本發(fā)明提供了鐵線蓮耐熱性基因位點qHR1的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域，專用于定向培育耐熱的鐵線蓮新品種。
背景技術：
：鐵線蓮屬(Clematis)為毛茛科(Ranunculaceae)植物，多年生木質藤本。鐵線蓮屬觀賞品種的花型、花色豐富多樣，花朵美麗繁茂，花期從早春至晚秋，具有單年多次開花的特性，觀賞價值極高，是非常優(yōu)良的垂直綠化材料，享有“攀援植物皇后”的美稱。鐵線蓮屬植物在歐洲等國的立體園林綠化中已占據十分重要的地位，亦受到我國園林界和愛好者的喜愛。但是鐵線蓮栽培品種大部分不耐熱，夏季高溫易導致鐵線蓮嫩葉萎蔫，花朵畸形，花期縮短，因此培育耐熱性強的鐵線蓮品種已成為我國乃至世界鐵線蓮育種的目標之一。SSR分子標記是目前應用最廣泛的分子標記技術之一，被廣泛的應用于基因定位、QTL定位、標記輔助育種和遺傳連鎖圖譜的構建等方面。陳永霞等(陳永霞,張新全,馬嘯,謝文剛.SSR標記與扁穗牛鞭草農藝性狀關聯分析.湖北農業(yè)科學,2011,50(7):1494-1498.)選用10對SSR引物對44份外部形態(tài)差異較大的扁穗牛鞭草進行掃描，進行性狀與SSR標記的關聯分析，其中找到18個SSR標記與8個農藝性狀顯著相關，并篩選出優(yōu)異種質，加快扁穗牛鞭草的育種進程。前期研究發(fā)現鐵線蓮材料間的耐熱性存在顯著差異，根據綜合耐熱指標可以將其分為不耐熱、耐熱性中等、較耐熱和耐熱等4個組(馬育珠，李林芳，高露璐等.利用隸屬函數法對鐵線蓮屬苗期耐熱性的綜合評價.中國觀賞園藝研究進展,2016，348-354.)。因此，對鐵線蓮群體開展田間耐熱指數鑒定和關聯分析，可能檢測到鐵線蓮耐熱性主效基因或分子標記。目前還未見相關研究的論文或專利。技術實現要素：一、技術問題：1鐵線蓮材料間的耐熱性差異顯著，其中，大花園藝系品種因花大色艷、花期長等特點受到喜愛，但是夏季高溫天氣導致花期變短、花朵畸形和易枯，嫩枝葉萎蔫，影響鐵線蓮的夏季觀賞品質。提高鐵線蓮栽培品種的耐熱性，將是鐵線蓮育種的方向之一。2鐵線蓮花卉耐熱性育種存在周期長、費時費力等問題，開展早代選擇有利于縮短育種周期、降低育種成本，分子標記是開展早代選擇的重要工具之一，因此開發(fā)相關分子標記對鐵線蓮耐熱性育種具有重要意義。二、技術方案：利用SSR分子標記引物CNSSR80的正向引物序列5’-ACAAGAGAAAACCCGAAA-3’和反向引物序列5’-GCAGTCCCAGCCGAG-3’結合PCR技術擴增鐵線蓮嫩葉的基因組DNA，如果能擴增出230bp的DNA片段，則表明鐵線蓮耐熱主效基因位點qHR1的存在，利用TASSEL2.1軟件的GLM程序和MLM程序，測得其對鐵線蓮耐熱性位點的分別解釋8.96%和5.47%的表型變異。三、有益效果：本發(fā)明首次公布了一個鐵線蓮耐熱性的主效基因位點及其分子標記，該標記將有利于縮短鐵線蓮耐熱性的育種周期，降低育種成本，定向培育鐵線蓮耐熱性強的鐵線蓮品種，促進鐵線蓮栽培品種的推廣，最終為提高鐵線蓮栽培品種在我國夏季高溫天的觀賞性奠定基礎。四、具體實施方式(一)鐵線蓮耐熱指數的統計分析2014和2015年6-9月，高溫（T≥30℃）持續(xù)三天后觀察記錄江蘇省中國科學院植物研究所鐵線蓮苗圃中的供試材料的熱害癥狀。熱害癥狀分級標準參照文獻（康俊根，2002）并略有改動，系統全面地觀察鐵線蓮高溫傷害的表現（葉色、新葉、老葉、花）及發(fā)生規(guī)律，觀察項目及級數為：（1）葉色，0級：正常，無熱害癥狀；1級：小部分葉黃；2級：大部分葉黃；3級：枯黃發(fā)黑.（2）新葉萎蔫程度，0級：正常，無熱害癥狀；1級：新葉萎蔫；2級：新葉部分干枯；3級：新葉完全干枯。（3）老葉萎蔫程度，0級：正常，無熱害癥狀；1級：基部葉片部分萎蔫；2級：基部葉片完全萎蔫；3級：整株葉片干枯.（4）花朵萎蔫程度，0級：正常，無熱害癥狀；1級：花瓣部分萎蔫；2級：花瓣完全萎蔫；3級：花朵枯黃。每個品種或野生種選3株進行觀測。根據2014年和2015年觀察記錄的熱害性狀，分別計算出供試材料的熱害指數。熱害指數=Σ各株級數/(最高級數×總株數)×100％。(二)鐵線蓮群體遺傳結構分析利用CTAB法提取鐵線蓮嫩葉基因組DNA，然后用100對SSR引物和106對SRAP引物隨機PCR擴增12個鐵線蓮家系DNA，結果發(fā)現44對SSR引物和22對SRAP引物可以成功的擴增出條帶清晰且多態(tài)性好的條帶，合成引物的可用性為44%。44對SSR引物的多態(tài)性頻率介于19%～83%，平均的多態(tài)性頻率為52%，22對SRAP引物的多態(tài)性頻率介于12%～62%，平均的多態(tài)性頻率為34%，（表1）。SSR和SRAP引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。PCR擴增體系為10μL包括20ng基因組DNA，2.5mM的MgCl2，0.5mM的dNTPs，20ng的引物，0.5UTaqDNA聚合酶。PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸60秒，循環(huán)32次，最后72℃延伸5分種。PCR反應在伯樂T100PCR儀上完成。PCR擴增產物檢測：利用8%濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行PCR產物檢測，上樣量為1.5μL，電泳緩沖液為1×TBE，電壓設為220V，電泳至溴酚藍帶跑出膠最低端為止。膠片用銀染方法染色：先用固定液（去離子水、10%乙醇、1%乙酸）固定10min，再1.5%硝酸銀溶液浸泡10min，去離子水迅速洗滌2遍后，顯色液（去離子水、1.5%氫氧化鈉、1%甲醛）顯色10min，最后用去離子水沖洗，放入膠片觀察燈上拍照。以二進制記錄SSR引物擴增結果，同一位點上具有相同遷移率的條帶記為1，無帶記為0，獲得127份鐵線蓮材料的基因型數據。利用Structure2.1軟件結合基因型數據對鐵線蓮屬群體結構進行分析，結果表明對應似然值lnP(D)隨K值的增大而持續(xù)增大，因此參照Evanno等(EvannoG,RegnautS,GoudetJ.DetectingthenumberofclustersofindividualsusingthesoftwareSTRUCTURE:asimulationstudy.Molecularecology,2005,14(8):2611-2620.)通過△K來確定K值?！鱇在K=2時出現峰值，所以127份鐵線蓮材料可被分為2個亞群。將K=2代入Structure軟件重新運算，得到各個材料的對應Q值，作為下一步耐熱指數與SSR標記關聯分析的協變量，可以有效降低群體結構對關聯分析的影響。表144對SSR和SRAP引物的擴增片段多態(tài)性引物多態(tài)性條帶多態(tài)率（%）引物多態(tài)性條帶多態(tài)率（%）引物組合多態(tài)性條帶多態(tài)率（%）SSR1440%SSR63372%SRAP1Me2Em11333%SSR2360%SSR66377%SRAP4Me1Em16350%SSR5328%SSR68357%SRAP8Me11Em16422%SSR8352%SSR69337%SRAP14Me10Em5312%SSR15361%SSR70366%SRAP15Me9Em3424%SSR20344%SSR72353%SRAP16Me9Em2412%SSR26338%SSR74383%SRAP19Me8Em15516%SSR31328%SSR76380%SRAP21Me8Em13619%SSR34319%SSR78372%SRAP22Me8Em11433%SSR35328%SSR80361%SRAP23Me7Em7339%SSR36340%SSR82355%SRAP24Me7Em6347%SSR37367%SSR84349%SRAP25Me7Em5455%SSR38383%SSR85344%SRAP26Me7Em4521%SSR39351%SSR86342%SRAP27Me7Em3349%SSR49331%SSR90345%SRAP28Me7Em2432%SSR51334%SSR91338%SRAP29Me7Em1362%SSR53373%SSR92365%SRAP30Me6Em18424%SSR56332%SSR93369%SRAP31Me6Em16451%SSR57354%SSR95367%SRAP32Me6Em15322%SSR58337%SSR96327%SRAP33Me6Em13339%SSR59321%SSR97371%SRAP41Me4Em15324%SSR62355%SSR98373%SRAP42Me1Em15362%(三)鐵線蓮耐熱性的關聯分析利用TASSEL2.1軟件的GLM程序和MLM程序以127份材料對應的Q值為協變量，將44個SSR標記和22個SRAP標記與耐熱指數進行線性回歸分析，結果檢測到1個耐熱性的QTL，命名為qHR1。QTL位點qHR1緊密連鎖的標記為CNSSR80，解釋的表型變異率分別為8.96%和5.47%。CNSSR80的正向引物序列是：5’-ACAAGAGAAAACCCGAAA-3’，反向引物序列為：5’-GCAGTCCCAGCCGAG-3’，擴增片段大小為230bp。SEQUENCELISTING<110>江蘇省中國科學院植物研究所<120>鐵線蓮耐熱性基因位點qHR1的分子標記方法<130>說明書<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>Clematisapiifolia<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<220><221>CNSSR80正向引物<222>(1)..(18)<400>1acaagagaaaacccgaaa18<210>2<211>15<212>DNA<213>Clematisapiifolia<220><221>CNSSR80反向引物<222>(1)..(15)<400>2gcagtcccagccgag15當前第1頁1 2 3