA的水解速率為0.084min-1，SmChiA(F232W/F396W)的水解速率為0.091min-1，相對(duì)來(lái)說(shuō)提高了8.05％。3)協(xié)同水解實(shí)驗(yàn)1.SmChiA分別與SmChiB、SmChiC協(xié)同水解α-幾丁質(zhì)反應(yīng)體系均為200μL，α-幾丁質(zhì)的終濃度為5mg/mL，SmChiA、SmChiB、SmChiC的終濃度均為2μM，不足的體積用20mM磷酸鹽緩沖液補(bǔ)齊。對(duì)照組的反應(yīng)體系為200μL，三種酶的終濃度均為2μM，沸水浴5min使酶失去活性，然后用20mM磷酸鹽緩沖液將體系補(bǔ)足到200μL。放入30℃水浴鍋中反應(yīng)24h；取出60μL加到另一個(gè)1.5mL離心管中，后加入180μL2g/L鐵氰化鉀溶液，然后沸水浴煮沸15min，取出放入離心機(jī)中12000rpm離心5min；最后吸取200μL上清液加到酶標(biāo)板，測(cè)量405nm處的吸光值A(chǔ)405。2.SmChiA(F232W/F396W)分別與SmChiB、SmChiC協(xié)同水解α-幾丁質(zhì)反應(yīng)體系均為200μL，α-幾丁質(zhì)的終濃度為5mg/mL，SmChiA(F232W/F396W)，SmChiB、SmChiC的終濃度均為2μM，不足的體積用20mM磷酸鹽緩沖液補(bǔ)齊。其它操作同上。結(jié)果如圖3所示。圖3是顯示幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)與SmChiA和其他幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用比較的示意圖。結(jié)果表明，SmChiA、SmChiB協(xié)同水解α-幾丁質(zhì)產(chǎn)生的還原糖為1.468mM，SmChiA(F232W/F396W)、SmChiB協(xié)同水解α-幾丁質(zhì)產(chǎn)生的還原糖為1.749mM，提高了19.1％；SmChiA、SmChiC協(xié)同水解α-幾丁質(zhì)產(chǎn)生的還原糖為0.620mM，SmChiA(F232W/F396W)、SmChiC協(xié)同水解α-幾丁質(zhì)產(chǎn)生的還原糖為0.809mM，提高了30.4％。結(jié)果說(shuō)明，SmChiA(F232W/F396W)與SmChiB、SmChiC共同水解α-幾丁質(zhì)都存在協(xié)同作用，且協(xié)同效果較SmChiA提高了很多。4)結(jié)合幾丁質(zhì)能力實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為200μL，其中α-幾丁質(zhì)底物的終濃度為5mg/mL。設(shè)置SmChiA(F232W/F396W)和SmChiA酶的濃度梯度為0mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL，設(shè)置三組平行對(duì)照。由于在室溫條件下，酶催化α-幾丁質(zhì)水解產(chǎn)生的(GlcNAc)2會(huì)與酶的活性口袋結(jié)合，影響酶與α-幾丁質(zhì)的結(jié)合。所以，此反應(yīng)在4℃條件下完成。另外，為了讓?duì)?幾丁質(zhì)與酶充分結(jié)合，反應(yīng)在4℃冰箱中30rpm翻轉(zhuǎn)反應(yīng)15h。在離心機(jī)中12000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中。然后用Bradford方法測(cè)定上清液中的蛋白濃度，根據(jù)加入的蛋白的濃度，計(jì)算結(jié)合的蛋白量。結(jié)果如圖4所示。圖4是幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)與SmChiA結(jié)合幾丁質(zhì)能力的比較示意圖。結(jié)果表明，在每個(gè)濃度下，SmChiA(F232W/F396W)與α-幾丁質(zhì)的結(jié)合量均高于SmChiA，說(shuō)明SmChiA(F232W/F396W)與α-幾丁質(zhì)的結(jié)合能力要高于SmChiA。5)水解復(fù)雜底物能力實(shí)驗(yàn)1.水解黑曲霉(Aspergillusniger)菌絲體反應(yīng)設(shè)置三組平性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和一組空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5μM的SmChiA(F232W/F396W)或SmChiA，對(duì)照組加入相同濃度通過(guò)沸水浴變形后的SmChiA(F232W/F396W)或SmChiA：反應(yīng)均在2mL離心管中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的反應(yīng)體系均為200μL，黑曲霉底物濃度為10mg/mL，兩種酶的終濃度均為5μM。稱取2mg黑曲霉底物，加入200μL20mM磷酸鹽緩沖液，沸水煮5min，離心后取出100μL，再加入100μL緩沖液，再煮沸重復(fù)三次，最后加入酶。放入30℃水浴鍋中反應(yīng)22h；取出60μL加入到另一個(gè)1.5mL離心管中，再加入180μL2g/L鐵氰化鉀溶液，然后沸水浴煮沸15min，取出放入離心機(jī)中12000rpm離心5min；最后吸取200μL上清液加到酶標(biāo)板，測(cè)量405nm處的吸光值A(chǔ)405。2.水解超微蟹粉反應(yīng)設(shè)置三組平性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和一組空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5μM的SmChiA(F232W/F396W)或SmChiA，對(duì)照組加入相同濃度通過(guò)沸水浴變形后的SmChiA(F232W/F396W)或SmChiA：反應(yīng)均在2mL離心管中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的反應(yīng)體系均為200μL，黑曲霉底物濃度為10mg/mL，SmChiA(F232W/F396W)和SmChiA的終濃度均為5μM。其它操作同黑曲霉。結(jié)果如圖5、6所示。圖5、6是幾丁質(zhì)酶SmChiA(F232W/F396W)與SmChiA水解復(fù)雜底物黑曲霉菌絲體和超微蟹粉產(chǎn)生還原糖的量的示意圖。結(jié)果表明，反應(yīng)進(jìn)行24h，SmChiA水解黑曲霉產(chǎn)生的還原糖為1.44mM，SmChiA(F232W/F396W)水解黑曲霉產(chǎn)生的還原糖為1.49mM，相對(duì)來(lái)說(shuō)增長(zhǎng)了3.47％，SmChiA水解超微蟹粉產(chǎn)生的還原糖為0.42mM，SmChiA(F232W/F396W)水解超微蟹粉產(chǎn)生的還原糖為0.62mM，相對(duì)來(lái)說(shuō)增長(zhǎng)了47.62％，說(shuō)明SmChiA(F232W/F396W)水解復(fù)雜底物的能力提高了很多。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3