本發(fā)明涉及智能生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種智能水凝膠載體，更具體地涉及一種可用于人體的低溫?zé)峤到馑z及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，水凝膠已經(jīng)在生物材料領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，包括作為藥物及基因運(yùn)輸?shù)妮d體，組織再生支架，以及傷口縫合的生物膠水等。基于水凝膠的藥物運(yùn)輸體系在局部治療中具有顯著的優(yōu)勢，這類材料可以保持?jǐn)?shù)日乃至數(shù)星期連續(xù)的藥物釋放，提高了藥物的生物利用度并且降低了毒副作用。然而，通常情況下，大多數(shù)凝膠都是通過被動擴(kuò)散或者凝膠的降解釋放出藥物，這無法滿足實(shí)際治療過程中所需要的具有可調(diào)節(jié)釋放動力學(xué)的按需藥物輸送。為此，研究工作者們開發(fā)了智能響應(yīng)性水凝膠，可以對ph、氧化還原電勢、酶、熱、光、磁場以及超聲等多種刺激做出響應(yīng)。其中，熱響應(yīng)水凝膠是控制釋放領(lǐng)域研究最為廣泛的智能水凝膠，也受到更多的青睞。

傳統(tǒng)的溫度敏感水凝膠多是由具有溫度響應(yīng)性相轉(zhuǎn)化的聚合物組成，例如聚(n-異丙基丙烯酰胺)(pnipam)，以及親水性聚環(huán)氧乙烷(peo)。這類聚合物會在溫度高于一個特定值時出現(xiàn)相轉(zhuǎn)變，這個溫度值通常稱為最低臨界溶液溫度(lowercriticalsolutiontemperature，lcst)。凝膠會在lcst周圍出現(xiàn)一個可逆的溶脹/收縮轉(zhuǎn)換，可以利用該特性來對藥物的釋放行為進(jìn)行控制。然而，基于lcst的溫度敏感水凝膠通常由于缺乏生物降解性等缺陷限制了其在藥物控制釋放領(lǐng)域的應(yīng)用。雖然可以通過制備由氫鍵介導(dǎo)的超分子水凝膠來提高溫度敏感水凝膠的一些物理化學(xué)特性，但是該類非共價鍵水凝膠的體內(nèi)穩(wěn)定性和粘彈性欠佳。所以，當(dāng)下亟需開發(fā)一類具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性，可自發(fā)降解，以及擁有可重復(fù)并可調(diào)節(jié)的藥物釋放動力學(xué)的溫度敏感水凝膠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種偶氮水凝膠及其制備方法，所述偶氮水凝膠是基于偶氮交聯(lián)劑的溫度敏感水凝膠。所述偶氮交聯(lián)劑(偶氮小分子交聯(lián)劑)具有溫度敏感性，可與其他多種具有高反應(yīng)活性功能基團(tuán)的高分子或小分子物質(zhì)交聯(lián)成膠，得到所述偶氮水凝膠，所述偶氮水凝膠的分子結(jié)構(gòu)中的偶氮鍵在稍高于人體溫度條件下會斷裂，從而導(dǎo)致凝膠的降解。

所述偶氮交聯(lián)劑分子中含有偶氮鍵，其分子結(jié)構(gòu)如式(i)所示：

其中，r1，r2為推電子基團(tuán)，可選自甲基、乙基、異丙基、叔丁基等；優(yōu)選地，r1，r2均為甲基。

r3為含有羰基、醛基、巰基、羧基、氨基、烯烴或者炔基等具有高反應(yīng)活性功能基團(tuán)的咪唑衍生物，如等；優(yōu)選地，r3為

本發(fā)明中，所述偶氮水凝膠為可用于人體的低溫?zé)峤到馑z，由偶氮交聯(lián)劑與含有功能基團(tuán)的高分子或者小分子物質(zhì)混合交聯(lián)而成，所述偶氮水凝膠具有熱刺激響應(yīng)性，且在稍高于人體溫度的條件下即可降解，可用于溫度刺激響應(yīng)的水凝膠藥物載體；其中，高分子或者小分子物質(zhì)所含的功能基團(tuán)(如醛基，巰基，烯烴，氨基等)與偶氮交聯(lián)劑分子的端基官能團(tuán)具有非常高的反應(yīng)活性，所述高分子或者小分子物質(zhì)選自聚乙二醇、殼聚糖、氨基糖苷類藥物等，但不局限于這些化合物。

本發(fā)明中，通過引入一種分子結(jié)構(gòu)中含有偶氮鍵的偶氮交聯(lián)劑分子，對其兩端進(jìn)行改性，引入功能反應(yīng)基團(tuán)，可交聯(lián)高分子或小分子成膠。該分子結(jié)構(gòu)中的偶氮鍵具有熱不穩(wěn)定性，稍高于人體溫度，在溫度高于44℃時偶氮鍵斷裂。所述偶氮交聯(lián)劑所制備得到的水凝膠在人體正常溫度，或者即使是在發(fā)燒或者炎癥的情況下都能保持穩(wěn)定，只有當(dāng)升溫至高于其臨界降解溫度(也就是偶氮交聯(lián)劑的分解溫度)才會發(fā)生降解。相比基于親疏水平衡的傳統(tǒng)溫度響應(yīng)體系，本發(fā)明的偶氮水凝膠為熱刺激響應(yīng)水凝膠，由化學(xué)鍵的斷裂導(dǎo)致降解，穩(wěn)定性更高，響應(yīng)性也更加精確。此外，所述偶氮交聯(lián)劑的臨界分解溫度為44℃左右，十分溫和，適用于人體生物材料用途。

本發(fā)明中，所述偶氮交聯(lián)劑分子的臨界分解溫度在44℃左右，較溫和，適合作為人體生物材料。

本發(fā)明中，所述偶氮水凝膠為可用于人體的低溫?zé)峤到馑z，具有熱降解性，其臨界降解溫度與偶氮交聯(lián)劑的分解溫度相似，室溫下處于穩(wěn)定凝膠狀態(tài)，當(dāng)溫度高于偶氮鍵的斷裂溫度44℃，交聯(lián)劑分子分解，凝膠即會降解。

本發(fā)明中，可通過溫度來控制所述偶氮水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。

本發(fā)明中，所述偶氮水凝膠安全無毒，具有良好的生物相容性，可用作藥物及生物治療因子的輸送載體。

本發(fā)明還提出了一種偶氮交聯(lián)劑，所述偶氮交聯(lián)劑的分子結(jié)構(gòu)如式(i)所示：

其中，r1，r2為推電子基團(tuán)，可選自甲基、乙基、異丙基、叔丁基等；優(yōu)選地，r1，r2均為甲基。

r3為含有羰基、醛基、巰基、羧基、氨基、烯烴或者炔基等具有高反應(yīng)活性功能基團(tuán)的咪唑衍生物，如等；優(yōu)選地，r3為

本發(fā)明中，所述偶氮水凝膠可通過溫度來調(diào)控其所裝載的生物活性物質(zhì)，如蛋白、藥物及生物活性因子的釋放，并可通過溫度來精確控制所裝載的活性物質(zhì)的釋放。

本發(fā)明還提出了所述偶氮水凝膠在體內(nèi)或體外作為蛋白、藥物及生物活性因子載體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述偶氮水凝膠在智能運(yùn)輸載體、智能醫(yī)用材料等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于，所述偶氮水凝膠具備以下特點(diǎn)：(1)本發(fā)明中偶氮水凝膠為熱降解水凝膠，由化學(xué)鍵交聯(lián)而成，且降解是由于化學(xué)鍵的斷裂所導(dǎo)致，水凝膠整體具有良好的穩(wěn)定性。(2)所述偶氮水凝膠的臨界降解溫度十分溫和，為44℃左右，適于作為人體生物材料。(3)所述偶氮水凝膠可用于生物活性分子以及藥物的載體，控制釋放所運(yùn)載的生物活性物質(zhì)，具有可調(diào)控的釋放動力學(xué)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中偶氮交聯(lián)劑azo44的合成路線及分子結(jié)構(gòu)。

圖2為實(shí)施例1中偶氮交聯(lián)劑azo44的一維核磁氫譜圖。

圖3為實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠的成膠照片。

圖4為實(shí)施例3中所制備的azo44偶氮水凝膠的形態(tài)與溫度的關(guān)系。

圖5為實(shí)施例3中所制備的戊二醛水凝膠的形態(tài)與溫度的關(guān)系。

圖6為實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠的機(jī)械性能與溫度的關(guān)系。

圖7為實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠的降解行為與溫度的關(guān)系。

圖8為實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠對生物活性分子的控制釋放行為與溫度的關(guān)系。

圖9為實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠的生物毒性測試。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、試驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1：基于偶氮二異丁基咪唑啉的偶氮交聯(lián)劑的合成

以偶氮二異丁基咪唑啉為例，其分子結(jié)構(gòu)中的偶氮鍵斷裂溫度為44℃，將其兩端修飾為醛基。

具體合成方法：室溫下，將2.18ml的氯化亞砜與0.15mldmf先后逐滴加入對醛基苯甲酸(3.0g)的苯溶液(20ml)中，持續(xù)攪拌該混合物，并加熱回流2h?？捎^察到該反應(yīng)混合物逐漸由懸濁狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻?。待反?yīng)結(jié)束后，通過減壓蒸餾除去多余的溶劑和氯化亞砜。將偶氮二異丁咪唑啉(1.25g，5mmol)與三乙胺(5.57ml,40mmol)溶于50ml氯仿中，并置于冰浴條件下，然后將上述活化的對醛基苯甲酸溶液逐滴加入其中，反應(yīng)在室溫下攪拌12h結(jié)束。將上述反應(yīng)混合溶液加入到甲醇中(0.43ml,10mmol)，用飽和碳酸鈉溶液清洗兩次(10ml×2)，之后用無水硫酸鈉干燥濃縮，并用色譜柱純化(氯仿/甲醇＝80:1)，得到淡黃色的粉末(2.10g)。將該淡黃色粉末溶于4ml丙酮并攪拌2h，最終過濾得到白色的粉末，為兩端修飾有醛基的偶氮交聯(lián)劑azo44(1.65g，64％)。反應(yīng)路線及所得偶氮交聯(lián)劑的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。偶氮交聯(lián)劑的¹hnmr如圖2所示。

實(shí)施例2：偶氮水凝膠的制備

將實(shí)施例1制備得到的偶氮交聯(lián)劑(azo44)以及氨基端四臂聚乙二醇分別配制成50mg/ml的偶氮交聯(lián)劑溶液以及100mg/ml的氨基端四臂聚乙二醇溶液。之后，分別取50μl的偶氮交聯(lián)劑azo44溶液與100μl聚乙二醇溶液混合，約10分鐘可形成凝膠。

如進(jìn)一步降低偶氮交聯(lián)劑溶液濃度，會影響成膠?；蛘哌M(jìn)一步降低聚乙二醇溶液的濃度，成膠時間會延長，一旦低于85mg/ml則會影響成膠。所得凝膠圖片如圖3所示，將樣品瓶倒置5min，該體系能克服重力呈穩(wěn)定狀態(tài)且無任何流動發(fā)生，從而可確定本發(fā)明中偶氮水凝膠的形成。

實(shí)施例3：偶氮水凝膠的熱響應(yīng)性

將實(shí)施例1制備得到的偶氮交聯(lián)劑azo44(50μl,50mg/ml)與氨基末端的四臂聚乙二醇(100μl，100mg/ml)混合，振蕩大約10分鐘成膠，得到所述azo44偶氮水凝膠。并將所形成的凝膠依次置于43℃，44℃，45℃下，觀察其凝膠狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖4所示，所制備的azo44偶氮水凝膠在43℃能保持穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度高于44℃時，凝膠逐漸降解。

此外，用戊二醛與氨基末端的四臂聚乙二醇所形成的凝膠作為參照。將所形成的戊二醛凝膠依次置于47℃，70℃，100℃下，觀察其形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，戊二醛凝膠在高溫狀態(tài)下依舊保持十分穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)，并未出現(xiàn)降解現(xiàn)象。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出：偶氮交聯(lián)劑azo44所形成的凝膠由于交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)中的偶氮鍵具有溫度不穩(wěn)定性，從而使得凝膠具有熱降解性。分子結(jié)構(gòu)中不含有任何溫敏基團(tuán)的戊二醛，其所形成的凝膠在高溫下持久穩(wěn)定，也側(cè)面證實(shí)了偶氮類凝膠溫度響應(yīng)性的機(jī)理。

實(shí)施例4：偶氮水凝膠的機(jī)械性能與溫度之間的關(guān)系

研究實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠的機(jī)械性能與溫度之間的關(guān)系，具體方法為：將azo44所形成的凝膠(azo44膠)直接放置在流變儀的平行鋁板上，之后依次在43℃,44℃,45℃與47℃下檢測了azo44凝膠的彈性模量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖6所示，azo44偶氮水凝膠的存儲模量g’在43℃時一直處于恒定狀態(tài)，大約為1170pa左右，當(dāng)溫度升至44℃時，存儲模量出現(xiàn)些許下降，說明凝膠的強(qiáng)度開始降低，當(dāng)溫度超過44℃時，凝膠的存儲模量出現(xiàn)明顯下降，下降趨勢隨著溫度的升高更為明顯。彈性模量的變化趨勢進(jìn)一步證明了該類偶氮水凝膠具有熱刺激響應(yīng)性，且azo44偶氮水凝膠的臨界溶解溫度與偶氮交聯(lián)劑的分解溫度相似，為44℃左右，較為溫和，適宜作為生物材料使用。因此，本發(fā)明中，可通過溫度來控制所述偶氮水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。

實(shí)施例5：偶氮水凝膠的降解行為與溫度之間的關(guān)系

研究實(shí)施例2中所制備的azo44偶氮水凝膠的降解行為與溫度的關(guān)系，具體方法為將azo44偶氮水凝膠分別保持在37℃以及47℃，每隔5分鐘將降解所得到的溶液用移液器輕輕移除，稱量并記錄剩余凝膠的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖7所示，azo44偶氮水凝膠在37℃時質(zhì)量保持恒定，而在47℃時的質(zhì)量隨著時間持續(xù)降低，進(jìn)一步說明了該凝膠的熱降解性能，在人體正常溫度下保持穩(wěn)定狀態(tài)，但在稍高于人體溫度下即會逐漸降解。

實(shí)施例6：偶氮水凝膠的溫度響應(yīng)性控制釋放行為

研究實(shí)施例2中的azo44偶氮水凝膠對生物活性大分子的控制釋放行為。具體試驗(yàn)方法為：將100μg的溶菌酶混入到200μlazo44偶氮水凝膠中，之后加入2ml25℃的磷酸緩沖溶液(ph7.4)，每隔10分鐘采集300μl的釋放溶液，30分鐘后，將凝膠置于45℃的磷酸緩沖溶液中(ph7.4)，每10分鐘采集300μl的釋放溶液。所釋放的溶菌酶通過紫外-可見光譜進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖8所示，當(dāng)在室溫條件下，azo44凝膠可以維持穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)，僅有少量的溶菌酶通過自由擴(kuò)散釋放而出。當(dāng)放入45℃的體系中，溶菌酶被大量釋放而出，呈現(xiàn)出“on-off”開關(guān)式的釋放行為，這正是由于azo44結(jié)構(gòu)中的偶氮雙鍵在45℃下會斷裂，導(dǎo)致凝膠逐漸降解，從而快速釋放出包裹在凝膠中的溶菌酶。由此可得，本發(fā)明所制備的偶氮水凝膠可通過溫度來控制所裝載的生物活性物質(zhì)的釋放。

實(shí)施例7：偶氮水凝膠的細(xì)胞毒性檢測

研究實(shí)施例2中制備得到的azo44凝膠的生物毒性，具體試驗(yàn)方法為：直接在96孔板內(nèi)形成azo44凝膠，之后在該孔板內(nèi)的凝膠上接種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(nih3t3)，接種密度為5000細(xì)胞/孔，37℃，5％co2，完全培養(yǎng)基條件下孵育24h。隨后采用ao/eb染色法對該細(xì)胞進(jìn)行染色，并用熒光顯微鏡拍照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖9所示，在azo44凝膠上孵育24h后，nih3t3細(xì)胞仍保持良好的形態(tài)和較高的細(xì)胞存活率，說明該凝膠不具有生物毒性，可作為生物材料用途。

上述實(shí)施例只是為了說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡是根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容的實(shí)質(zhì)所做出的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。