本發(fā)明涉及微生物技術(shù)和養(yǎng)殖水環(huán)境改良技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效凈化養(yǎng)殖污水的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Am11及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，中國的水產(chǎn)養(yǎng)殖朝著高密度、集約化、規(guī)模化和名優(yōu)化的方向發(fā)展，形成了高生物負(fù)載量和高投入量的養(yǎng)殖模式。在高投入高產(chǎn)出的模式下，養(yǎng)殖密度超過了水體容量，大量的殘剩餌料、肥料和生物代謝產(chǎn)物累積，使得水體自凈能力下降，水體富養(yǎng)化顯著，養(yǎng)殖水體的自身污染日益嚴(yán)重。剩余的餌料、養(yǎng)殖生物的排泄物加上浮游生物的尸體殘骸等的積累超過了水體的自凈能力，使得有機(jī)物不能徹底分解而沉淀在底部，水體中厭氧分解層不斷增厚，導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的積累，從而毒害養(yǎng)殖生物，誘發(fā)各類水產(chǎn)疾病，并且水產(chǎn)品的品質(zhì)也不斷下降。

原位生物修復(fù)是最能表現(xiàn)生物修復(fù)方法特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)的方法，與傳統(tǒng)的環(huán)境治理方法有本質(zhì)的區(qū)別。向?qū)嵭猩锘謴?fù)的場所引入新的外來微生物，以建立新的微生物群落，改變土著微生物的低生物降解性能，獲得對某類污染物質(zhì)具有高降解性能的新的微生物群落，引入微生物是原位生物恢復(fù)技術(shù)的核心部分。引入新的具有某些特殊的功能的微生物才是該技術(shù)的生命力的所在。通過某種手段培育和訓(xùn)化出一些對某種污染物質(zhì)具有特殊降解能力的菌種，然后將這些菌種引入到實施生物降解的目標(biāo)地帶，繼續(xù)發(fā)揮其對該類污染物質(zhì)的特有降解作用。

芽孢桿菌(Bacilus sp.)能夠分泌具有較高活性的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，可以高效降解殘餌中蛋白質(zhì)和淀粉，能夠減少氨氮(NH₄⁺-N)、亞硝酸鹽氮(NO₂-N)、H₂S等有害物質(zhì)，高效降解有機(jī)污染物，抑制有害微生物的繁殖，有效的改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境促進(jìn)水環(huán)境良性循環(huán)，并且微生態(tài)制劑具有成本低、收效大等優(yōu)點(diǎn)，是目前水環(huán)境污染治理的研究熱點(diǎn)。并且能在不利的環(huán)境中以芽孢的形式存在，具有耐高溫、耐酸堿性能，易于儲藏及運(yùn)輸，作為飼料微生態(tài)添加劑和水體微生態(tài)修復(fù)改良劑都有廣闊前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效凈化養(yǎng)殖污水的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Am11及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種高效凈化養(yǎng)殖污水的解淀粉芽孢桿菌，菌株為解淀粉芽孢桿菌Am11(Bacillus amyloliquefaciens Am11)已于2016年2月1日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO.12123。

一種高效凈化養(yǎng)殖污水的解淀粉芽孢桿菌，所述菌株在用于生物修復(fù)改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用。

一種解淀粉芽孢桿菌微生物制劑，生物制劑為將所述解淀粉芽孢桿菌Am11經(jīng)發(fā)酵所得發(fā)酵物。

具體為：將解淀粉芽孢桿菌Am11于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后以接種環(huán)接種再次接種到新鮮營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中獲得固體種子；

將上述獲得固體種子以3wt％接種量接種至種子培養(yǎng)液中37℃，培養(yǎng)12h,培養(yǎng)后再以1wt％接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中以37℃、150rpm擴(kuò)大培養(yǎng)24h；

將上述發(fā)酵培養(yǎng)后培養(yǎng)液升溫至50-60℃，而后加入固體氯化鈣和磷酸氫二鈉各0.3wt％，攪拌混勻后再加入3wt％硅藻土，板框壓濾；將濾餅干燥，干燥的菌體顆粒粉碎后，即得到微生物制劑。

一種解淀粉芽孢桿菌微生物制劑的應(yīng)用，所述制劑作為水體凈化制劑，在原位生物修復(fù)改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用。

本發(fā)明所具有的的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明新型解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Am11具有明顯的凈化水體的作用，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，減少抗生素的使用，從而減輕水體污染，增加養(yǎng)殖戶的效益，可作為用于原位生物修復(fù)能夠改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的解淀粉芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌Am11對餌料溶解物中蛋白、淀粉和CODMn的降解利用率在48h時趨于穩(wěn)定，降解率分別為57％，52％，55％；該菌處理養(yǎng)殖污水24h后氨氮和亞硝酸鹽含量降低至很低水平，降解率分別達(dá)到了95％和97％。改善養(yǎng)殖水質(zhì)，不但增強(qiáng)水產(chǎn)動物的免疫力和抗病能力，還能減輕養(yǎng)殖污水中有機(jī)物污染源的排放，保證優(yōu)良的養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境從而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的不同因素對菌株A11產(chǎn)蛋白酶活力的影響圖，其中，(a)培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響，(b)不同pH值對酶活力的影響，(c)接種量對酶活力的影響，(d)不同NaCl濃度對產(chǎn)酶活力的影響。

圖2為本發(fā)明實施例提供的采用本發(fā)明菌株A11對殘餌降解率的效果圖。

圖3為本發(fā)明實施例提供的采用本發(fā)明菌株A11對氨鹽和亞硝酸鹽的降解圖。

具體實施方式

實施例1通過蛋白酶活性對菌株的篩選與鑒定

1、篩選

(1)從濰坊市濰北六場水產(chǎn)養(yǎng)殖戶的污水溝中取泥樣50mL，80℃水浴15min，殺滅非芽孢菌；稀釋后，將樣品涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)平板，37℃，培養(yǎng)24h；挑選典型芽孢桿菌菌落在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃，培養(yǎng)24h。

(2)產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩：挑取少量菌落，接種到種子培養(yǎng)液(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)中，35℃、180r/min恒溫培養(yǎng)24h，按照10倍稀釋法將增殖菌懸液稀釋成不同梯度(取100μL增值菌懸液，加入900μL無菌水，制成10^-1的稀釋液。取100μL 10-¹的稀釋液，加入900μL無菌水，制成10^-2的稀釋液。以此類推，按照10倍稀釋法適當(dāng)稀釋成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10等不同梯度的稀釋液)后，吸取10^-8、10^-9、10^-10的不同梯度的稀釋液各0.1ml依次均勻涂布于蛋白酶篩選培養(yǎng)基(酪蛋白10g，酵母粉3g，Na₂HPO₄·12H₂O 5g，NaCl 5g，溴麝香草酚藍(lán)0.05g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)平板上。恒溫培養(yǎng)24～48h，測量水解圈的直徑(D)和菌落的直徑(d)，根據(jù)D/d的比值大小來判斷菌株產(chǎn)酶的能力，篩選出產(chǎn)蛋白酶穩(wěn)定并且酶活力高的菌株。

(3)產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩：將初篩選取的菌株接種到液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)中，35℃、180r/min恒溫培養(yǎng)24h，取適量發(fā)酵液，10000r/min離心15min，上清液為粗酶液，測定粗酶液的蛋白酶活力，結(jié)合水解圈與菌落直徑的比值(D/d)進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩，于35℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)，測定蛋白酶活力達(dá)到187U/ml，菌株即為解淀粉芽孢桿菌Am11(Bacillus amyloliquefaciens Am11)。

解淀粉芽孢桿菌Am11(Bacillus amyloliquefaciens Am11)進(jìn)行保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日：2016年2月1日，保藏號為CGMCC NO.12123，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

2、菌株鑒定

(1)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)觀察：將制備的菌懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，35℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察單菌落形狀、 大小、顏色、邊緣、表面、透明度等。將菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察菌體形態(tài)。

(2)生理生化特征：各項生理生化試驗具體方法參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及相關(guān)微生物試驗教程。

(3)菌種鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析：采用16SrDNA直接測序法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。PCR擴(kuò)增采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’)。經(jīng)0.8％的瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像分析儀觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并保存圖像，PCR產(chǎn)物送北京華大基因測序。得到測序結(jié)果后登陸NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，尋找并下載與實驗菌株親緣關(guān)系較近的序列。使用MEGA 6軟件的UPGMAM法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株的分類地位。

3、結(jié)果分析

(1)上述獲得菌株Am11所產(chǎn)蛋白酶的酶活較高。以此，對該株菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究。復(fù)篩結(jié)果顯示菌株Am11所產(chǎn)蛋白酶的酶活力最強(qiáng)，酶活力達(dá)到187U/ml。

(2)Am11菌株在固體培養(yǎng)基上生長24h后，菌落形態(tài)為：邊緣不整齊，表面粗糙，不透明，干燥，有隆起，菌落呈現(xiàn)淺黃色，液體培養(yǎng)時會有菌膜形成。通過革蘭氏染色，菌株Am11呈現(xiàn)紫色，為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀。

(3)菌株Am11的生理生化試驗結(jié)果所示，H₂O₂酶試驗、V-P(伏-普)試驗、酪素水解試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、硝酸鹽還原試驗、丙二鹽試驗均呈陽性，MR(甲基紅)試驗、海藻酸鈉降解試驗、Tween80降解試驗、丙酸鹽試驗、吲哚試驗、卵黃卵磷脂試驗、H₂S試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗均呈陰性，可以利用D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇進(jìn)行發(fā)酵，能夠在較大的溫度范圍內(nèi)生長，并且耐受10％的NaCl溶液。菌株Am11的生理生化特征與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中芽孢桿菌屬特征相符，確定菌株Am11屬于芽孢桿菌屬(Bacilus)。

(4)以細(xì)菌為模板，菌株Am11進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過0.8％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下顯示圖像，檢測出引物擴(kuò)增出的序列大約在1500bp處存在熒光條帶，符合常規(guī)的16S rDNA序列長度。PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序表明，16S rDNA擴(kuò)增的序列全長為1419bp，其序列如下所示：

TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGT CTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCC

(a)序列特征：

●長度：1419

●類型：堿基序列

●鏈型：單鏈

●拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：DNA

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：解淀粉芽孢桿菌Am11(Bacillus amyloliquefaciensAm11)

將上述16S rDNA序列進(jìn)行比對，確認(rèn)該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名為解淀粉芽孢桿菌Am11(Bacillus amyloliquefaciensAm11)。

實施例2解淀粉孢桿菌產(chǎn)酶條件及酶活性質(zhì)的評估

1、菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

將菌株Am11接種于液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)中，35℃、180r/min培養(yǎng)。每隔2h取樣，連續(xù)取6次，再每隔12h，取樣，共取72h，測OD_600nm來繪制菌株生長曲線，同時對每次取樣的菌液以10 000r/min離心，取上清液測定蛋白酶活性，繪制產(chǎn)酶曲線，以確定菌株的最高產(chǎn)酶量、最高產(chǎn)酶時間及產(chǎn)酶隨時間的變化關(guān)系。

2、影響菌株產(chǎn)蛋白酶能力的因素

(1)種子液的制備：在超凈臺中，用接種環(huán)刮取適量保存在斜面培養(yǎng)基上的菌體Am11，接種到種子培養(yǎng)液(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)中，在恒溫?fù)u床，35℃、180r/min，培養(yǎng)12h，制成種子液。

(2)分別探究在上述種植培養(yǎng)過程中不同溫度(15℃，25℃，35℃，45℃，55℃)，不同初始pH(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，不同接種量(1％，3％，5％，8％，10％)和不同NaCl濃度(1％，3％，5％，8％，10％)對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響。

3、結(jié)果分析

(1)當(dāng)培養(yǎng)到12-15h時菌株達(dá)到了對數(shù)生長期，菌體生長相對較旺盛，但是酶活比較低；隨著穩(wěn)定期的到來，酶活升高，在培養(yǎng)36-48h后，酶活達(dá)到了最高；隨著次生代謝產(chǎn)物的增加，菌株生長進(jìn)入了衰亡期，酶活也逐漸下降。從細(xì)菌生長曲線分析可得，細(xì)菌產(chǎn)酶主要在對數(shù)生長期，此時細(xì)菌繁殖速度下降；穩(wěn)定期后期，酶活達(dá)到了最高，此時應(yīng)該是收獲酶的時期。

(2)溫度對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響，當(dāng)溫度在25℃-35℃之間時，蛋白酶酶活力隨溫度的增加而升高；當(dāng)溫度高于35℃時，酶活力逐漸下降；在35℃發(fā)酵時，測得的蛋白酶酶活最高，因此，確定35℃作為發(fā)酵培養(yǎng)時的適宜溫度。

(3)初始pH值對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響，當(dāng)初始pH在7.0-7.5之間時，菌株所產(chǎn)蛋白酶酶活力隨pH的增大而增高；當(dāng)初始pH高于8.5時，Am11菌株酶活力下降，pH高于8.5時，說明Am11菌株沒有較強(qiáng)的耐堿性。初始pH為7.5時，測得菌株的蛋白酶酶活力最高，因此，確定7.5作為發(fā)酵培養(yǎng)時的初始pH。

(4)接種量對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響，Am11菌株在接種量為8％時，酶活力達(dá)到最高，Am23菌株在接種量為5％時，酶活力達(dá)到最高。

(5)NaCl濃度對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響，隨著NaCl濃度的增大，菌株Am11所產(chǎn)蛋白酶活力也隨之下降，當(dāng)NaCl濃度高于8％時，蛋白酶活力明顯下降，當(dāng)NaCl濃度位3％，蛋白酶活性位初始酶活性的93％，說明菌株Am11能適應(yīng)3％鹽度(一般海水的鹽度)的環(huán)境(參見圖1)。

實施例3解淀粉孢桿菌微生物制劑的制備

1、制備斜面菌種：在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種上述解淀粉芽孢桿菌Am11，37℃，培養(yǎng)12h；

2、制備固體種子：將步驟1制備的斜面菌種接種至茄瓶新鮮營養(yǎng)瓊脂斜面(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)，37℃，培養(yǎng)12h；

3、制備液體種子：將步驟2制備的固體種子從茄瓶斜面洗下接種至250L種子罐，接種量為0.5％，37℃，培養(yǎng)12h，種子罐中培養(yǎng)基的組分及其所占重量比分別為：豆餅粉2.5％，玉米漿2％，磷酸氫二鈉0.1％，硫酸銨0.05％，硫酸錳0.05％，余量為水；

4、發(fā)酵培養(yǎng)：將種子罐中的種子接種到5噸發(fā)酵罐中培養(yǎng)，接種量5％，37℃，150rpm，培養(yǎng)20h，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的組分及其所占重量比分別為：豆粕4％，玉米粉2％，硫酸錳0.05％，硫酸鎂0.05％，余量為水；

5、壓濾：將發(fā)酵液升溫至50℃，加入固體氯化鈣和磷酸氫二鈉各0.3％(w/v)，攪拌30min后轉(zhuǎn)入儲罐，加入發(fā)酵液3％(w/v)的硅藻土，板框壓濾；

6、烘干：將濾餅在沸騰干燥機(jī)中干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度90℃，出風(fēng)口溫度50℃，干燥15s；

7、粉碎：干燥的菌體顆粒粉碎后，過40目篩，即得到上述解淀粉芽孢桿菌制劑。

實施例4解淀粉孢桿菌對養(yǎng)殖水體的凈化作用

1、Am11菌株對殘餌降解能力

將活化的菌液Am11(在超凈臺中，用接種環(huán)刮取適量保存在斜面培養(yǎng)基上的菌體，接種到種子培養(yǎng)液中，35℃、180r/min恒溫培養(yǎng)12h，制成活化的菌液)接種到已滅菌的餌料培養(yǎng)基(將南美白對蝦飼料研磨成粉末，取10g，溶于1L去蒸餾水中，煮沸，無菌環(huán)境中浸泡12h，6000r/min離心15min，取上清液，121℃滅菌20min)中，每隔12h(取72h小時)取上清液測定培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)、淀粉的含量和CODMn值。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白含量； 采用碘顯色法測定淀粉含量；采用堿性高錳酸鉀法^[22]測定COD_Mn值。計算蛋白質(zhì)、淀粉和COD_Mn的降解率。

2、Am11菌株對氨氮、亞硝酸鹽降解能力

將菌株Am11接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)中，180r/min，30℃恒溫培養(yǎng)12h，進(jìn)行活化。吸取適量活化的菌液于離心管中，5000r/min，離心10min，去除上清液，再用無菌的PBS緩沖液洗滌沉淀，混勻，再次離心，重復(fù)三次，以除去菌種活化過程中產(chǎn)生的氨氮，再用PBS洗下沉淀接入氨鹽培養(yǎng)基(酵母粉5g，(NH₄)₂SO₄ 0.25g，NaCl 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)和亞硝酸鹽培養(yǎng)基(酵母粉5g，NaNO₂ 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，NaCl 1g，蒸餾水1000mL，pH 7.2～7.4)中，先每隔4h，測完24h，再每隔12h測定培養(yǎng)液中NH₄⁺-N和NO₂-N的含量，計算出降解率，NH₄⁺-N和NO₂-N的測定分別采用次溴酸鹽氧化法和萘乙二胺分光光度法。

3、結(jié)果分析

(1)本試驗在以南美白對蝦餌料為營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，測定了菌株Am11對餌料溶解物中蛋白、淀粉和CODMn的降解利用率，結(jié)果如圖2所示。隨著培養(yǎng)時間的延長，殘料溶解物中的蛋白質(zhì)、淀粉和CODMn的含量減少，降解率升高，并且在48h時趨于穩(wěn)定，降解率分別為57％，52％，55％。

(2)本實驗將已經(jīng)活化的菌液接種到分別以(NH₄)₂SO₄和NaNO₃作為唯一氮源的培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，先每隔4h，測完24h，再每隔12h測定培養(yǎng)液中NH₄⁺-N和NO₂-N的含量，計算出降解率，結(jié)果顯示，接入活液后8h后，培養(yǎng)液中氨氮和亞硝酸鹽迅速降解，24h后氨氮和亞硝酸鹽含量降低至很低水平，降解率分別達(dá)到了95％和97％(參見圖3)。