本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株，特別是涉及分泌抗牛干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)單抗的雜交瘤細(xì)胞株、其分泌的單克隆抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon-inducible protein-10，IP-10)是抗原提呈細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子刺激后分泌的趨化因子，屬于CXC趨化因子家族。IP-10是Luster等在1985年從活化U937細(xì)胞株的基因表達(dá)譜中篩選出來的一種細(xì)胞因子。IP-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、同種異體移植排斥反應(yīng)、腫瘤、慢性炎癥等疾病中可選擇性地募集T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞到損傷部位，發(fā)揮重要的宿主免疫防護(hù)作用。新近的研究顯示IP-10表達(dá)水平的改變與感染性疾病，包括炎癥性疾病、免疫功能異常與腫瘤的發(fā)展等相關(guān)。IP-10在牛結(jié)核等感染性疾病的診斷中作為重要的生物標(biāo)志物，其效果也常與γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)相比較。有研究表明聯(lián)合檢測(cè)IFN-γ和IP-10能提高牛結(jié)核診斷的敏感性。

IP-10的免疫學(xué)檢測(cè)是在特異性抗IP-10單克隆抗體(MAb)的基礎(chǔ)上建立的用于對(duì)樣本中的IP-10進(jìn)行定性定量分析的實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)用不同的單抗標(biāo)記物和檢測(cè)技術(shù)，可建立多種檢測(cè)方法，如酶免疫分析法(EIA)，酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，簡(jiǎn)稱ELISA)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(Enzyme-linked Immunospot，簡(jiǎn)稱ELISPOT)，流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，簡(jiǎn)稱FCM)分析法等。

IP-10的FCM具有高度的敏感性和應(yīng)用廣泛性。作為細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，IP-10的FCM檢測(cè)方法將被廣泛地用于研究基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)、疫苗免疫效果評(píng)估、器官移植、過敏反應(yīng)以及多種病原感染的診斷等。

但是，現(xiàn)有技術(shù)中制備的抗牛IP-10(BoIP-10)抗體，在應(yīng)用于上述檢測(cè)方法時(shí)往往遇到很大問題，特別是當(dāng)用于檢測(cè)天然牛IP-10時(shí)效果不佳。因此，獲得一種可用于臨床檢測(cè)的，效價(jià)高、特異性好、與天然牛IP-10有抗原親和力的牛IP-10單抗，對(duì)牛機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)及感染性疾病診斷相關(guān)的研究具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種分泌牛IP-10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，以及該雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體在免疫檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗牛IP-10的單克隆抗體效價(jià)高，其能與牛IP-10的高親合力地特異結(jié)合，其作為診斷試劑檢測(cè)牛IP-10，具有相當(dāng)?shù)撵`敏度和特異性。

本發(fā)明第一方面涉及一種分泌牛IP-10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中，所述雜交瘤細(xì)胞株為雜交瘤細(xì)胞株2D5或其傳代細(xì)胞株。

本發(fā)明第二方面涉及一種牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5，其由所述上述雜交瘤細(xì)胞株2D5或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。

本發(fā)明第三方面涉及一種天然牛IP-10的阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，所述阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒包括支持介質(zhì)、抗原和檢測(cè)抗體，其中，所述抗原為牛IP10蛋白，所述檢測(cè)抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的所述牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5；所述抗原包被在支持介質(zhì)中或所述抗原與支持介質(zhì)分別放置。

本發(fā)明第四方面涉及提供了一種牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒，所述Western-Blot檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)抗體、酶標(biāo)二抗，其中，所述檢測(cè)抗體為所述牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5。

本發(fā)明第五方面涉及一種牛IP-10的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)試劑盒，所述間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)抗體、熒光二抗，其中，所述檢測(cè)抗體為所述牛IP-10單克隆抗體MAb2D5。

本發(fā)明第六方面涉及一種牛IP-10的FCM檢測(cè)試劑盒，所述FCM檢測(cè)試劑盒包括標(biāo)記抗體、檢測(cè)抗體，其中，所述檢測(cè)抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的所述牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5。

本發(fā)明第七方面涉及所述雜交瘤細(xì)胞株2D5或其傳代細(xì)胞株、所述牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5、所述含有牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5的試劑盒在用于非診斷目的的檢測(cè)牛IP-10中的應(yīng)用，所述非診斷目的檢測(cè)包括重組表達(dá)牛IP-10的檢測(cè)、對(duì)離體組織進(jìn)行檢測(cè)、表位鑒定研究、進(jìn)出口檢疫檢驗(yàn)、流行病學(xué)研究。

本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體具有效價(jià)很高、特異性好、與天然抗原結(jié)合的親和力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，可用于檢測(cè)天然牛IP-10。

基于此建立的阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，可以有效檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品和?？鼓獫{中分泌天然牛IP-10，具有較好的靈敏度和特異性。

基于此建立的Western-Blot檢測(cè)試劑盒，可以有效檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的牛IP-10蛋白和牛外周血單核細(xì)胞分泌的天然牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

基于此建立的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)試劑盒，可以有效檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品和真核質(zhì)粒表達(dá)分泌牛IP-10，具有較好的靈敏度和特異性。

同時(shí)，基于此建立的牛IP-10FCM檢測(cè)試劑盒，在檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品時(shí)，可以檢測(cè)出較高水平的分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞，具有較好的靈敏度和特異性。

采用本發(fā)明的試劑盒操作簡(jiǎn)便，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間，可以廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究，用作牛機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)及感染性疾病診斷相關(guān)的研究、以及非診斷目的的牛IP-10的檢測(cè)。

附圖說明

圖1為單克隆抗體阻斷ELISA抑制率曲線圖。

圖2為本發(fā)明Western-Blot方法的牛IP-10蛋白檢測(cè)結(jié)果圖：A.重組GST-BoIP10蛋白檢測(cè)結(jié)果，B.重組His-BoIP10蛋白檢測(cè)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明間接免疫熒光(IFA)方法的牛外周血單核細(xì)胞樣品檢測(cè)結(jié)果圖：A.未刺激牛外周血單核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，B.ConA刺激牛外周血單核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。

圖4為本發(fā)明FCM試劑盒的牛外周血單核細(xì)胞樣品檢測(cè)結(jié)果圖：A.未刺激牛外周血單核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，B.ConA刺激牛外周血單核細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。

本發(fā)明的目的是提供一種分泌牛IP-10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，以及該雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體在免疫檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明一方面涉及一種分泌牛IP-10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中，所述雜交瘤細(xì)胞株為雜交瘤細(xì)胞株2D5或其傳代細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株2D5保藏號(hào)為CCTCC NO:C2016122；保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏日期為2016年6月7日。

本發(fā)明第二方面涉及一種本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞株2D5或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的牛IP-10單克隆抗體MAb2D5。本發(fā)明的牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5具有很高的效價(jià)，效價(jià)達(dá)1：6553600。

本發(fā)明第三方面涉及一種天然牛IP-10的阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，所述牛IP-10的阻斷ELISA檢測(cè)試阻斷ELISA方法包括支持介質(zhì)、抗原和檢測(cè)抗體，其中，所述抗原為牛IP10蛋白，所述檢測(cè)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的牛IP-10單克隆抗體MAb2D5；所述抗原包被在支持介質(zhì)中或所述抗原與支持介質(zhì)分別放置。

所述牛IP10蛋白為重組牛IP10蛋白或提取的源自動(dòng)物體內(nèi)的牛IP10蛋白。

所述支持介質(zhì)可以為酶標(biāo)板。

所述酶標(biāo)板可以事先包被有抗原，也可以只提供空白酶標(biāo)板與抗原，在檢測(cè)前由操作者自行采用常規(guī)方法在酶標(biāo)板上包被抗原。

所述酶標(biāo)板可為各種常見規(guī)格的酶標(biāo)板，如96孔酶標(biāo)板。

進(jìn)一步的，所述牛IP-10的阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒中還包括下列試劑中的一種或多種：

1)底物液；

2)洗滌液。

上述試劑均為ELISA檢測(cè)中的通用試劑，不受具體檢測(cè)項(xiàng)目的限制，因此即可根據(jù)需要有選擇地加入，也可由操作者自行配置或者單獨(dú)購(gòu)買。

為方便操作者，最優(yōu)的選擇是試劑盒中同時(shí)包括底物液和洗滌液。

所述底物液可為ELISA檢測(cè)方法中常用的通用底物液，如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物液。

所述洗滌液可為ELISA檢測(cè)方法中常用的洗滌液，如磷酸鹽緩沖液等。可以根據(jù)需要選用濃縮或未濃縮的洗滌液。

進(jìn)一步的，所述試劑盒中還可以有選擇地包括其他ELISA檢測(cè)所需通用試劑，如封閉液、磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽吐溫緩沖液等。

所述封閉液可為包被酶標(biāo)板常用的封閉液，如FBS、BSA等。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用上述牛IP-10阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)牛IP-10含量，從而進(jìn)行機(jī)體免疫狀態(tài)評(píng)價(jià)和其他非診斷目的的用途。

本發(fā)明的阻斷ELISA檢測(cè)方法可用于分析牛外周血單核細(xì)胞樣品。

利用本發(fā)明的阻斷ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1.抗原包被

①96孔酶標(biāo)板中加入2μg/mL的牛IP-10，100μL/孔，4℃過夜包被；

②棄包被液，使用含有0.05％吐溫的PBST洗板3次，5min/次；

③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封閉2h；

④棄封閉液，使用PBST洗板3次，將96孔酶標(biāo)板直接用于檢測(cè)，或放于密封袋中，置4℃保存，1周內(nèi)使用。

2.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL待測(cè)牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取外周血單核細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次，得到沉淀細(xì)胞；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL。

3.細(xì)胞孵育及檢測(cè)

①在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入下列試劑：500μL培養(yǎng)液至每個(gè)對(duì)照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每個(gè)陽(yáng)性孔。每孔加入500μL稀釋的細(xì)胞懸液，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，吸取上清作為檢測(cè)樣品；

②將HRP標(biāo)記MAb 2D5倍比稀釋，分別與血漿上清1：1混合，37℃孵育2h；

③將HRP標(biāo)記MAb 2D5、HRP標(biāo)記MAb 2D5與血漿的混合物分別加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗滌6次，每次5min，加入TMB顯色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，50μL/孔，測(cè)定OD450值。根據(jù)OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判斷陽(yáng)性，抑制率計(jì)算公式為：抑制率＝(OD未刺激組-OD刺激組)/OD未刺激組×100％。

結(jié)果顯示表明該方法可以有效檢測(cè)出ConA刺激牛外周血中T淋巴細(xì)胞分泌的牛IP-10，具有較好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明的阻斷ELISA檢測(cè)方法還可用于分析?？鼓獫{樣品。

利用本發(fā)明的阻斷ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)牛抗凝血漿樣品的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1.抗原包被

同使用阻斷ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品的檢測(cè)方法中步驟1.抗原包被。

2.全血孵育及檢測(cè)

①無菌采取待測(cè)牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血，將血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至終濃度為10μg/mL，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，吸取血漿作為檢測(cè)樣品；

②將HRP標(biāo)記MAb 2D5倍比稀釋，分別與血漿上清1：1混合，37℃孵育2h；

③將HRP標(biāo)記MAb 2D5、HRP標(biāo)記MAb 2D5與血漿混合物分別加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗滌6次，每次5min，加入TMB顯色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，50μL/孔，測(cè)定OD450值。根據(jù)OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判斷陽(yáng)性，抑制率計(jì)算公式為：抑制率＝(OD未刺激組-OD刺激組)/OD未刺激組×100％。

該方法可以有效檢測(cè)出ConA刺激?？鼓獫{中的牛IP-10，具有較好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明第四方面涉及一種牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒，所述牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)抗體、酶標(biāo)二抗，其中，所述檢測(cè)抗體為牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5；優(yōu)選地，酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG；

更優(yōu)選地，所述Western-Blot檢測(cè)試劑盒還可以包括下列試劑：

1)封閉液；

2)底物液；

3)洗滌液。本發(fā)明的牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒可用于分析牛IP-10蛋白。

利用本發(fā)明的牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛IP-10蛋白的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1.SDS-PAGE電泳

將純化蛋白rHis-BoIP-10、rGST-BoIP-10分別加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2.轉(zhuǎn)印

電泳結(jié)束后，將凝膠置于轉(zhuǎn)印Buffer中浸泡5min，同時(shí)將NC膜和濾紙同樣浸泡，按照從下到上的順序，2張濾紙-NC膜-凝膠-2張濾紙鋪好后轉(zhuǎn)至半干轉(zhuǎn)印儀中，注意排去氣泡。在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系統(tǒng)中以0.8mA/cm2轉(zhuǎn)印2h。

3.檢測(cè)

①用含5％脫脂奶的PBS封閉，室溫?fù)u晃封閉過夜；

②用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；

③加入用PBS 1:1000稀釋的腹水，室溫振蕩作用2h；

④用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；

⑤加入用PBS 1:5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，室溫振蕩作用1h；

⑥用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；顯色，自來水終止反應(yīng)，掃描儀拍照反應(yīng)結(jié)果。

本發(fā)明牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒可以有效檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明的牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒可用于分析牛外周血單核細(xì)胞樣品。

利用本發(fā)明的牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL待測(cè)牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次，得到沉淀細(xì)胞；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL。

2.細(xì)胞孵育

①在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入下列試劑：500μL培養(yǎng)液至每個(gè)對(duì)照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每個(gè)陽(yáng)性孔。每孔加入500μL稀釋的細(xì)胞懸液，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，收集細(xì)胞作為檢測(cè)樣品；

3.SDS-PAGE電泳

將細(xì)胞裂解液加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

4.轉(zhuǎn)印

同利用牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛IP-10蛋白的檢測(cè)方法中步驟2.轉(zhuǎn)印。

5.檢測(cè)

同利用牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛IP-10蛋白的檢測(cè)方法中步驟3.檢測(cè)。

利用本發(fā)明的牛IP-10的Western-Blot檢測(cè)試劑盒可以有效檢測(cè)牛外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的天然牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明第五方面涉及一種牛IP-10的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)試劑盒，所述間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)抗體、熒光二抗，所述檢測(cè)抗體為所述牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5；優(yōu)選地，熒光二抗為FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG；

更優(yōu)選地，所述試劑盒還可以包括下列試劑：

1)固定劑；

2)洗滌液。

本發(fā)明的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)方法可用于分析牛IP-10蛋白。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，以HEK293T細(xì)胞為表達(dá)宿主，利用本發(fā)明的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)方法檢測(cè)牛IP-10蛋白的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1.轉(zhuǎn)染

①轉(zhuǎn)染前24h，消化接種HEK293T細(xì)胞于24孔板中，2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔；

②加入1.5μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至總體積50μL；

③分別加入重組質(zhì)粒pVAX1-GFP-BoIP10和空載體質(zhì)粒pVAX1各1μg，以及P3000TM 2μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至總體積50μL；

④分別加入含Opti-MEM 50μL，靜置5min后，分別加入細(xì)胞板孔中，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.細(xì)胞因子檢測(cè)

①吸去HEK293T(pVAX1-GFP-BoIP10)和HEK293T(pVAX1)細(xì)胞的培養(yǎng)上清，使用500μL PBS洗2次，加入500μL-20℃預(yù)冷的冰甲醇于-20℃固定10min；

②用500μLPBS洗3次，加入1:1000稀釋的MAb 2D5，置37℃水浴鍋孵育2h；

③使用500μL PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用PBS稀釋至1:500的工作濃度，置37℃水浴1h；

④用500μL PBS洗3次，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

本發(fā)明的間接免疫熒光(IFA)方法可以有效檢測(cè)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)方法可用于分析牛外周血單核細(xì)胞樣品。

利用本發(fā)明的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)方法檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL待測(cè)牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×107個(gè)細(xì)胞/mL。

2.細(xì)胞因子檢測(cè)

同利用間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)方法檢測(cè)牛IP-10蛋白的檢測(cè)方法的步驟2.細(xì)胞因子檢測(cè)。

在檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品時(shí)，陽(yáng)性樣品孔(B)有明顯綠色熒光，而對(duì)照樣品孔(A)中沒有綠色熒光，這表明該試劑盒可以有效檢測(cè)出ConA刺激牛外周血中分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞，具有較好的靈敏度和特異性。

本發(fā)明第六方面涉及牛IP-10的FCM檢測(cè)試劑盒，所述FCM檢測(cè)試劑盒包括標(biāo)記抗體、檢測(cè)抗體，

其中，所述檢測(cè)抗體為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的所述牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5。

優(yōu)選地，所述標(biāo)記抗體為別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記針對(duì)牛CD4單抗。

更優(yōu)選地，所述FCM檢測(cè)試劑盒中還可以包括下列試劑的一種或多種：

1)阻斷劑布雷菲德菌素(Brefeldin，BFA)；

2)固定劑、破膜劑；以及

3)洗滌液。

上述試劑均為FCM檢測(cè)中的通用試劑，不受具體檢測(cè)項(xiàng)目的限制，因此即可根據(jù)需要有選擇地加入試劑盒，也可由操作者自行配置或者單獨(dú)購(gòu)買。為方便操作者，最優(yōu)的選擇是試劑盒中同時(shí)包括阻斷劑BFA、APC標(biāo)記針對(duì)牛CD4單抗、固定劑、破膜劑和洗滌液。

所述洗滌液可為FCM檢測(cè)試劑盒中常用的洗滌液，如含1％BSA的磷酸鹽緩沖液等?？梢愿鶕?jù)需要選用濃縮或未濃縮的洗滌液。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述試劑盒中還可以有選擇地包括其他FCM檢測(cè)所需通用試劑，如細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液等。

通常情況下，本發(fā)明的試劑盒中，各試劑分別隔離儲(chǔ)存。

本發(fā)明進(jìn)一步基于上述牛IP-10FCM檢測(cè)試劑盒，建立了具有較好特異性和靈敏度的牛IP-10的FCM檢測(cè)方法，用于檢測(cè)分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞，從而進(jìn)行機(jī)體免疫狀態(tài)評(píng)價(jià)及疾病診斷方面的研究。

本發(fā)明的FCM檢測(cè)試劑盒可用于分析牛外周血單核細(xì)胞樣品。

利用本發(fā)明的FCM檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品的檢測(cè)方法包括下列步驟：

1)制備牛外周血單核細(xì)胞懸液；

2)細(xì)胞孵育：

①在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入下列試劑：50μL培養(yǎng)液至每個(gè)對(duì)照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每個(gè)陽(yáng)性孔。每孔加入50μL牛外周血單核細(xì)胞懸液，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時(shí)；

②加入細(xì)胞因子分泌阻斷劑BFA，再放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時(shí)。

3)細(xì)胞因子檢測(cè)：

①次日收集培養(yǎng)細(xì)胞，使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，于4℃2000rpm離心10min，棄上清；

②使用1％BSA的PBS溶液將針對(duì)牛CD4分子單抗稀釋至0.5μg/mL，室溫避光染色20min，使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，于4℃2000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)兩次；

③加固定劑，室溫靜置作用15min；用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞；于4℃2000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)兩次；

④使用破膜劑稀釋FITC標(biāo)記特異性針對(duì)牛IP-10單抗MAb2D5至0.5μg/mL，室溫作用20min，使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，于4℃2000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)兩次；

⑤使用200μL PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行FACS檢測(cè)分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞比例。

上述方法通過密度梯度離心分離牛外周血單核細(xì)胞，以經(jīng)刀豆蛋白A刺激的牛外周血單核細(xì)胞為陽(yáng)性樣品，以未經(jīng)刺激的牛外周血單核細(xì)胞為對(duì)照樣品，以異硫氰酸熒光素標(biāo)記的MAb 2D5為檢測(cè)抗體，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示，該方法可以有效檢測(cè)出分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞比例。

本發(fā)明第七方面涉及本發(fā)明所述分泌牛IP-10單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2D5或其傳代細(xì)胞株，或所述的牛IP-10單克隆抗體MAb 2D5在制備牛機(jī)體免疫狀態(tài)的檢測(cè)試劑或診斷試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明第八方面提供了本發(fā)明上述試劑盒在用于非診斷目的檢測(cè)牛IP-10中的應(yīng)用，所述非診斷目的檢測(cè)包括重組表達(dá)牛IP-10的檢測(cè)、對(duì)離體組織進(jìn)行檢測(cè)、表位鑒定研究、進(jìn)出口檢疫檢驗(yàn)、流行病學(xué)研究。

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株的獲得

保藏號(hào)為CCTCC NO：C2016122的雜交瘤細(xì)胞株獲得。

1.動(dòng)物免疫

具體免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多點(diǎn)注射100μg經(jīng)弗氏完全佐劑充分乳化的牛IP-10純化蛋白，2周后腹部皮下多點(diǎn)注射100μg經(jīng)弗氏不完全佐劑充分乳化的純化蛋白進(jìn)行二次免疫，間隔2周后腹腔注射100μg不加佐劑的純化蛋白進(jìn)行第三次免疫，7天后采血測(cè)定血清抗體效價(jià)，選取效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫100μg不加佐劑的純化蛋白。

2.細(xì)胞融合

具體步驟如下：尾靜脈加強(qiáng)免疫3天后，采集少量血液，分離血清-20℃凍存，作為篩選時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照。按生物安全方法處死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，無菌取脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在PEG(MW4000)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，融合好的細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝96孔板，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后加入新鮮HAT培養(yǎng)基，10天后改用HT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察，換液和檢測(cè)。

3.間接ELISA檢測(cè)方法的建立

采用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆。方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)抗原的包被濃度。

檢測(cè)抗原用包被緩沖液橫向梯度稀釋，每孔100μL包被ELISA板，4℃過夜；PBST洗滌3次，每孔加入200μL封閉液，4℃過夜；免疫鼠血清縱向倍比稀釋，每孔100μL，正常小鼠血清同樣倍數(shù)稀釋作為陰性對(duì)照，37℃孵育2h；用PBST洗滌3次，加入工作濃度的酶標(biāo)二抗，每孔100μL，37℃孵育1.5h；PBST洗滌后，TMB顯色，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定OD450的值，判定檢測(cè)抗原的最佳包被濃度。

根據(jù)方陣試驗(yàn)確定的檢測(cè)抗原的包被濃度，將稀釋后的檢測(cè)抗原100μL/孔加入酶標(biāo)板中，4℃過夜，PBST洗液洗滌3次，5min/次，用含10％小牛血清的PBST洗液4℃封閉過夜，洗滌，-20℃保存，用于篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆。

4.篩選陽(yáng)性克隆

采用建立好的間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的情況。具體方法如下：將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入預(yù)先以步驟3中確定的最佳包被濃度包被好的ELISA板中，100μL/孔，以SP2/0細(xì)胞上清作為陰性對(duì)照，免疫鼠多抗血清作為陽(yáng)性對(duì)照，37℃水浴2h；PBST洗滌3次；加入工作濃度的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃水浴1.5h；洗滌后，TMB顯色10～15min，顯色終止后酶標(biāo)儀測(cè)定OD450讀數(shù)。被測(cè)孔OD450讀數(shù)大于陰性對(duì)照兩倍以上判定為陽(yáng)性。將篩選到的陽(yáng)性克隆命名為2D5。

5.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化

采用有限稀釋法對(duì)篩選到的陽(yáng)性細(xì)胞克隆2D5進(jìn)行2～3次的亞克隆并進(jìn)行保藏。陽(yáng)性細(xì)胞克隆2D5對(duì)應(yīng)保藏號(hào)為CCTCC NO：C2016122的雜交瘤細(xì)胞株。

實(shí)施例2：牛IP-10單抗制備

1.腹水制備

采用體內(nèi)誘生腹水法，按常規(guī)方法進(jìn)行。10～12周齡健康BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3～0.5mL/只，7～10天后，分別腹腔接種經(jīng)PBS稀釋的培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞2D5，5×105個(gè)細(xì)胞/只；7天后收集腹水，離心去除沉淀，收集上清，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，分裝，-70℃保存。雜交瘤細(xì)胞株CCTCC NO：C2016122(對(duì)應(yīng)雜交瘤細(xì)胞2D5)分泌的單抗記為MAb 2D5。

2.抗體純化

將制備的MAb 2D5腹水使用Protein G親和層析方法進(jìn)行純化。

實(shí)施例3：?jiǎn)慰寺】贵w特性檢測(cè)

1.單抗亞類的鑒定

按單克隆抗體亞類試劑盒說明書進(jìn)行，采用抗原介導(dǎo)的ELISA法。在已包被的酶標(biāo)板內(nèi)分別加入細(xì)胞培養(yǎng)上清100μL/孔，37℃1h，PBST洗滌3次，每次5min；分別加入1:1000稀釋的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亞類抗體50μL/孔，37℃0.5h，每株單抗加每種亞類兩孔，PBST洗滌3次每次5min；加入1:5000稀釋的兔抗羊酶標(biāo)二抗50μL/孔，37℃15min，PBST洗滌3次；加TMB顯色液100μL/孔，37℃避光顯色10～15min，2M H₂SO₄ 50μL/孔終止反應(yīng)，以肉眼觀察顏色明顯高于其它孔者所加亞類抗體為單抗亞類。

結(jié)果顯示，單抗MAb 2D5亞類均為IgG2a。

2.單抗腹水效價(jià)的測(cè)定

使用包被緩沖液將檢測(cè)抗原稀釋至一定濃度，每孔100μL包被ELISA板，4℃過夜；PBST洗滌3次，每孔加入200μL封閉液，4℃過夜；將單抗腹水倍比稀釋，每孔100μL，同樣倍數(shù)稀釋SP2/0腹水作為陰性對(duì)照，37℃孵育2h；用PBST洗滌3次，加入工作濃度的酶標(biāo)二抗，每孔100μL，37℃孵育1.5h；PBST洗滌后，TMB顯色，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定OD450的值，以P/N值≥2.1為判定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定單抗腹水效價(jià)。

結(jié)果顯示，單抗MAb 2D5的效價(jià)為1：6553600。單抗MAb2D5的效價(jià)很高，顯示利用其制備診斷試劑能產(chǎn)生高的靈敏性。。

3.單抗特異性的鑒定

采用間接ELISA方法鑒定單抗的特異性。將相同濃度的rGST-BoIP-10、rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ、rHis-BoIL-2、rGST-BoIL-2包被過夜；次日，PBST洗滌3遍，每遍5min，盡量將液體拍干，2％BSA的PBS封閉2h；PBST洗滌3遍，每遍5min，盡量將液體拍干，加入各株雜交瘤細(xì)胞上清，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗滌6次，每次5min，將洗滌液盡量拍干，加入用1％BSA的PBS稀釋至工作濃度的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗滌6次，每次5min，將洗滌液盡量拍干，加入TMB顯色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H₂SO₄終止反應(yīng)，50μL/孔，測(cè)定OD450值。

在間接ELISA試驗(yàn)中，單抗MAb 2D5只與rGST-BoIP-10反應(yīng)，而不與原核表達(dá)的上述其它重組細(xì)胞因子反應(yīng)，說明本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體MAb 2D5與BoIP-10抗原蛋白具有較好的反應(yīng)性和親和力。

本實(shí)驗(yàn)確定了本發(fā)明制備的單克隆抗體MAb 2D5具有良好的特異性，僅能與牛IP-10特異性結(jié)合，顯示具有制備高特異診斷試劑的特性。

4.流式細(xì)胞術(shù)鑒定單抗與天然抗原的反應(yīng)性

無菌采取健康奶牛尾靜脈血5mL加入含肝素鈉的采血管中，將抗凝管上下顛倒混勻數(shù)次；在無菌超凈操作臺(tái)內(nèi)將抗凝血與滅菌PBS 1:1稀釋，再按1:1的比例將稀釋牛血沿著管壁緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，室溫2000rpm離心25min；管內(nèi)液體分成三層，在血清和淋巴細(xì)胞分離液之間有一層可見的外周血單個(gè)核細(xì)胞云霧狀層為淋巴細(xì)胞。用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞混勻后，室溫2000rpm離心10min，重復(fù)兩次；棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞加入24孔板中，并分為2組，一組加入ConA刺激劑，終濃度為10μg/mL，另一組不加ConA刺激，置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。刺激培養(yǎng)8h后，加入BFA阻斷；次日，2000rpm 10min離心，收集細(xì)胞；使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，2000rpm 10min，離心，棄上清；加固定劑，室溫靜置作用15min；用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞；2000rpm 10min離心，棄上清；在空白對(duì)照、加入ConA和未加入ConA刺激的三組中分別加入SP2/0腹水和單抗的腹水。用破膜劑稀釋SP2/0腹水和單抗腹水，2μL/樣；室溫作用20min；用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞；2000rpm 10min離心，棄上清；加入用含1％BSA的PBS稀釋至工作濃度的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG，室溫避光作用20min，用含1％BSA的PBS洗滌2次，2000rpm 10min離心，棄上清；使用200μL含1％BSA的PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行FACS檢測(cè)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ConA刺激劑和未刺激組之間存在一定的差異，表明MAb 2D5單抗可以識(shí)別牛天然IP-10，顯示其能作為診斷試劑應(yīng)用。

實(shí)施例4阻斷ELISA試劑盒的組裝：

阻斷ELISA試劑盒的組裝步驟如下：

1.制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的牛IP-10單克隆抗體(命名為HRP-MAb 2D5)：

稱取辣根過氧化物酶(HRP)2mg于5mL離心管，以0.5mL去離子水溶解，此時(shí)溶液顯紅棕色立即避光保存；加入0.5mL新鮮配制的0.06mol/L高碘酸鈉，此時(shí)溶液變青色，4℃避光作用30min；加入160mmol/L乙二醇0.5mL室溫作用30min；加入純化單克隆抗體2D5 2mg混勻，將混合液裝入透析袋在2L 0.05mo1/L碳酸鹽緩沖液中透析，4℃過夜；將透析液轉(zhuǎn)入離心管中，加入0.2mL新鮮配制的5mg/mL硼氫化鈉混勻，于4℃作用2h；加入等體積飽和硫酸銨4℃作用30min，以4000r/min離心20min棄上清，用PBS溶解沉淀4℃透析過夜，加等體積甘油，加入0.1％ProClin 300，0.45μm濾膜過濾，按110μL/支分裝，2～8℃保存。

2.將辣根過氧化物酶標(biāo)記的牛IP-10單克隆抗體，分別包裝組裝成試劑盒。

進(jìn)一步的，試劑盒中依據(jù)需要組裝入：包被抗原、封閉液、洗滌液、底物液、終止液的一種或多種。

實(shí)施例5牛外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品的阻斷ELISA檢測(cè)：

1.抗原包被

①96孔酶標(biāo)板中加入2μg/mL的牛IP-10，100μL/孔，4℃過夜包被；

②棄包被液，使用含有0.05％吐溫的PBST洗板3次，5min/次；

③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封閉2h；

④棄封閉液，使用PBST洗板3次，將96孔酶標(biāo)板直接用于檢測(cè)，或放于密封袋中，置4℃保存，1周內(nèi)使用。

2.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×107個(gè)細(xì)胞/mL。

3.細(xì)胞孵育及檢測(cè)

①在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入下列試劑：500μL培養(yǎng)液至每個(gè)對(duì)照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每個(gè)陽(yáng)性孔。每孔加入500μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，吸取上清作為檢測(cè)樣品；

②將HRP標(biāo)記MAb 2D5倍比稀釋，分別與血漿上清1：1混合，37℃孵育2h；

③將HRP標(biāo)記MAb 2D5、HRP標(biāo)記MAb 2D5與血漿混合物分別加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗滌6次，每次5min，加入TMB顯色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，50μL/孔，測(cè)定OD450值。根據(jù)OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判斷陽(yáng)性，抑制率計(jì)算公式為：抑制率＝(OD未刺激組-OD刺激組)/OD未刺激組×100％。

結(jié)果顯示表明該方法可以有效檢測(cè)出ConA刺激牛外周血中T淋巴細(xì)胞分泌的牛IP-10，具有較好的靈敏度和特異性。

實(shí)施例6?？鼓獫{樣品的阻斷ELISA檢測(cè)：

1.抗原包被

①96孔酶標(biāo)板中加入2μg/mL的牛IP-10，100μL/孔，4℃過夜包被；

②棄包被液，使用含有0.05％吐溫的PBST洗板3次，5min/次；

③加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育封閉2h；

④棄封閉液，使用PBST洗板3次，將96孔酶標(biāo)板直接用于檢測(cè)，或放于密封袋中，置4℃保存，1周內(nèi)使用。

2.全血孵育及檢測(cè)

①無菌采取牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血，將血液加入6孔板中，每孔加入刀豆蛋白A(ConA)至終濃度為10μg/mL，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，吸取血漿作為檢測(cè)樣品；

②將HRP標(biāo)記MAb 2D5倍比稀釋，分別與血漿上清1：1混合，37℃孵育2h；

③將HRP標(biāo)記MAb 2D5、HRP標(biāo)記MAb 2D5與血漿混合物分別加入牛IP-10包被ELISA板中，100μL/孔，37℃孵育2h；

④PBST洗滌6次，每次5min，加入TMB顯色液，100μL/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，50μL/孔，測(cè)定OD450值。根據(jù)OD450值算出抑制率，抑制率大于50％判斷陽(yáng)性，抑制率計(jì)算公式為：抑制率＝(OD未刺激組-OD刺激組)/OD未刺激組×100％。

結(jié)果見圖1，從抗體量117.19ng至抗體量7.32ng的抑制率均高于50％，最高可達(dá)到85.05％，表明該方法可以有效檢測(cè)出ConA刺激?？鼓獫{中的牛IP-10，具有較好的靈敏度和特異性。當(dāng)抗體含量?jī)H為7.32ng時(shí)，其抑制率仍達(dá)～69.77％(>50％)，表明MAb 2D5單抗制備的阻斷ELISA檢測(cè)牛外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品具有相當(dāng)高的靈敏度。

實(shí)施例7Western-blot試劑盒的組裝：

Western-blot試劑盒的組裝步驟如下：

1.制備辣根過氧化物酶標(biāo)記的牛IP-10單克隆抗體(命名為HRP-MAb 2D5)：

稱取辣根過氧化物酶(HRP)2mg于5mL離心管，以0.5mL去離子水溶解，此時(shí)溶液顯紅棕色立即避光保存；加入0.5mL新鮮配制的0.06mol/L高碘酸鈉，此時(shí)溶液變青色，4℃避光作用30min；加入160mmol/L乙二醇0.5mL室溫作用30min；加入純化單克隆抗體2D5 2mg混勻，將混合液裝入透析袋在2L 0.05mo1/L碳酸鹽緩沖液中透析，4℃過夜；將透析液轉(zhuǎn)入離心管中，加入0.2mL新鮮配制的5mg/mL硼氫化鈉混勻，于4℃作用2h；加入等體積飽和硫酸銨4℃作用30min，以4000r/min離心20min棄上清，用PBS溶解沉淀4℃透析過夜，加等體積甘油，加入0.1％ProClin 300，0.45μm濾膜過濾，按110μL/支分裝，2～8℃保存。

2.將辣根過氧化物酶標(biāo)記牛IP-10單克隆抗體，分別包裝組裝成試劑盒。

進(jìn)一步的，試劑盒中依據(jù)需要組裝入：封閉液、洗滌液、底物液的一種或多種。

實(shí)施例8牛重組IP-10蛋白的Western-blot檢測(cè)：

1.SDS-PAGE電泳

將純化蛋白rHis-BoIP-10、rGST-BoIP-10分別加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2.轉(zhuǎn)印

電泳結(jié)束后，將凝膠置于轉(zhuǎn)印Buffer中浸泡5min，同時(shí)將NC膜和濾紙同樣浸泡，按照從下到上的順序，2張濾紙-NC膜-凝膠-2張濾紙鋪好后轉(zhuǎn)至半干轉(zhuǎn)印儀中，注意排去氣泡。在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系統(tǒng)中以0.8mA/cm²轉(zhuǎn)印2h。

3.檢測(cè)

①用含5％脫脂奶的PBS封閉，室溫?fù)u晃封閉過夜；

②用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；

③加入用PBS 1:1000稀釋的HRP-MAb 2D5，室溫振蕩作用2h；

④用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；顯色，自來水終止反應(yīng)，掃描儀拍照反應(yīng)結(jié)果。

結(jié)果見圖2，A部分示出重組GST-BoIP10的蛋白檢測(cè)結(jié)果，B部分示出重組His-BoIP10蛋白檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示W(wǎng)estern-blot方法可以有效檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

實(shí)施例9牛外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品的Western-blot檢測(cè)：

1.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL。

2.細(xì)胞孵育

①在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入下列試劑：500μL培養(yǎng)液至每個(gè)對(duì)照孔，500μL 10μg/mL的ConA至每個(gè)陽(yáng)性孔。每孔加入500μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，收集細(xì)胞作為檢測(cè)樣品；

3.SDS-PAGE電泳

將細(xì)胞裂解液加入5×SDS loading Buffer，100℃沸煮10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

4.轉(zhuǎn)印

電泳結(jié)束后，將凝膠置于轉(zhuǎn)印Buffer中浸泡5min，同時(shí)將NC膜和濾紙同樣浸泡，按照從下到上的順序，2張濾紙-NC膜-凝膠-2張濾紙鋪好后轉(zhuǎn)至半干轉(zhuǎn)印儀中，注意排去氣泡。在Bio-Rad semi-Dry transfer Cell系統(tǒng)中以0.8mA/cm²轉(zhuǎn)印2h。

5.檢測(cè)

①用含5％脫脂奶的PBS封閉，室溫?fù)u晃封閉過夜；

②用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；

③加入用PBS 1:1000稀釋的HRP-MAb 2D5，室溫振蕩作用2h；

④用PBST清洗膜，洗滌4次，每次10min，將膜上的殘留洗滌液盡量甩干；顯色，自來水終止反應(yīng)，掃描儀拍照反應(yīng)結(jié)果。

結(jié)果顯示W(wǎng)estern-blot方法可以有效檢測(cè)牛外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌的天然牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

實(shí)施例10間接免疫熒光(IFA)試劑盒的組裝：

FCM試劑盒的組裝步驟如下：

1.制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛IP-10單克隆抗體(命名為FITC-MAb 2D5)：

將純化MAb 2D5單抗采用標(biāo)準(zhǔn)異硫氰酸熒光素標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記。將待交聯(lián)單抗MAb 2D5(濃度≥1mg/ml)對(duì)交聯(lián)反應(yīng)液4℃透析三次，至pH為9.0；將新鮮配制的FITC(濃度為1mg/mL)溶于DMSO中；按P：F(蛋白質(zhì)：FITC)＝1mg：150μg的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻，避光4℃反應(yīng)8h；加入5mol/L的NH₄Cl至終濃度50mmol/L，4℃終止反應(yīng)2h；將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮；進(jìn)行交聯(lián)物蛋白濃度、F/P比例的鑒定；FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1％NaN₃、1％BSA，4℃避光保存。

2.將異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛IP-10單克隆抗體，分別包裝組裝成試劑盒。

進(jìn)一步的，試劑盒中依據(jù)需要組裝入：阻斷劑BFA、APC標(biāo)記針對(duì)牛CD4分子單抗、固定劑、破膜劑、細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。

實(shí)施例11牛IP-10蛋白的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)：

1.轉(zhuǎn)染

①轉(zhuǎn)染前24h，消化接種HEK293T細(xì)胞于24孔板中，2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔；

②加入1.5μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至總體積50μL；

③分別加入重組質(zhì)粒pVAX1-GFP-BoIP10和空載體質(zhì)粒pVAX1各1μg，以及P3000TM 2μL至含Opti-MEM的1.5mL指形管中至總體積50μL；

④分別加入含Opti-MEM 50μL，靜置5min后，分別加入細(xì)胞板孔中，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.細(xì)胞因子檢測(cè)

①吸去細(xì)胞的培養(yǎng)上清，使用500μLPBS洗2次，加入500μL-20℃預(yù)冷的冰甲醇于-20℃固定10min；

②用500μL PBS洗3次，加入1:1000稀釋的MAb 2D5單抗，置37℃水浴鍋孵育2h；

③使用500μL PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用PBS稀釋至1:500的工作濃度，置37℃水浴1h；

④用500μL PBS洗3次，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果顯示間接免疫熒光(IFA)方法可以有效檢測(cè)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的牛IP-10蛋白，具有較好的靈敏度和特異性。

實(shí)施例12牛外周血單核細(xì)胞樣品的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)：

1.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL。

3.細(xì)胞因子檢測(cè)

①吸去細(xì)胞的培養(yǎng)上清，使用500μL PBS洗2次，加入500μL-20℃預(yù)冷的冰甲醇于-20℃固定10min；

②用500μL PBS洗3次，加入1:1000稀釋的MAb 2D5，置37℃水浴鍋孵育2h；

③使用500μL PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用PBS稀釋至1:500的工作濃度，置37℃水浴1h；

④用500μL PBS洗3次，使用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示在檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品時(shí)，陽(yáng)性樣品孔(B)有明顯綠色熒光，而對(duì)照樣品孔(A)中沒有綠色熒光，這表明該試劑盒可以有效檢測(cè)出ConA刺激牛外周血中分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞，具有較好的靈敏度和特異性。

實(shí)施例13FCM試劑盒的組裝

FCM試劑盒的組裝步驟如下：

1.制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛IP-10單克隆抗體(命名為FITC-MAb 2D5)：

將純化MAb 2D5單抗采用標(biāo)準(zhǔn)異硫氰酸熒光素標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記。將待交聯(lián)單抗MAb 2D5(濃度≥1mg/mL)對(duì)交聯(lián)反應(yīng)液4℃透析三次，至pH為9.0；將新鮮配制的FITC(濃度為1mg/mL)溶于DMSO中；按P：F(蛋白質(zhì)：FITC)＝1mg：150μg的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻，避光4℃反應(yīng)8h；加入5mol/L的NH₄Cl至終濃度50mmol/L，4℃終止反應(yīng)2h；將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮；進(jìn)行交聯(lián)物蛋白濃度、F/P比例的鑒定；FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1％NaN₃、1％BSA，4℃避光保存。

2.將異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛IP-10單克隆抗體，分別包裝組裝成試劑盒。

進(jìn)一步的，試劑盒中依據(jù)需要組裝入：阻斷劑BFA、APC標(biāo)記針對(duì)牛CD4分子單抗、固定劑、破膜劑、細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。

實(shí)施例14牛外周血單核細(xì)胞樣品的FCM檢測(cè)

1.制備牛外周血單核細(xì)胞

①無菌采取5mL牛血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血；

②將抗凝血與滅菌PBS 1：1稀釋后，再按1：1的比例將稀釋牛血緩緩加入含牛淋巴細(xì)胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000rpm離心20-30min；

③可見外周血單核細(xì)胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細(xì)胞層至一干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細(xì)胞混勻后，于4℃2000rpm離心10min，重復(fù)兩次；

④棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，取10μL細(xì)胞懸液加入10μL臺(tái)酚藍(lán)混勻后加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并使用完全1640培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL。

2.細(xì)胞孵育

①在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入下列試劑：50μL培養(yǎng)液至每個(gè)對(duì)照孔，50μL 10μg/mL的ConA至每個(gè)陽(yáng)性孔。每孔加入50μL細(xì)胞懸液，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)5小時(shí)；

②加入細(xì)胞因子分泌阻斷劑BFA，再放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時(shí)。

3.細(xì)胞因子檢測(cè)

①次日收集細(xì)胞，使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，于4℃2000rpm離心10min，棄上清；

②使用1％BSA的PBS溶液將APC標(biāo)記針對(duì)牛CD4分子單抗稀釋至0.5μg/mL，室溫避光染色20min，使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，于4℃2000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)兩次；

③加固定劑，室溫靜置作用15min；用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞；于4℃2000rpm離心10min離心，棄上清，重復(fù)兩次；

④使用破膜劑稀釋特異性針對(duì)牛IL-2分子單抗FITC-MAb2D5至0.5μg/mL，室溫作用20min，使用含1％BSA的PBS洗滌細(xì)胞，于4℃2000rpm離心10min離心，棄上清，重復(fù)兩次；

⑤使用200μL PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分離法(FACS)檢測(cè)分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞比例。

結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示在檢測(cè)牛外周血單核細(xì)胞樣品時(shí)，陽(yáng)性樣品孔B中分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞比例(14.21％)顯著高于對(duì)照樣品孔A(1.13％)，這表明該試劑盒可以有效檢測(cè)出ConA刺激牛外周血中分泌牛IP-10的T淋巴細(xì)胞，具有較好的靈敏度和特異性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。