本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時檢測待測溶液中汞離子和鉛離子的含量的方法。

背景技術(shù)：

重金屬污染嚴重威脅人類健康和生態(tài)環(huán)境安全，已成為一個世界范圍的環(huán)境問題。鉛離子(Pb²⁺)和汞離子(Hg²⁺)污染是我國常見的重金屬污染，具有毒性大、致毒劑量低、易累積、難降解、難治理等特點，因而是目前環(huán)境監(jiān)測和治理的重點。

為控制鉛離子和汞離子經(jīng)攝入進入人體內(nèi)，《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)嚴格限定飲用水中Hg²⁺的濃度不能高于0.001mg/L，Pb²⁺濃度不能高于0.01mg/L，并基于原子吸收光譜(AAS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP/MS)等儀器開發(fā)了檢測痕量Pb²⁺和Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)方法(如GB/T 20380.1-2006、GB/T 23362.4-2009)。盡管標(biāo)準(zhǔn)的儀器方法檢測飲用水中Pb²⁺和Hg²⁺具有靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點，但也存在著樣品前處理復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、檢測時間長等問題，難以實現(xiàn)快速現(xiàn)場檢測或?qū)ν话l(fā)水污染事件做出快速響應(yīng)。

近年來，基于功能核酸(Functional Nucleic Acids，F(xiàn)NAs)方法檢測環(huán)境中重金屬離子展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，目前已開發(fā)了大量基于FNAs檢測Pb²⁺和Hg²⁺的方法。其中對于Hg²⁺檢測常用的核酸為MSO(Mercury Specific Oligonucleotide)，其主要功能是在Hg²⁺作用下，DNA中的T堿基可以形成錯配；而對于Pb²⁺的檢測主要使用G-四連體(G-quartet，G4)或者8-17/GR-5DNAzyme，在鉛離子的作用下，G4催化ABTS^2－的能力被抑制，而8-17/GR-5DNAzyme則可以將其部分互補的底物鏈切斷；其中GR-5DNAzyme是新近發(fā)現(xiàn)的僅對Pb²⁺有特異響應(yīng)的DNAzyme，性能優(yōu)于傳統(tǒng)8-17DNAzyme。上述研究均僅側(cè)重于單一重金屬離子快速檢測方法，實際應(yīng)用中往往伴有多種重金屬離子的超標(biāo)釋放，可見，尋找一種既可檢測汞離子又可檢測鉛離子的方法勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測待測溶液中汞離子或鉛離子的含量。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了檢測待測溶液中汞離子或鉛離子的含量的方法，該方法以對鉛離子的響應(yīng)的GR-5DNAzyme為基礎(chǔ)，在其中引入了對Hg²⁺有特異響應(yīng)的DNA序列，經(jīng)重新設(shè)計和優(yōu)化出對Hg²⁺和Pb²⁺均能響應(yīng)的DNA序列：Hg-Pb TD，Hg-Pb TD由酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub組成。該方法的原理：當(dāng)加入Hg²⁺和Pb²⁺后，原雜交結(jié)合的酶鏈Hg-Pb TD-En與底物鏈Hg-Pb TD-Sub發(fā)生去雜交，根據(jù)去雜交的程度可檢測相應(yīng)的離子濃度。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種檢測待測溶液中汞離子的含量的方法。

本發(fā)明提供的檢測待測溶液中汞離子的含量的方法，可包括步驟(a)、步驟(b)和步驟(c)：

所述步驟(a)包括如下步驟：

(a-1)雜交液和鉛離子屏蔽劑混勻，孵育；

(a-2)完成步驟(a-1)后，加入待測溶液，孵育；

(a-3)完成步驟(a-2)后，采用Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(b)包括如下步驟：

(b-1)所述雜交液和汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，孵育；

(b-2)完成步驟(b-1)后，采用所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(c)：根據(jù)所述汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液中汞離子的濃度和相應(yīng)熒光信號強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所述步驟(a-3)得到的熒光信號強度代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測溶液中汞離子的含量。

上述方法中，所述雜交液可含有底物鏈Hg-Pb TD-Sub和酶鏈Hg-Pb TD-En。

上述方法中，所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub可為單鏈核酸分子，自3’末端到5’末端依次可包括如下元件：S1片段、S2片段和S3片段。所述S1片段可由n1個T組成。所述S2片段的核苷酸序列可為AAGGrA，rA代表腺嘌呤核糖核苷酸。所述S3片段可由n2個T組成。所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的末端可具有熒光猝滅基團。n1和n2均為大于等于12且小于等于18的自然數(shù)。n1>n2。所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的末端具體可為所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的5’末端。所述熒光猝滅基團可為熒光淬滅基團BHQ2、熒光淬滅基團Dabcyl、熒光淬滅基團BHQ1或熒光淬滅基團BHQ3。

上述方法中，所述酶鏈Hg-Pb TD-En可為單鏈核酸分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：E1片段、E2片段和E3片段。所述E1片段可由n3個A組成。所述E2片段的核苷酸序列可為TGAAGTAGCGCCGCCGT。所述E3片段可由n4個A組成。所述酶鏈Hg-Pb TD-En的末端可具有熒光基團。n3和n4均為大于等于12且小于等于18的自然數(shù)。n3>n4。所述酶鏈Hg-Pb TD-En的末端具體可為所述酶鏈Hg-Pb TD-En的3’末端。所述熒光基團可為花青素?zé)晒馊玖螩y3、羧基熒光素FAM、花青素?zé)晒馊玖螩y5或花青素?zé)晒馊玖螩y5.5。

上述方法中，所述Hg-Pb TD-PS探針可為單鏈核酸分子，自5’末端到3’末端依次可包括如下元件：P1片段和P2片段。所述P1片段可由n5個脫氧核糖核苷酸組成，且不能與所述酶鏈Hg-Pb TD-En和所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub進行雜交。所述P2片段可由n6個T組成。n5和n6均為大于等于12且小于等于16的自然數(shù)。所述Hg-Pb TD-PS探針的末端可具有修飾基團。所述Hg-Pb TD-PS探針的末端具體可為所述Hg-Pb TD-PS探針的5’末端。所述修飾基團可為NH₂-(CH₂)₁₂。所述修飾基團可使所述Hg-Pb TD-PS探針和傳感光纖進行連接。

上述方法中，n1＝n3。n2＝n4＝n6。優(yōu)選為n1＝n3＝18。優(yōu)選為n2＝n4＝n6＝12。優(yōu)選為n5＝15。

上述方法中，A為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸。T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。G為鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸。C為胞嘧啶脫氧核糖核苷酸。

上述方法中，“采用Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度”可為采用所述Hg-Pb TD-PS探針通過與脫落的帶熒光標(biāo)記的雜交后，通過儀器激發(fā)熒光標(biāo)記并檢測熒光信號強度。“采用Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度”具體可為采用具有所述Hg-Pb TD-PS探針的全光纖倏逝波生物傳感器檢測熒光信號強度。所述全光纖倏逝波生物傳感器可按照中國專利號為200610089497.4、授權(quán)公告號為CN 1873450B的發(fā)明專利的實施例制備。

上述方法中，所述雜交液可由所述酶鏈Hg-Pb TD-En和所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub組成。所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub可由所述S1片段、所述S2片段和所述S3片段組成。所述酶鏈Hg-Pb TD-En可由所述E1片段、所述E2片段和所述E3片段組成。所述Hg-Pb TD-PS探針可由所述P1片段和所述P2片段組成。

上述方法中，所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。所述酶鏈Hg-Pb TD-En的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述Hg-Pb TD-PS探針的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。

上述方法中，所述鉛離子屏蔽劑具體可為PDCA。所述PDCA具體可為Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法。

本發(fā)明所提供的檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法，可包括步驟(A)、步驟(B)和步驟(C)：

所述步驟(A)可包括如下步驟：

(A-1)上述任一所述雜交液和汞離子屏蔽劑混勻，孵育；

(A-2)完成步驟(A-1)后，加入待測溶液，孵育；

(A-3)完成步驟(A-2)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(B)可包括如下步驟：

(B-1)上述任一所述雜交液和鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，孵育；

(B-2)完成步驟(B-1)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(C)：根據(jù)所述鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液中鉛離子的濃度和相應(yīng)熒光信號強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所述步驟(A-3)得到的熒光信號強度代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測溶液中鉛離子的含量。

所述汞離子屏蔽劑可為Hg²⁺屏蔽序列。所述Hg²⁺屏蔽序列具體可由10個T組成；T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。

上述任一所述的方法中，所述待測溶液可為待測液相樣本。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測待測溶液中汞離子或鉛離子含量的試劑盒。

本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述任一所述底物鏈Hg-Pb TD-Sub和上述任一所述酶鏈Hg-Pb TD-En。

上述試劑盒中，還可包括上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針。

上述任一所述試劑盒中，還可包括光纖探頭。

上述任一所述試劑盒中，還可包括表面具有上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針的光纖探頭。

上述任一所述試劑盒中，還可包括全光纖倏逝波生物傳感器。

上述任一所述試劑盒中，還可包括汞離子屏蔽劑。所述汞離子屏蔽劑可為Hg²⁺屏蔽序列。所述Hg²⁺屏蔽序列具體可由10個T組成；T為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。

上述任一所述試劑盒中，還可包括鉛離子屏蔽劑。所述鉛離子屏蔽劑具體可為PDCA。所述PDCA具體可為Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品。

上述任一所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述任一所述試劑盒在檢測待測溶液中汞離子或鉛離子含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測待測溶液中汞離子的含量的方法。

本發(fā)明所提供的檢測待測溶液中汞離子的含量的方法，可包括步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)：

所述步驟(1)可包括如下步驟：

(1-1)上述任一所述雜交液和待測溶液混勻，孵育；

(1-2)完成步驟(1-1)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(2)包括如下步驟：

(2-1)上述任一所述雜交液和汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，孵育；

(2-2)完成步驟(2-1)后，采用所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(3)：根據(jù)所述汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液中汞離子的濃度和相應(yīng)熒光信號強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所述步驟(1-2)得到的熒光信號強度代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測溶液中汞離子的含量。

上述方法中，所述待測溶液為不含有鉛離子的待測液相樣本。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法。

本發(fā)明所提供的檢測待測溶液中鉛離子的含量的方法，可包括步驟(d)、步驟(e)和步驟(f)：

所述步驟(d)可包括如下步驟：

(d-1)上述任一所述雜交液和待測溶液混勻，孵育；

(d-2)完成步驟(d-1)后，采用上述任一所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(e)包括如下步驟：

(e-1)上述任一所述雜交液和鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，孵育；

(e-2)完成步驟(e-1)后，采用所述Hg-Pb TD-PS探針檢測熒光信號強度；

所述步驟(f)：根據(jù)所述鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液中鉛離子的濃度和相應(yīng)熒光信號強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所述步驟(e-2)得到的熒光信號強度代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測溶液中鉛離子的含量。

上述方法中，所述待測溶液為不含有汞離子的待測液相樣本。

上文中，所述汞離子具體可為Hg²⁺。所述鉛離子具體可為Pb²⁺。

上述任一所述鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液可為溶液1、溶液2、溶液3、溶液4或溶液5。具體制備方法如下：取Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Pb²⁺濃度為0nM的溶液1、Pb²⁺濃度為16.7nM的溶液2、Pb²⁺濃度為167nM的溶液3、Pb²⁺濃度為833nM的溶液4和Pb²⁺濃度為1670nM的溶液5。所述Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)可為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產(chǎn)品。

上述任一所述汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液可為溶液a、溶液b、溶液c、溶液d或溶液e。具體制備方法如下：取Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Hg²⁺濃度為0nM的溶液a、Hg²⁺濃度為16.7nM的溶液b、Hg²⁺濃度為167nM的溶液c、Hg²⁺濃度為833nM的溶液d或Hg²⁺濃度為1670nM的溶液e。所述Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)可為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產(chǎn)品。

如果欲檢測待測溶液汞離子和鉛離子的總含量，可按照所述方法檢測待測溶液中的汞離子的含量和鉛離子的含量，然后將二者相加，即得到待測溶液汞離子和鉛離子的總含量。

實驗證明，本發(fā)明所提供的方法，既可檢測汞離子的含量，又可檢測鉛離子的含量，且檢測準(zhǔn)確率高、靈敏度高、選擇性好和重復(fù)性好。因此，本發(fā)明所提供的方法在檢測汞離子的含量和檢測鉛離子的含量中的具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為不同濃度Pb²⁺溶液的檢測結(jié)果圖。

A為不同濃度Pb²⁺溶液的實際檢測圖；B為Pb²⁺檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖2為不同濃度Hg²⁺溶液的檢測結(jié)果圖。

A為不同濃度Hg²⁺溶液的實際檢測圖；B為Hg²⁺檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3為對不同金屬離子的選擇性檢測結(jié)果圖。

A為Pb²⁺溶液檢測時對不同離子的選擇性；B為Hg²⁺溶液檢測時對不同離子的選擇性。

圖4為對濃度為167nM的Hg²⁺溶液的重復(fù)性檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

下述實施例中的全光纖倏逝波生物傳感器按照中國專利號為200610089497.4、授權(quán)公告號為CN 1873450B的發(fā)明專利的實施例制備。

2，6-pyridinedicarboxylic acid(PDCA)為Sigma-Aldrich公司的產(chǎn)品；在作為鉛離子屏蔽劑。3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)為sigma-aldrich公司的產(chǎn)品，CAS號為919-30-2。傳感光纖為南京春輝科技實業(yè)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號為HCS。

硫酸-過氧化氫溶液由98.3％(質(zhì)量百分含量)的濃硫酸水溶液和30％(質(zhì)量百分含量)的過氧化氫水溶液按體積比3:1混合而成。

硅烷化劑溶液：將2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶于100mL脫水甲苯，得到硅烷化劑溶液。

戊二醛偶聯(lián)劑溶液：將戊二醛溶于pH7.4、50mM的Tris-HAc緩沖液得到戊二醛偶聯(lián)劑溶液；戊二醛偶聯(lián)劑溶液中，戊二醛的體積百分含量為2％。

Hg-Pb TD-PS探針、酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub均為單鏈核酸分子，由寶生物工程(大連)有限公司合成。Hg-Pb TD-PS探針、酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub的核苷酸序列見表1。

表1

注：Cy3為花青素?zé)晒馊玖?，rA為腺嘌呤RNA，BHQ2為熒光淬滅基團。

Hg-Pb TD-PS探針溶液：將Hg-Pb TD-PS探針和NaNO₃溶于pH7.4、50mM的Tris-HAc緩沖液，得到Hg-Pb TD-PS探針溶液；Hg-Pb TD-PS探針溶液中，Hg-Pb TD-PS探針的濃度為150nM，NaNO₃的濃度為100mM。

Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液：將酶鏈Hg-Pb TD-En、底物鏈Hg-Pb TD-Sub和NaNO₃溶于pH7.4、10mM的Tris-HAc緩沖液，得到Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液；Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液中，酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub的濃度均為30nM，NaNO₃的濃度為50mM。

Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產(chǎn)品，Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)中Pb²⁺濃度為1000μg/mL。

Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)為國家有色金屬及電子材料分析測試中心的產(chǎn)品，Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)中Hg²⁺濃度為1000μg/mL。

實施例1、Pb²⁺和/或Hg²⁺的檢測方法

GR-5DNAzyme是新近發(fā)現(xiàn)的僅對Pb²⁺有特異響應(yīng)的DNAzyme，性能優(yōu)于傳統(tǒng)8-17DNAzyme，其中GR-5DNAzyme由酶鏈GR-5En和底物鏈GR-5Sub組成。為可以檢測Pb²⁺和/或Hg²⁺，需對GR-5DNAzyme的結(jié)構(gòu)進行重新設(shè)計。經(jīng)過大量設(shè)計和實驗操作驗證，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)需保留其關(guān)鍵位置脫氧核酸的組成和結(jié)構(gòu)，即保留其對Pb²⁺有響應(yīng)的結(jié)構(gòu)；還需通過在底物鏈GR-5Sub上“AAGGrA”的兩端分別加上若干個T堿基(一般為12-18個)，使Hg²⁺加入后，底物鏈可以從酶鏈上離去，從而建立Hg²⁺濃度和熒光強度的關(guān)系，鑒于此重新設(shè)計和優(yōu)化出對Hg²⁺和Pb²⁺均能響應(yīng)的DNA序列：Hg-Pb TD，Hg-Pb TD由酶鏈Hg-Pb TD-En和底物鏈Hg-Pb TD-Sub組成。該方法的原理：當(dāng)加入Hg²⁺和Pb²⁺后，原雜交結(jié)合的酶鏈Hg-Pb TD-En與底物鏈Hg-Pb TD-Sub發(fā)生去雜交，根據(jù)去雜交的程度可檢測相應(yīng)的離子濃度。

建立的Pb²⁺含量和/或Hg²⁺含量的檢測方法，具體步驟如下：

一、制備Hg-Pb TD-PS探針光纖

1、表面羥基活化的傳感光纖的制備

(1)將傳感光纖浸泡于硫酸-過氧化氫溶液，80℃靜置1h。

(2)完成步驟(1)后，取所述傳感光纖，用超純水沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，然后用氮氣吹干，120℃靜置3h，即獲得表面羥基活化的傳感光纖。

2、表面硅烷化的傳感光纖的制備

(1)將表面羥基活化的傳感光纖浸泡于硅烷化劑溶液中，室溫(如25℃)靜置120min。

(2)完成步驟(1)后，取所述表面羥基活化的傳感光纖，先用脫水甲苯?jīng)_洗3次(每次沖洗時間為1min)，再用無水乙醇沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，然后用氮氣吹干，180℃烘烤1h，即獲得表面硅烷化的傳感光纖。

3、表面偶聯(lián)化的傳感光纖的制備

(1)將表面硅烷化的傳感光纖浸泡于戊二醛偶聯(lián)劑溶液中，室溫(如25℃)靜置60min。

(2)完成步驟(1)后，取所述表面硅烷化的傳感光纖，先用超純水沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，再用pH7.4、50mM的Tris-HAc緩沖液沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，然后用氮氣吹干，得到表面偶聯(lián)化的傳感光纖。

4、Hg-Pb TD-PS探針光纖的制備

(1)取表面偶聯(lián)化的傳感光纖，在其表面均勻覆蓋Hg-Pb TD-PS探針溶液，然后放入濕度為65％(實際應(yīng)用中濕度為55％-75％之間均可)的密閉環(huán)境中室溫(如25℃)靜置18h。

(2)完成步驟(1)后，取所述表面偶聯(lián)化的傳感光纖，先用0.2％(質(zhì)量百分含量)的SDS水溶液沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，再用超純水沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，然后用20μM的甘氨酸水溶液浸泡處理1h。

(3)完成步驟(2)后，取所述表面偶聯(lián)化的傳感光纖，先用0.2％(質(zhì)量百分含量)的SDS水溶液沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，再用超純水沖洗3次(每次沖洗時間為1min)，然后用氮氣吹干，得到固定Hg-Pb TD-PS探針的傳感光纖，命名為Hg-Pb TD-PS探針光纖。

二、不含Hg²⁺的待測樣品中的Pb²⁺含量的檢測

不含Hg²⁺的待測樣品中的Pb²⁺含量的檢測的步驟如下：

1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。

2、取Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Pb²⁺濃度為16.7nM的溶液2、Pb²⁺濃度為167nM的溶液3、Pb²⁺濃度為833nM的溶液4和Pb²⁺濃度為1670nM的溶液5。將0.1M硝酸水溶液做為溶液1(Pb²⁺濃度為0nM)。

3、完成步驟2后，向試管中先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然后加入3μL溶液(溶液1、溶液2、溶液3、溶液4或溶液5)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交后的溶液。

4、完成步驟3后，取雜交后的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Pb²⁺檢測，將不同時間產(chǎn)生的熒光信號進行收集，然后利用最強熒光信號值計算熒光強度百分比?？紤]到Pb²⁺與Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液的反應(yīng)時間，完成單次檢測的全過程需少于15min。

完成上述步驟后的Hg-Pb TD-PS探針光纖可以再生，再生方法為：將完成上述步驟后的Hg-Pb TD-PS探針光纖先用飽和尿素水溶液洗滌2次(每次洗滌時間為48s)，然后用0.2％(質(zhì)量百分含量)的SDS水溶液沖洗2次(每次洗滌時間為48s，最后使用超純水和pH7.4、10mM的Tris-HAc緩沖液各清洗一遍，洗滌時間均為24s。

實驗結(jié)果見圖1中A。結(jié)果表明，隨著Pb²⁺濃度的增加，熒光信號值逐漸增大。

5、以Pb²⁺濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度百分比為縱坐標(biāo)，繪制檢測Pb²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測Pb²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1中B所示，線性關(guān)系為：Y＝0.031X+46.08，R²＝0.9916。

根據(jù)最低檢測限為儀器信噪比3倍的原則，Pb²⁺的最低檢測限為10nM。

6、不含Hg²⁺的待測樣品中的Pb²⁺含量的檢測

按照上述步驟1至4，將步驟3中的溶液替換為不含Hg²⁺的待測樣品，其它步驟均不變，得到不含Hg²⁺的待測樣品的熒光強度百分比；然后根據(jù)檢測Pb²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算得出不含Hg²⁺的待測樣品中的Pb²⁺含量。

三、不含Pb²⁺的待測樣品中的Hg²⁺含量的檢測

不含Pb²⁺的待測樣品中的Hg²⁺含量的檢測的步驟如下：

1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。

2、取Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用0.1M硝酸水溶液稀釋，依次獲得Hg²⁺濃度為16.7nM的溶液b、Hg²⁺濃度為167nM的溶液c、Hg²⁺濃度為833nM的溶液d和Hg²⁺濃度為1670nM的溶液e。將0.1M硝酸水溶液做為溶液a(Hg²⁺濃度為0nM)。

3、完成步驟2后，取試管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然后加入3μL溶液(溶液a、溶液b、溶液c、溶液d或溶液e)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交后的溶液。

4、完成步驟2后，取雜交后的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Hg²⁺檢測，將不同時間產(chǎn)生的熒光信號進行收集，然后利用最強熒光信號值計算熒光強度百分比?？紤]到Hg²⁺與Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液的反應(yīng)時間，完成單次檢測的全過程需少于15min。

完成上述步驟后的Hg-Pb TD-PS探針光纖可以再生，具體方法同步驟二中Hg-Pb TD-PS探針光纖的再生方法。

實驗結(jié)果見圖2中A。結(jié)果表明，隨著Hg²⁺濃度的增加，熒光信號值逐漸增大。

5、以Hg²⁺濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度百分比為縱坐標(biāo)，繪制檢測Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2中B所示，線性關(guān)系為：Y＝0.029X+50.67，R²＝0.9942。

根據(jù)最低檢測限為儀器信噪比3倍的原則，Hg²⁺的最低檢測限為7nM。

6、不含Pb²⁺的待測樣品中的Hg²⁺含量的檢測

按照上述步驟1至4，將步驟3中的溶液替換為不含Pb²⁺的待測樣品，其它步驟均不變，得到不含Pb²⁺的待測樣品的熒光強度百分比；然后根據(jù)檢測Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算得出不含Pb²⁺的待測樣品中的Hg²⁺含量。

四、含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量的檢測

A、含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量的檢測的原理為：使用Hg²⁺屏蔽序列掩蔽含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中的Hg²⁺，然后再檢測Pb²⁺含量。含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Hg²⁺的濃度不超過1670nM。

含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量的檢測的步驟如下：

1、按照步驟二中1－5的方法，制備檢測Pb²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。

3、取試管，加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然后加入Hg²⁺屏蔽序列，得到混合液；混合液中，Hg²⁺屏蔽序列的濃度為30nM。

4、完成步驟3后，取混合液，靜置5min，然后加入含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交后的溶液。

5、完成步驟4后，取雜交后的溶液，通入完成步驟2的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Pb²⁺檢測，得到熒光強度百分比；然后根據(jù)檢測Pb²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量。

B、檢測待測溶液

1、用丹江口水庫的水樣配制0.1M硝酸水溶液。

2、完成步驟1后，取Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用步驟1配制的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得Pb²⁺濃度為1000nM的待測溶液。

3、完成步驟2后，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Pb²⁺的含量。

4、完成步驟2后，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液中Pb²⁺的含量。

實驗結(jié)果表明，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Pb²⁺的含量為967±45nM，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液中Pb²⁺的含量為1027±0.085nM，兩種方法檢測結(jié)果基本一致，因此，本發(fā)明所提供的方法可準(zhǔn)確的檢測待測樣品中Pb²⁺的含量。

五、含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Hg²⁺含量的檢測

A、含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Hg²⁺含量的檢測的原理為：使用PDCA掩蔽含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中的Pb²⁺，然后再檢測Hg²⁺含量。含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺的濃度不超過1670nM。

含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Hg²⁺含量的檢測的步驟如下：

1、按照步驟三中1－5的方法，制備檢測Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。

3、取試管，加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然后加入PDCA，得到混合液；混合液中，PDCA的濃度為10mM。

4、完成步驟3后，取混合液，靜置5min，然后加入含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交后的溶液。

5、完成步驟4后，取雜交后的溶液，通入完成步驟2的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Hg²⁺檢測，得到熒光強度百分比；然后根據(jù)檢測Hg²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Hg²⁺含量。

B、檢測待測溶液

1、用丹江口水庫的水樣配制0.1M硝酸水溶液。

2、完成步驟1后，取Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用步驟1配制的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得獲得Hg²⁺濃度為100nM的待測溶液。

3、完成步驟2后，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Hg²⁺的含量。

4、完成步驟2后，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液中Hg²⁺的含量。

實驗結(jié)果表明，按照步驟A中的方法檢測待測溶液中Hg²⁺的含量為94±22nM，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液中Hg²⁺的含量為104±0.018nM，兩種方法檢測結(jié)果基本一致，因此，本發(fā)明所提供的方法可準(zhǔn)確的檢測待測樣品中Hg²⁺含量。

六、含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量和Hg²⁺含量的檢測

A、含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量和Hg²⁺含量的檢測的步驟如下：

1、按照步驟四的方法，得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Pb²⁺含量。

2、按照步驟五的方法，得出含Pb²⁺和Hg²⁺的待測樣品中Hg²⁺含量。

B、檢測待測溶液

1、用丹江口水庫的水樣配制0.1M硝酸水溶液。

2、完成步驟1后，取Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)，然后用步驟1配制的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得Pb²⁺濃度為1000nM的待測溶液1。取Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)，然后用步驟1配制的0.1M硝酸水溶液稀釋，獲得獲得Hg²⁺濃度為100nM的待測溶液2。

3、完成步驟2后，按照步驟A中1的方法檢測待測溶液1中Pb²⁺的含量，按照步驟A中2的方法檢測待測溶液2中Hg²⁺的含量。

4、完成步驟2后，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液1中Pb²⁺的含量，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液2中Hg²⁺的含量。

實驗結(jié)果表明，按照步驟A中1的方法檢測待測溶液1中Pb²⁺的含量為986±47nM，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液1中Pb²⁺的含量為1031±0.076nM，兩種方法的檢測結(jié)果基本一致；按照步驟A中2的方法檢測待測溶液2中Hg²⁺的含量為102±23nM，采用電感耦合等離子質(zhì)譜檢測待測溶液2中Hg²⁺的含量為105±0.016nM，兩種方法的檢測結(jié)果基本一致。因此，本發(fā)明所提供的方法可準(zhǔn)確的檢測待測樣品中Pb²⁺含量和Hg²⁺含量。

實施例2、選擇性檢測

一、制備Hg-Pb TD-PS探針光纖

同實施例1步驟一。

二、不同金屬離子的選擇性檢測

1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。

2、取試管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然后加入3μL溶液(1mM硝酸亞鐵水溶液、1mM硝酸錳水溶液、1mM硝酸鋁水溶液，1mM硝酸鐵水溶液，1mM硝酸銀水溶液，1mM氯化鎘水溶液，1mM硝酸銅水溶液，1mM硝酸鈷水溶液，1mM硝酸鉛水溶液，1mM硝酸鎂水溶液和1mM硝酸鈣水溶液、100μM草酸鉛水溶液或100μM草酸汞水溶液)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交后的溶液。

3、完成步驟2后，取雜交后的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，檢測對不同金屬離子的選擇性實驗結(jié)果，具體方法為：收集熒光信號，利用最強熒光信號值計算百分比信號值，百分比信號值的計算公式如下：

百分比信號值(％)＝(待測金屬離子的熒光信號值/1.67μM Pb²⁺或1.67μM Hg²⁺)的最強熒光信號值)×100％。

實驗結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，F(xiàn)e²⁺離子、Mn²⁺離子、Al³⁺離子、Fe³⁺離子、Ag⁺離子、Cd²⁺離子、Cu²⁺離子、Co²⁺離子、Zn²⁺離子、Mg²⁺離子和Ca²⁺離子相對于Pb²⁺離子或Hg²⁺離子的百分比信號值均小于5％，干擾性可以忽略。因此，本發(fā)明所提供的方法對于Pb²⁺或Hg²⁺的檢測均具有良好的選擇性。

實施例3、重復(fù)性檢測

一、制備Hg-Pb TD-PS探針光纖

同實施例1步驟一。

二、Hg-Pb TD-PS探針光纖的重復(fù)性檢測

1、將Hg-Pb TD-PS探針光纖裝入全光纖倏逝波生物傳感器。

2、取試管，首先加入300μL Hg-Pb TD-En－Hg-Pb TD-Sub雜交液，然后加入3μL Hg²⁺濃度為167nM的溶液c(用0.1M硝酸水溶液稀釋Hg²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1729-2004)得到)，室溫(如30℃)靜置8min，得到雜交后的溶液。

3、完成步驟2后，取雜交后的溶液，通入完成步驟1的全光纖倏逝波生物傳感器，進行Hg-Pb TD-PS探針光纖對Hg²⁺的重復(fù)性檢測，共進行5次檢測。將不同時間產(chǎn)生的熒光信號進行收集，利用最強熒光信號值計算百分比信號值，百分比信號值的計算公式如下：

百分比信號值(％)＝(待測金屬離子的熒光信號值/1.67μM Pb²⁺或1.67μM Hg²⁺)的最強熒光信號值)×100％。

實驗見圖4。結(jié)果表明，Hg-Pb TD-PS探針光纖對Hg²⁺檢測的重復(fù)性好。

按照上述步驟，將步驟2中Hg²⁺濃度為167nM的溶液c替換為Pb²⁺濃度為167nM的溶液3(用0.1M硝酸水溶液稀釋Pb²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB O4-1742-2004)得到)，其它步驟均不變，得到Hg-Pb TD-PS探針光纖對Pb²⁺的重復(fù)性檢測。結(jié)果表明，Hg-Pb TD-PS探針光纖對Pb²⁺檢測的重復(fù)性好。

上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的方法對于Pb²⁺或Hg²⁺的檢測的重復(fù)性較好。