本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一組擴增熒光假單胞菌基因的PCR引物。此外，本發(fā)明還涉及一種檢測熒光假單胞菌的試劑盒，以及一種檢測熒光假單胞菌的方法。

背景技術：

熒光假單胞菌是原料乳中常見的主要危害嗜冷菌。在原料乳的加工生產(chǎn)過程中，熒光假單胞菌可能會在生產(chǎn)設備管道中或設備表面形成生物膜。生物膜一旦形成，將難以清除，并可能長期危害乳品的質量和安全。

當前檢測微生物生物膜形成的方法，如結晶紫染色法、顯微鏡觀測法等，只能識別微生物是否具有生物膜的形成能力，但不能鑒別微生物的種類。而能夠鑒別微生物的基因檢測方法，只能對熒光假單胞菌進行種類識別，不能鑒別熒光假單胞菌的生物膜形成能力。

對于乳品生產(chǎn)來說，具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌最具危害性，其對乳品生產(chǎn)的質量和安全有重要意義。而目前尚未有檢測具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌的方法，這是本領域技術人員亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

未解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一組擴增熒光假單胞菌基因的PCR引物，采用該引物進行PCR，可以特異性檢測出具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

具體的，一方面，提供了一組用于擴增熒光假單胞菌基因的PCR引物，正向引物為：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，反向引物為：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’，上述PCR引物用于擴增熒光假單胞菌的生物膜形成調控基因。

第二方面，提供了一種檢測熒光假單胞菌的試劑盒，包括正向引物5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’、反向引物5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。

第三方面，還提供了一種檢測熒光假單胞菌的方法，包括以下步驟：

(a)培養(yǎng)待測菌株；

(b)提取待測菌株的DNA，獲得模板DNA：

(c)進行PCR擴增，PCR反應體系包括：權利要求1上述的正向引物和反向引物、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH₂O；

(d)將步驟(c)擴增得到的產(chǎn)物進行電泳。

進一步地，上述步驟(c)中，反應體系中正向引物和反向引物的最終濃度均為1μM。

進一步地，上述步驟(c)中，反應體系中Taq酶的最終濃度為0.2-0.5U/μl。

進一步地，上述步驟(c)中，PCR緩沖液包括KCl、Tris-HCl和MgCl₂，三者在反應體系中的最終濃度分別為50mM、10mM和1.5mM。

進一步地，上述步驟(c)中，反應體系中脫氧核糖核苷三磷酸最終濃度為0.25μM。

進一步地，上述步驟(c)中，PCR擴增的反應條件包括：94℃，預變性5min；94℃變性15s，57℃退火30s，72℃延伸1min50s，循環(huán)40次；72℃延伸10min。

進一步地，上述步驟(a)中，培養(yǎng)待測菌株采用LB培養(yǎng)基。

進一步地，上述待檢測DNA的長度為1.5kb。

adnA基因是負責熒光假單胞菌生物膜形成的調控基因，本發(fā)明通過設計了一對用于擴增熒光假單胞菌基因的PCR引物，可以特異性地擴增出熒光假單胞菌中的adnA基因片段，而對于其他種類的假單胞菌，則無法擴增出adnA基因片段，對于無生物膜形成能力的熒光假單胞菌，也無法擴增出adnA基因片段。因此，將上述技術方案中的PCR引物用于待測菌株基因的PCR擴增，通過檢測adnA基因的是否存在，從而判斷是否存在具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

此外，通過采用上述PCR引物進行擴增和檢測，操作方法簡單，可以快速有效地檢測具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所提供的第一個實施例的電泳結果。

圖2為本發(fā)明所提供的第二個實施例的電泳結果。

具體實施方式

為更清楚的對本發(fā)明技術方案予以闡述，下面將結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行進一步闡述。以下實施例中涉及的菌種有熒光假單胞菌N92，N93，N97，D104，D15，D16，D41和N44，假單胞菌N53，J935，M44和A106，莓實假單胞菌N31和D84，海雀假單胞菌M61和M62，上述的菌種在本發(fā)明中均為待測菌株，只是為了驗證說明本發(fā)明技術方案的技術效果，不涉及本發(fā)明技術方案的本身，不會影響本發(fā)明技術方案的實施。

下述實施例中使用的10X buffer為PCR緩沖液中的一種，10Xbuffer包括200mM KCl、40mM Tris-HCl和6mM MgCl₂。dNTP為脫氧核糖核苷三磷酸，ddH₂O為雙蒸水，均為本領域專業(yè)術語。

下列實施例中未作特別說明的試劑和實驗設備，均可以通過商業(yè)途徑直接購得。

實施例一

(1)已知的，熒光假單胞菌N92，N93，N97，D104，D15，D16，D41和N44均是具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌菌株，將上述8個菌株從-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％體積比的接種量接種到含1ml LB培養(yǎng)基的EP管中，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

(2)取1ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)),室溫下放置5-10分鐘。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內容物(不振蕩),冰浴5分鐘。加入150μl預冷的溶液Ⅲ(5M醋酸鉀緩沖液，pH 4.8)，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。將沉淀(待檢測DNA)溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。

(3)進行PCR擴增，擴增所用的正向引物是adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，所用的反向引物是adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’。PCR反應體系組成是：

PCR反應條件是：94℃，變性5min；94℃，15s，57℃，30s，72℃，1min50s，循環(huán)40次；72℃，10min；4℃，保存。

(4)將擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳，電泳結果如附圖1所示。

1.5Kb處的條帶即為adnA基因片段，代表此泳道的菌株為具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。附圖1中，泳道1:2kb Marker,泳道2:N92，泳道3:N93，泳道4:N97，泳道5:D104，泳道6:D15，泳道7:D16，泳道8:D41,泳道9:N44。8個泳道在1.5kb處均有條帶，說明，對于具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，采用上述的PCR引物進行擴增，均能有效地檢測出來。

實施例二

(1)已知的，假單胞菌菌株N53，J935，M44為具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，A106為不具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，莓實假單胞菌N31和D84、海雀假單胞菌M61和M62均不是熒光假單胞菌。將上述8個菌株分別從-20℃冰箱中取出置于冰盒上，以2％體積比的接種量接種到含1mL LB培養(yǎng)基的EP管中，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

(2)取1ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)),室溫下放置5-10分鐘。加入新配制的溶液Ⅱ(0.2M NaOH，1％SDS)200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內容物(不振蕩),冰浴5分鐘。加入150μl預冷的溶液Ⅲ(5M醋酸鉀緩沖液，pH 4.8),蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。

(3)進行PCR擴增，擴增所用的正向引物是adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，所用的反向引物是adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’。PCR反應體系組成是：

PCR反應條件是：94℃，變性5min；94℃，15s，57℃,30s，72℃，1min50s，循環(huán)40次；72℃，10min；4℃，保存。

(4)將擴增獲得的產(chǎn)物進行電泳，電泳結果如附圖2所示。

1.5Kb處的條帶即為adnA基因片段，代表此泳道的菌株為具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。附圖2中，泳道1:2kbMarker,泳道2:N53，泳道3:J935，泳道4:M44，泳道5:A106，泳道6:N31，泳道7:D84，泳道8:DM6141,泳道9:M62。從電泳結果可見，菌株N53、J935、M44是具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，在1.5kb處有條帶，A106、N31、D84、M61和M62在1.5Kb處均無條帶，這個結果與待測菌株的實際情況相符，說明采用上述技術方案所提供的PCR引物進行擴增，對于不具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌，以及其他菌株，均無法擴增得到adnA基因片段，只有具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌才能擴增得到adnA基因片段，從而實現(xiàn)有針對性地、準確快速地檢測出具有生物膜形成能力的熒光假單胞菌。

以上對本發(fā)明所提供的一組用于擴增熒光假單胞菌基因的PCR引物、熒光假單胞菌的檢測方法及試劑盒進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。