本發(fā)明屬于植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)從煙葉中提取并分離煙草綠原酸、蕓香苷的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)煙草種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，每年生產(chǎn)煙葉為200多萬(wàn)噸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年向國(guó)家上繳利稅7000多億元，因此，煙草生產(chǎn)及卷煙加工在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位。但是，近年來(lái)受全球氣候變化、自然災(zāi)害頻發(fā)和世界衛(wèi)生組織倡導(dǎo)的“煙草控制框架公約”的影響，煙草企業(yè)出現(xiàn)煙葉收貯過(guò)量，約有30％的低次煙葉無(wú)法用于卷煙生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前煙葉庫(kù)存水平已達(dá)到37.2個(gè)月，占用資金達(dá)到3500億左右，許多煙葉已大大超過(guò)自然醇化的最佳周期。盡管如此，適用于高檔卷煙品牌的優(yōu)質(zhì)特色煙葉仍供不應(yīng)求，為維持煙區(qū)煙葉生產(chǎn)和保護(hù)煙農(nóng)的利益，每年企業(yè)還必須維持一定的煙葉采購(gòu)量。因此，如何化解煙葉生產(chǎn)、庫(kù)存與不適用煙葉之間的矛盾已成為煙草企業(yè)亟待解決的問(wèn)題。
煙草屬于國(guó)家專(zhuān)賣(mài)商品，這就意味著煙草企業(yè)必需找到一種將低次煙葉轉(zhuǎn)變成非煙制品的途徑，才能妥善處理這些不適用煙葉。為了探索既能協(xié)調(diào)煙葉供需矛盾，又可降低煙草企業(yè)收儲(chǔ)成本，增加低次煙葉附加值的有效途徑。本項(xiàng)目擬根據(jù)多年研究結(jié)果，采用現(xiàn)代生物化學(xué)分離純化技術(shù)，對(duì)低次煙葉中含量在毫克以上，已經(jīng)證明具有治療疾病效果的次生代謝產(chǎn)物綠原酸和蕓香苷進(jìn)行分離純化和化學(xué)修飾，開(kāi)發(fā)出附加值較高的保健品和護(hù)膚品。項(xiàng)目所研發(fā)的系列產(chǎn)品不但可以廣泛用于醫(yī)藥、保健品和美容護(hù)膚品領(lǐng)域，提升低次煙葉的附加值，而且將為煙草企業(yè)創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
綠原酸是分布廣泛的苯丙素類(lèi)化合物，學(xué)名為咖啡?？崴?，見(jiàn)式1，因咖啡酸可與奎尼酸3，4，5位羥基成酯鍵所以有單/雙/三咖啡?？崴岬炔煌悩?gòu)體，都統(tǒng)稱為綠原酸。煙葉中以3‐咖啡?？崴嵴贾鲗?dǎo)成份。3‐咖啡?？崴?以下簡(jiǎn)稱為綠原酸)具有很多生理功能。包括抗菌抑制炎癥、降糖降脂保護(hù)肝臟功能等。
蕓香苷又稱蘆丁，是一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，也屬于多酚類(lèi)，見(jiàn)式2，在煙草中含量也達(dá)到10mg/g左右的含量。是一種生物活性很強(qiáng)、臨床應(yīng)用廣泛的中藥。具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗病毒、抗急性胰腺炎等藥理作用，可用于多種慢性疾病的治療。
現(xiàn)有商品綠原酸都提取于金銀花和杜仲；蕓香苷提取于槐花。也有從其他一些植物中提取云香苷的報(bào)道。采取的工藝一般改變溫度、溶劑、料液比等參數(shù)提高提取率。通過(guò)CO2萃取、過(guò)大孔樹(shù)脂等工藝分別提綠原酸和蘆丁。由于煙葉中成分復(fù)雜，含有大量的糖、脂和其它有機(jī)物質(zhì)，提取過(guò)程中大量的還原糖與氨基化合物產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，形成了深褐色的色素，嚴(yán)重影響綠原酸和蘆丁提取效果。所以從低次煙葉中同時(shí)提取分離綠原酸和蕓香苷遠(yuǎn)比單從金銀花(富含綠原酸)和槐花(富含蕓香苷)中提取綠原酸和蕓香苷要復(fù)雜。專(zhuān)利104086425A報(bào)道了從煙葉中同時(shí)提取分離綠原酸、蕓香苷、茄尼醇和煙堿的報(bào)道，我們根據(jù)該專(zhuān)利實(shí)例重復(fù)，并未實(shí)現(xiàn)綠原酸與蕓香苷的有效分離，且色素呈深褐色，分離效果并未達(dá)到此專(zhuān)利所述的效果。至今，我們還未見(jiàn)在去糖和色素基礎(chǔ)上同時(shí)分離綠原酸和蕓香苷的工藝報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)研究現(xiàn)狀，對(duì)從低次煙葉中同時(shí)分離綠原酸和蕓香苷兩種化合物的提取工藝進(jìn)行了研究，目的是為了提供一種能同時(shí)分離綠原酸和蕓香苷的有效方法。該方法節(jié)省了原料和試劑，降低了開(kāi)發(fā)成本，達(dá)到良好的分離效果。
一種同時(shí)從煙葉中提取分離綠原酸和蕓香苷的方法：包括以下步驟：
1)煙草原料粉碎后以水為溶劑一次提取，獲得煙草綠原酸、蕓香苷的粗提液；
2)用有機(jī)溶劑萃取粗提液，獲得去脂的提取液；
3)提取液上柱進(jìn)行綠原酸及蕓香苷的柱層析分離。
步驟1)中將煙草原料粉碎60目過(guò)篩。
步驟1)中設(shè)定提取溫度50-60℃，料液質(zhì)量體積比1:20-25(W/V，g/mL)條件下，用水提取90-150min；優(yōu)選溫度50℃，料液質(zhì)量體積比1:20(W/V,g/mL)，用水提取120min。
步驟2)中按照粗提液與石油醚體積比1:1-1.2萃取，優(yōu)選體積比1:1，獲得去脂的提取液。
步驟3)中選擇AB-8或者HPD-100型號(hào)樹(shù)脂。
步驟3)先用5倍提取液體積的水洗脫，直至洗脫液中無(wú)糖檢測(cè)出。
步驟3)用水洗脫后，改換洗脫液為不同濃度的乙醇梯度洗脫。
步驟3)分別收集10-15％濃度的乙醇洗脫液和30-40％濃度的乙醇洗脫液得到綠原酸溶液和蕓香苷溶液。具體是以每小時(shí)洗脫2倍樹(shù)脂體積的洗脫速度，采用10％、13％、15％濃度的乙醇梯度洗脫收集得到綠原酸溶液；采用30％、33％、36％、40％濃度的乙醇梯度洗脫收集蕓香苷溶液。洗脫收集的綠原酸溶液和蕓香苷溶液分別濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到粗品粉末，溶解粉末進(jìn)行結(jié)晶。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)：
1、本發(fā)明直接采用水進(jìn)行一次性提取，大大降低了提取成本，得到的煙草綠原酸、蕓香苷的粗提液，煙草綠原酸、蕓香苷的提取率分別達(dá)到84％，99％(根據(jù)回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))。提取液中的綠原酸和蕓香苷的含量分別達(dá)到21.7mg/g、16.5mg/g。
2、本發(fā)明萃取后提取液不加熱濃縮，直接過(guò)大孔樹(shù)脂，用水洗脫水溶性糖，避免了可溶性糖參加的美拉德反應(yīng)，減少色素形成。
3、本發(fā)明上大孔樹(shù)脂調(diào)整水和醇洗脫比例，在大孔樹(shù)脂上有效去除色素。
4、本發(fā)明收集的10-15％乙醇洗脫液中綠原酸含量為20.2mg/g，提取率為93.1％(得到的綠原酸分離液中，蕓香苷含量為3mg/g,HPLC法)，；30-40％乙醇洗脫液中蕓香苷含量為11.5mg/g，提取率75.2％，(得到的蕓香苷提取液中，綠原酸含量為0.8mg/g,HPLC法)。通過(guò)以上三個(gè)步驟，綠原酸和蕓香苷近乎得到完全分離，最終提取率可以分別是81.9％和61％。
我們根據(jù)現(xiàn)有專(zhuān)利(104086425A)工藝步驟2(加入1％的殼聚糖溶液，除去雜質(zhì)沉淀，調(diào)節(jié)pH至2，過(guò)夜，得到蕓香苷沉淀，用熱水溶解后于冰箱保存、結(jié)晶；剩余的提取液中測(cè)的綠原酸16.4mg/g，蕓香苷11.2mg/g)對(duì)綠原酸和蕓香苷進(jìn)行分離，實(shí)際得到的結(jié)果是綠原酸提取率為60％，蕓香苷的提取率56.2％，按照(104086425A)步驟工藝，綠原酸與蕓香苷沒(méi)有得到分離。
總之，本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單的工藝和安全廉價(jià)的溶劑實(shí)現(xiàn)了低次煙葉中綠原酸與蕓香苷功能成分的同時(shí)徹底分離，操作極為簡(jiǎn)單，節(jié)省能源，環(huán)保安全，是實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)的有效工藝。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：
一、煙草綠原酸、蕓香苷的同時(shí)提取
稱取過(guò)60目篩的煙葉粉末樣品200g，以料液比1:20溶解于4000ml水中，倒入攪拌提取器并設(shè)定好提取溫度50℃，攪拌提取時(shí)間120min進(jìn)行提取。將得到的提取液進(jìn)行抽濾，濾去殘?jiān)?，收集濾液。濾液中煙草綠原酸、蕓香苷的提取率分別達(dá)到84％，99％(根據(jù)回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))。濾液中的綠原酸和蕓香苷的含量分別達(dá)到21.7mg/g、16.5mg/g。將濾液按1:1體積比例的用量用石油醚萃取除雜，回收上層有機(jī)相，合并下層水相，即得綠原酸、蕓香苷提取液。此時(shí)測(cè)得綠原蕓、香苷含量分別為20.9mg/g、15.3mg/g。
二、煙草綠原酸、蕓香苷的分離
1.分離綠原酸
將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的AB‐8型號(hào)大孔樹(shù)脂裝入層析柱，使柱面平整，無(wú)傾斜，柱床內(nèi)無(wú)氣泡，不分層。用鹽酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH為3，稱量與大孔樹(shù)脂同體積的提取液緩慢倒入層析柱內(nèi)，以2BV/h(每小時(shí)洗脫2倍樹(shù)脂體積)的洗脫速度使提取液流出，完畢后關(guān)閉活塞，靜置30min使物料充分吸附。稱量5倍樹(shù)脂體積的蒸餾水，以2BV/h的流速洗脫吸附在填料中的糖分。配制10％、13％、15％的乙醇溶液，依次倒入層析柱內(nèi)進(jìn)行洗脫，用量同上，合并洗脫液可得綠原酸溶液。10-15％乙醇洗脫液中綠原酸含量為20.2mg/g，提取率為93.1％，其中，蕓香苷含量為3mg/g,HPLC法。將綠原酸溶液減壓濃縮，進(jìn)行真空干燥處理，可得綠原酸粗品。粗品經(jīng)過(guò)萃取、結(jié)晶等方法處理后，獲得綠原酸純品。
2.分離蕓香苷
配制30％、33％、36％、40％的乙醇溶液，依次倒入同一根層析柱內(nèi)進(jìn)行洗脫，用量同上，合并洗脫液可得蕓香苷溶液。30-40％乙醇洗脫液中蕓香苷含量為11.5mg/g，提取率75.2％，其中，綠原酸含量為0.8mg/g,HPLC法。將蕓香苷溶液減壓濃縮，進(jìn)行真空干燥處理，可得蕓香苷粗品。粗品經(jīng)過(guò)萃取、結(jié)晶等方法處理后，獲得蕓香苷純品。
綠原酸和蕓香苷近乎得到完全分離，最終提取率可以分別是81.9％和61％。
實(shí)施例2：
一、煙草綠原酸、蕓香苷的同時(shí)提取
稱取過(guò)60目篩的煙葉粉末樣品200g，以料液比1:25溶解于5000ml水中，倒入攪拌提取器并設(shè)定好提取溫度50℃，攪拌提取時(shí)間120min進(jìn)行提取。將得到的提取液進(jìn)行抽濾，濾去殘?jiān)占癁V液。將濾液按體積1:1比例的用量用石油醚萃取除雜，回收上層有機(jī)相，合并下層水相，即得綠原酸、蕓香苷提取液。
二、煙草綠原酸、蕓香苷的分離
1.分離綠原酸
將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的HPD‐100型號(hào)大孔樹(shù)脂裝入層析柱，使柱面平整，無(wú)傾斜，柱床內(nèi)無(wú)氣泡，不分層。用鹽酸溶液調(diào)節(jié)提取液pH為3，稱量與大孔樹(shù)脂同體積的提取液緩慢倒入層析柱內(nèi)，以2BV/h(每小時(shí)洗脫2倍樹(shù)脂體積)的洗脫速度使提取液流出，完畢后關(guān)閉活塞，靜置30min使物料充分吸附。稱量5倍樹(shù)脂體積的蒸餾水，以2BV/h的流速洗脫吸附在填料中的糖分。配制10％、13％、15％的乙醇溶液，依次倒入層析柱內(nèi)進(jìn)行洗脫，用量同上，合并洗脫液可得綠原酸溶液。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，所得溶液中綠原酸含量占分離前提取液的84％以上。將綠原酸溶液減壓濃縮，進(jìn)行真空干燥處理，可得綠原酸粗品。粗品經(jīng)過(guò)萃取、結(jié)晶等方法處理后，獲得綠原酸純品。
2.分離蕓香苷
配制30％、33％、36％、40％的乙醇溶液，依次倒入同一根層析柱內(nèi)進(jìn)行洗脫，用量同上，合并洗脫液可得蕓香苷溶液。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，所得溶液中蕓香苷含量占分離前提取液的64％以上。將蕓香苷溶液減壓濃縮，進(jìn)行真空干燥處理，可得蕓香苷粗品。粗品經(jīng)過(guò)萃取、結(jié)晶等方法處理后，獲得蕓香苷純品。
在本發(fā)明所述的操作條件范圍內(nèi)，本發(fā)明都能達(dá)到優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的滿意效果，上述實(shí)施例1和2效果尤佳。