本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域篩選生產(chǎn)特定產(chǎn)物的新菌株的方法，具體涉及一種具有細(xì)菌纖維素高生產(chǎn)能力的細(xì)菌菌株的篩選方法
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，簡(jiǎn)稱(chēng)BC)是一種由革蘭氏陰性產(chǎn)酸菌合成的、優(yōu)良天然可降解纖維素，通常指由醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和八疊球菌屬(Sarcina)等微生物，在不同條件下合成的纖維素的統(tǒng)稱(chēng)。BC和植物等產(chǎn)生的天然纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的高分子化合物，但細(xì)菌纖維素卻有許多更加優(yōu)異的性質(zhì)：具有巨大的表面積、較高持水率和壓縮性能，高抗張強(qiáng)度；微纖維直徑約為0.1μm，比木質(zhì)纖維小300倍【S.S.Kim，S.Y.Lee，K.J.Park，et al.Saudi Journal of Biological Sciences，2015】；高純度高結(jié)晶度；較高的生物相容性和良好的生物可降解性；合成時(shí)可調(diào)控性等等。因此BC已被廣泛應(yīng)用于食品添加、包裝材料、造紙、生物醫(yī)藥、聲學(xué)器材等諸多領(lǐng)域【盧美歡，馬英輝，王銀存等.中國(guó)釀造，2013，32(7)：46-49】。
以椰子水等為原料篩選產(chǎn)BC菌株起步較早，發(fā)展較為迅速，利用椰子水的高營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行產(chǎn)BC菌株的優(yōu)化培養(yǎng)以提高產(chǎn)量的研究均已發(fā)展較為成熟。隨著近年來(lái)椰子系列產(chǎn)品在食品市場(chǎng)上占據(jù)越來(lái)越多的份額，而椰子原產(chǎn)地在我國(guó)地域上十分受限，導(dǎo)致椰子的成本呈逐年遞增趨勢(shì)，除此之外，不同的椰子水，同樣的產(chǎn)纖維培養(yǎng)基配方，纖維素產(chǎn)量差異較大【王志國(guó)，鐘春燕，王錫彬等.中國(guó)釀造，2009，4：32-34】，經(jīng)濟(jì)上不利于發(fā)展BC的研究和生產(chǎn)工作。于是學(xué)者們將目光擴(kuò)至營(yíng)養(yǎng)豐富、來(lái)源廣泛的營(yíng)養(yǎng)源上。在此方向上，學(xué)者們?nèi)諠u探索出一些用其他原料篩選細(xì)菌纖維素的方法。利用一些天然原料，如水果類(lèi)原料、糖質(zhì)原料、低值淀粉類(lèi)原料和廢棄纖維素類(lèi)原料等均被用來(lái)嘗試作篩選產(chǎn)BC菌株的原料【謝健健，洪楓.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2011，19(3)：68-74】。利用一些發(fā)酵生產(chǎn)廢水，如酒糟廢水、釀醋廢水【JM Wu，RH Liu.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115(3)：284-290】或者農(nóng)林廢棄物及副產(chǎn)物【楊光，王彩霞.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2015，(23)4：67】等作為篩菌原料，既能充分利用廢棄有機(jī)物質(zhì)中所含的豐富的碳源等成分，又在一定程度上緩解由于大量棄埋所形成的固體有機(jī)污染物垃圾以及生產(chǎn)污水排放污染，充分體現(xiàn)綠色環(huán)保的可持續(xù)原則?？紤]到我國(guó)水果物產(chǎn)豐富，且水果的生產(chǎn)具有明顯的季節(jié)性變化，容易發(fā)生水果大量腐敗而丟棄處理的浪費(fèi)現(xiàn)象，選取腐敗水果作篩選產(chǎn)BC菌株的原料來(lái)源【周勝虎，薛齊佳，劉傳鳳等.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52(15)：3514-3517】，成為深具潛力的發(fā)展趨勢(shì)。
自然篩選得到的產(chǎn)BC菌株的產(chǎn)量往往較低，相對(duì)于培養(yǎng)基成本其經(jīng)濟(jì)性較差，提高菌株產(chǎn)BC的能力成為迫切需要。研究者們關(guān)于BC的生產(chǎn)方式分別以靜態(tài)培養(yǎng)與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)兩種方式做了大量對(duì)比研究【朱宏陽(yáng)，馮珊，楊宏芳等.海峽藥學(xué)，2015，27(12)：265-268】，分別能滿足不同的產(chǎn)品需求；常用單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)【張?chǎng)?，葛萬(wàn)云，齊香君.食品研究與開(kāi)發(fā)，2015，36(18)：106-110】以及響應(yīng)面法【周蓮，盧紅梅，陳莉等.中國(guó)調(diào)味品，2016，41(2)：69-73】等來(lái)確定產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株的最佳碳氮源與培養(yǎng)基【Faranak Mohammadkazemia，Mehrdad Azinb，Alireza Ashoric.Carbohydrate Polymers，2015，117：518-523】等最優(yōu)生產(chǎn)條件。除此之外，等離子體注入誘變【張桂才，賈士儒，閆林等.現(xiàn)代食品科技，2010，26(12)：1354-1357】、紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變【張銀冰.食品工程，2014，2：42-45】【鄧毛程，李靜，王瑤等.食品工業(yè)科技，2015，36(4)：159-162】、高靜水壓處理誘變【林德慧，杜雙奎，李志西等.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，39(3)：119-124】、低能N+離子束輻照誘變【張?chǎng)?，李成濤，李彥軍?現(xiàn)代食品科技，2015，31(5)：144-149】、紫外低溫復(fù)合誘變【王良等.生物化工，2016，2(2)：20-25】等方法，被應(yīng)用到提高菌株產(chǎn)BC能力的研究中，均取得一定的積極成果，但也存在很多不足之處亟待改善。等離子體注入法誘變機(jī)制復(fù)雜，尚未全部被掌握，隨之可能發(fā)生誘變菌株最優(yōu)生產(chǎn)條件的改變，在實(shí)踐應(yīng)用上帶來(lái)很大的不確定性；紫外誘變的操作要求嚴(yán)苛，必須在暗處進(jìn)行，否則容易發(fā)生光修復(fù)使誘變效率低下；高靜水壓處理法對(duì)菌株的誘變方向不明確從而難以掌控，存在可能改變菌株的某些正常遺傳物質(zhì)而導(dǎo)致其他生理性狀的改變。誘變的方法普遍存在結(jié)果隨機(jī)性較大的不足之處，正向突變率極低導(dǎo)致工作量的增大，致使總的工作效率低下；大多的誘變操作不能保證傳代和遺傳的穩(wěn)定性，導(dǎo)致菌株產(chǎn)量波動(dòng)較大，甚至?xí)u漸失去高產(chǎn)的優(yōu)異性質(zhì)，反而進(jìn)一步增大生產(chǎn)成本；誘變法在實(shí)現(xiàn)BC產(chǎn)量提高的同時(shí)，可能導(dǎo)致菌株其他性能的變化以至于不再符合實(shí)際生產(chǎn)的需求。誘變法所得的高產(chǎn)菌株即使是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模中取得較好的進(jìn)步，其高產(chǎn)性能以及經(jīng)濟(jì)性在中試以及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。因此，采取有效的方法，從自然環(huán)境中直接篩選性能優(yōu)良的BC高產(chǎn)菌株尤為必要。目前已有不少研究者嘗試從不同菌源做產(chǎn)BC菌株的篩選，并對(duì)其培養(yǎng)條件做了優(yōu)化【王雪奇，應(yīng)以堅(jiān)，金亞倩等.輕工科技，2015，(11)：6-8】，但是成功篩選出高產(chǎn)BC菌株的實(shí)例仍屈指可數(shù)，且生產(chǎn)成本仍居高不下。篩選高產(chǎn)BC菌株的方法還有待深入研究。本發(fā)明提供一種具有BC高生產(chǎn)能力的細(xì)菌菌株的篩選方法，該方法從自然接種于空氣的富含豐富營(yíng)養(yǎng)成分以及微量元素的腐敗水果中或從天然土壤中，進(jìn)行BC高產(chǎn)菌株的篩選。該方法無(wú)額外引入繁雜的操作，低廉有效，并且從自然中取材，不產(chǎn)生任何污染，操作周期簡(jiǎn)短，便于大規(guī)模的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選具有BC高生產(chǎn)能力菌株的方法，具體步驟包括：
菌株來(lái)源于自然接種的腐敗水果或土壤，把土樣懸浮液及水果破碎過(guò)濾后稀釋的濾液接種至富集培養(yǎng)基中，30℃，150～200r/min振蕩培養(yǎng)24h，將制得的菌懸液10倍梯度稀釋后，選擇3個(gè)合適稀釋倍數(shù)的菌懸液各100～200μL，涂布在表面含有碳酸鈣層的分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各2～3個(gè)平行樣，30℃，pH＝6.8～7.0培養(yǎng)3～5d。挑取周邊有透明區(qū)域的菌落劃線培養(yǎng)，得到純菌單菌落。接種單菌落于HS發(fā)酵培養(yǎng)基，27～31℃，pH＝3.5～7.0，120～180r/min培養(yǎng)2～14d，將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株進(jìn)行斜面保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：1.篩菌原材料取自菌種含量豐富且廣泛易得的土壤、營(yíng)養(yǎng)豐富卻極易腐敗而導(dǎo)致大量有機(jī)固體垃圾、惡臭產(chǎn)生的水果。土壤是微生物的物種庫(kù)，為此類(lèi)篩菌工作提供了極大的可行性，土壤的取材簡(jiǎn)便易行，且隨取材地的不同提供不同種類(lèi)優(yōu)良性狀的菌種。水果養(yǎng)分富裕但儲(chǔ)存運(yùn)輸條件要求苛刻而容易腐敗，取材自腐敗的水果起到廢物利用的作用，充分發(fā)揮水果營(yíng)養(yǎng)高的特點(diǎn)，體現(xiàn)綠色環(huán)保的發(fā)展規(guī)律。兩種材料皆成本低廉，廣泛易得，且利于菌種的富集。
2.本課題組采用該發(fā)明方法從自然接種于空氣的腐敗水果中或從天然土壤中進(jìn)行高產(chǎn)BC菌株的篩選，并且取得了較理想的成果。該方法所篩出的產(chǎn)BC菌株產(chǎn)酸量明顯高于市場(chǎng)上購(gòu)得的產(chǎn)BC菌株-木醋桿菌，并且產(chǎn)量也有很大幅度的提升。經(jīng)掃描電鏡圖像明顯看出，該方法所篩出的產(chǎn)BC菌株分子結(jié)構(gòu)、孔隙度等性能與市場(chǎng)所售木醋桿菌所產(chǎn)細(xì)菌纖維素存在明顯差異。
下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1.制定篩選方案
實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自各處采集的土樣以及腐敗的蘋(píng)果、梨、西瓜、柑橘類(lèi)、哈密瓜等10余種水果的果皮與果肉、茶水等。將采集的樣品分別進(jìn)行預(yù)處理后，將其中或表面所含的菌種全部溶解在水中，制得菌懸液。將制得的菌懸液按梯度稀釋后選擇若干合適稀釋倍數(shù)的菌懸液進(jìn)行稀釋涂布，用本課題組自制的分層的分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)出茂盛的菌落后，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復(fù)純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。將所篩得的產(chǎn)酸菌接種至斜面培養(yǎng)基保存于冰箱。待用時(shí)從冰箱中取出斜面培養(yǎng)基先后接種至常溫下的保存培養(yǎng)基、種子活化液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株復(fù)活。將活化后的種子液接入HS發(fā)酵培養(yǎng)基分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)，對(duì)能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株作深度測(cè)試表征。
實(shí)施例2.不同培養(yǎng)基及溶液配方方案
(1)富集培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨3g，甘露醇25g，蒸餾水1000ml。pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(2)分離培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，酵母粉5g，輕質(zhì)碳酸鈣7g，瓊脂粉12g，蒸餾水1000ml，pH＝6.8～7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻到50℃后加無(wú)水乙醇5ml。
(3)斜面保存培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，酵母粉5g，瓊脂粉12g，蒸餾水1000ml。分裝后121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(4)HS發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，檸檬酸1.15g，磷酸氫二鈉4g，蒸餾水1000ml。pH＝3.5～7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻到50℃后加無(wú)水乙醇20ml。
(5)種子活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO415g，蒸餾水1000ml。pH自然、121℃高壓蒸汽滅菌20min；冷卻到50℃后加無(wú)水乙醇20ml。
實(shí)施例3.土壤樣品產(chǎn)BC菌株的篩選與保存
(1)菌懸液的制備：實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自各處采集的土樣進(jìn)行預(yù)處理，去除其中的粗礫雜草根等雜物質(zhì)，稱(chēng)取10g左右經(jīng)預(yù)處理的土樣，用無(wú)菌水溶解于小燒杯，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，確保土樣中的菌種全部溶解在水中，對(duì)土樣懸濁液進(jìn)行抽濾至燒杯中，可將過(guò)濾后的濾液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。將土樣抽濾后的濾液接種至已滅菌處理的富集培養(yǎng)基中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，制得土樣菌懸液。
(2)稀釋涂布培養(yǎng)：將制得的土樣菌懸液按10倍梯度稀釋后選擇合適稀釋倍數(shù)，如10-6、10-7、10-8倍的菌懸液各100μL，涂布在已滅菌處理具有產(chǎn)酸菌篩選層的碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各3個(gè)平行樣，在已除菌的超凈臺(tái)中30℃培養(yǎng)3d，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復(fù)純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。每一株產(chǎn)酸菌單獨(dú)標(biāo)記并接種至斜面保存培養(yǎng)基，置于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)生長(zhǎng)至菌落茂盛后，轉(zhuǎn)移至-4℃冰箱中保存菌種。
(3)低溫保存的產(chǎn)酸菌株的活化：從冰箱中保存的斜面培養(yǎng)基接種菌株至新的已滅菌處理的斜面培養(yǎng)基，置于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)生長(zhǎng)至菌落茂盛。
(4)種子液的制備：于活化的斜面試管培養(yǎng)基中接種2～3環(huán)菌苔，接種至已滅菌處理的種子活化液體培養(yǎng)基。30℃，130r/min振蕩培養(yǎng)24h。
(5)產(chǎn)凝膠狀產(chǎn)物菌株的篩選：以10％的接種量，將活化后的種子液接入已滅菌的裝有100mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中，或直接接種產(chǎn)酸菌單菌落2～3環(huán)于已滅菌處理的HS發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口后，分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)：靜態(tài)培養(yǎng)于超凈臺(tái)內(nèi)室溫靜置培養(yǎng)5d；動(dòng)態(tài)培養(yǎng)為30℃，180r/min培養(yǎng)2d。將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株留用。
實(shí)施例4.水果產(chǎn)BC菌株的篩選與保存。
(1)菌懸液的制備：實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自各種腐敗的蘋(píng)果、梨、西瓜、柑橘類(lèi)、哈密瓜等10余種水果的果皮與果肉。將采集的腐敗水果樣品進(jìn)行預(yù)處理，稱(chēng)取10g左右經(jīng)預(yù)處理的樣品，完全破碎后用無(wú)菌水沖洗至小燒杯，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，確保土樣中的菌種全部溶解在水中，將適當(dāng)稀釋過(guò)濾后的濾液接種至已滅菌處理的富集培養(yǎng)基中，30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24h，水果樣品制得菌懸液。
(2)稀釋涂布培養(yǎng)：將制得的水果樣品菌懸液按10倍梯度稀釋后選擇3個(gè)合適稀釋倍數(shù)的菌懸液，如10-7、10-8、10-9倍的，各150μL，涂布在已滅菌處理具有產(chǎn)酸菌篩選層的碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各3個(gè)平行樣，在已除菌的超凈臺(tái)中30℃培養(yǎng)4d，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復(fù)純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。每一株產(chǎn)酸菌單獨(dú)標(biāo)記并接種至斜面保存培養(yǎng)基，置于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)生長(zhǎng)至菌落茂盛后，轉(zhuǎn)移至-4℃冰箱中保存菌種。
(3)低溫保存的產(chǎn)酸菌株的活化：從冰箱中保存的斜面培養(yǎng)基接種菌株至新的已滅菌處理的斜面培養(yǎng)基，置于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)生長(zhǎng)至菌落茂盛。
(4)種子液的制備：于活化的斜面試管培養(yǎng)基中接種2～3環(huán)菌苔，接種至已滅菌處理的種子活化液體培養(yǎng)基。30℃，130r/min振蕩培養(yǎng)24h。
(5)產(chǎn)凝膠狀產(chǎn)物菌株的篩選：以10％的接種量，將活化后的種子液接入已滅菌的裝有100mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中，或直接接種產(chǎn)酸菌單菌落2～3環(huán)于已滅菌處理的HS發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口后，分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)：靜態(tài)培養(yǎng)于超凈臺(tái)內(nèi)室溫靜置培養(yǎng)7d；動(dòng)態(tài)培養(yǎng)為30℃，180r/min培養(yǎng)7d。將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株留用。
實(shí)施例5.茶水樣品產(chǎn)BC菌株的篩選與保存
(1)菌懸液的制備：實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自各種用無(wú)菌水浸泡茶葉所得茶水等進(jìn)行過(guò)濾等預(yù)處理，去除其中的固體物質(zhì)，充分浸泡出茶水中營(yíng)養(yǎng)以及確保菌種全部溶解在水中，稱(chēng)取10ml左右經(jīng)預(yù)處理的茶水于小燒杯，對(duì)茶水液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。將稀釋后的濾液接種至已滅菌處理的富集培養(yǎng)基中，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，制得茶水樣菌懸液。
(2)稀釋涂布培養(yǎng)：將制得的茶水樣菌懸液按10倍梯度稀釋后選擇合適稀釋倍數(shù)，如10-6、10-7、10-8倍的菌懸液各200μL，涂布在已滅菌處理具有產(chǎn)酸菌篩選層的碳酸鈣分離培養(yǎng)基上，每種稀釋濃度各3個(gè)平行樣，在已除菌的超凈臺(tái)中30℃培養(yǎng)5d，挑取周邊有透明區(qū)域的菌落反復(fù)純化劃線培養(yǎng)，得到產(chǎn)酸單菌落。每一株產(chǎn)酸菌單獨(dú)標(biāo)記并接種至斜面保存培養(yǎng)基，置于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)生長(zhǎng)至菌落茂盛后，轉(zhuǎn)移至-4℃冰箱中保存菌種。
(3)低溫保存的產(chǎn)酸菌株的活化：從冰箱中保存的斜面培養(yǎng)基接種菌株至新的已滅菌處理的斜面培養(yǎng)基，置于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)生長(zhǎng)至菌落茂盛。
(4)種子液的制備：于活化的斜面試管培養(yǎng)基中接種2～3環(huán)菌苔，接種至已滅菌處理的種子活化液體培養(yǎng)基。30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)24h。
(5)產(chǎn)凝膠狀產(chǎn)物菌株的篩選：以10％的接種量，將活化后的種子液接入已滅菌的裝有100mLHS發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL廣口瓶中，或直接接種產(chǎn)酸菌單菌落2～3環(huán)于已滅菌處理的HS發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口后，分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)、靜態(tài)培養(yǎng)：靜態(tài)培養(yǎng)于超凈臺(tái)內(nèi)室溫靜置培養(yǎng)14d；動(dòng)態(tài)培養(yǎng)為30℃，180r/min培養(yǎng)14d。將能夠產(chǎn)生凝膠狀物質(zhì)的菌株留用。